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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201510903368.3 (22)申请日 2015.12.09 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 105441544 A (43)申请公布日 2016.03.30 (73)专利权人 武汉市蔬菜科学研究所 地址 430345 湖北省武汉市黄陂区武湖农 业生态园武汉市蔬菜科学研究所 (72)发明人 李霞周国林汪爱华胡侦华 黄兴学王斌才邓耀华张润花 (74)专利代理机构 武汉开元知识产权代理有限 公司 42104 代理人 樊戎冯超 (51)Int.Cl. C12Q 1。
2、/6895(2018.01) (56)对比文件 CN 101886132 A,2010.11.17, CN 1936021 A,2007.03.28, WO 2013080045 A3,2013.08.01, CN 103966335 A,2014.08.06, 张慧. “大白菜细胞核雄性不育基因的分子 标记及定位” . 中国博士学位论文全文数据库 农业科技辑 .2010, (第10期),D048-2. 李霞. “人工合成甘蓝型黄籽油菜粒色基因 的精细定位” . 中国优秀硕士学位论文全文数据 库 农业科技辑 .2012, (第3期),D047-125. 审查员 郭玉洁 (54)发明名称 利用S。
3、NP和SSR技术共同筛选不结球白菜隐 性核不育系育性相关分子标记的方法及应用 (57)摘要 本发明一种利用SNP芯片技术及SSR标记技 术共同筛选不结球白菜隐性核不育系育性相关 分子标记的方法及应用。 以矮脚黄A不育系与贺B 矮杂交获得F2代分离群体为研究对象， 通过SNP 芯片技术转化获得系列与育性连锁的可电泳检 测的SNP标记， 并由芯片SNP标记信息开发与育性 基因连锁的SSR分子标记。 获得的SSR分子标记可 以快速鉴定出不育系转育后代群体内单株基因 型， 为不育系的快速选育及后期杂交制种提供便 利， 同时为不结球白菜隐性细胞核雄性不育相关 基因的精细定位和克隆奠定基础。 权利要求书9。
4、页 说明书18页 序列表29页 附图1页 CN 105441544 B 2019.01.25 CN 105441544 B 1.一种利用SNP和SSR技术共同筛选不结球白菜隐性核不育系育性相关分子标记的方 法， 其特征在于： 包括以下步骤： 1)对F2代分离群体中各单株编号挂牌， 在F2群体内选取30个不育单株和30个可育单 株， 利用试剂盒分单株提取样品DNA， 每10份单株样品DNA等量混合， 分别混合得到三个不育 集团池和三个可育集团池； 2)将上述六个集团池DNA分别与Illumina 60K BrassicanapusSNP芯片杂交， 然后对芯 片进行清洗、 染色和扫描， 收集扫描的。
5、SNP数据； 3)将SNP数据通过GenomeStudio Software软件进行数据分析， 三个不育集团池与三个 可育集团池芯片数据分析评估后共获得73个SNP差异位点， 将获得的SNP差异位点序列提交 白菜基因组数据库比对分析后显示， 上述差异位点分布于白菜A2连锁群的共计56个， A5、 A3、 A9、 A8连锁群各一个； 其中， 基因分型后， 不育材料基因型为 “AA/BB” 对可育材料基因型 “AB” 为差异， 或不育材料缺失 “NC” 对可育材料 “AA/BB” 为差异， 共计四种差异类型； 4)根据上述分布于A2连锁群上的SNP差异位点序列为模板设计17对AS-PCR引物； 其。
6、中， 17对AS-PCR引物序列为： 权利要求书 1/9 页 2 CN 105441544 B 2 5)以三个可育集团池和三个不育集团池为模板， 用17对AS-PCR引物分别进行PCR， 共获 得6个差异标记， 分别命名为LX4、 LX5、 LX7、 LX8、 LX11、 LX12-1； 其中， 扩增6个标记引物序列分别为： LX4:5 -GCCTCGAAAAAATTAAGCTAGGTA-3 /5 -GCCTCGAAAAAATTAAGCTAGGTA-3 ， LX5:5 -AAGTATATACTGGCTTCCCTTCCCCC-3 /5 -CTTTGCACTGGATGGCTCAGAAGAGG-3 。
7、， LX7:5 -ACTGGTCGAGCTGTTTCTGCTGAAA-3 /5 -TGACGTGGATTATTGGTTTGATTCCG-3 ， 权利要求书 2/9 页 3 CN 105441544 B 3 LX8:5 -TTATGTTTTGTACTGCAAGGAACGCG-3 /5 -CGATGGCTGGAGGCAAGGGTC-3 ， LX11:5 -TTGATCCGGTTACCATAGAGTTCG-3 /5 -GGGTTTGGTGTTTGGGGTGTTTG-3 ， LX12-1:5 -CATCGTTGTTGGTCCCGGAACTC-3 /5 -CATCGTTGTTGGTCCCGGAACTA-。
8、3 ； 6)将上述获得的6个差异标记序列与白菜基因组A2连锁群进行比对， 获得的相应区段 作为候选区段； 每个标记序列上下游各选取10K长度的序列， 作为引物设计提交序列； 设计 64对SSR引物； 以三个可育集团池和三个不育集团池为模板， 用64对SSR引物分别进行PCR， 6聚丙烯酰胺凝胶电泳检测， 共获得10个差异标记， 分别命名为： SSR 4-1， SSR 60-1， SSR 60-2， SSR 60-5， SSR 7-1， SSR 8-2， SSR 8-3， SSR 810-6， SSR 810-12； 其中， 64对SSR引物序 列分别为： 权利要求书 3/9 页 4 CN 10。
9、5441544 B 4 权利要求书 4/9 页 5 CN 105441544 B 5 权利要求书 5/9 页 6 CN 105441544 B 6 权利要求书 6/9 页 7 CN 105441544 B 7 权利要求书 7/9 页 8 CN 105441544 B 8 7)将上述标记进行F2代2623个单株的分离大群体验证： a.利用可育和不育表型差异， 在2623个单组成的F2代分离群体中， 花期表型鉴定挑选 出632株不育单株， 提取单株DNA， 利用SSR4-1， SSR 60-1， SSR 60-2， SSR 60-5， SSR 7-1， SSR 8-2， SSR 8-3， SSR 。
10、810-6， SSR 810-8， SSR810-12标记进行单株PCR扩增大群体检测； 其中， 扩增10个SSR标记引物序列分别为： SSR4-1:5 -AGTGTTTTGGTTTGCATCCAGT-3 /5 -AGGAGAATGTTGGTGAAATGCT-3 ， SSR60-1:5 -GACATTTGGCTTGATCCTTTTC-3 /5 -TGACTCGAAGTGAGTAGGACTAGGT-3 ， SSR60-2:5 -AGCTGTGATTGAACAGAAGACCT-3 /5 -CACCAAGGATAAACTCAAGGGA-3 ， SSR60-5:5 -CCTTAATGTTCGTCGTT。
11、TATGC-3 /5 -AAACCATATCCAAATCCTACGG-3 SSR7-1:5 -CAAAGAAACAAAACCGGAGAAG-3 /5 -CACAAGACAATAGGCGTGAGAG-3 SSR8-2:5 -GACCAAGCAAACTCACAAGTCA-3 /5 -GACCAACCCGAAACAAAATAAC-3 SSR8-3:5 -TATTGTTGCAGACGGATTTCAC-3 /5 -AAGAGTACGATGAAGAGGCGAC-3 SSR810-6:5 -TCTTGACGAATTACCGATGGAT-3 /5 -GTGCAGAGAGCTATTTTGAGTTGA-3 SSR。
12、810-8:5 -CAGTCCACGAAACTAACACCAA-3 /5 -ATCACACCTCAATTCTCTTGCC-3 SSR810-12:5 -TACCAAGGTTGTGATGATTTGC-3 /5 -CCAAGAAAGAAAAGGGGATCA-3 ； b.基于孟德尔和摩尔根遗传连锁和分离规律， 将上述10个SSR分子标记F2代群体单株 基因型数据以及单株育性性状统计数据， 运行MAPMAKER/EXP Version 3.0软件分析， 确定 其遗传距离； 结果表明:SSR60-1， SSR60-2， SSR8-2与目标基因遗传距离1cM， 分别为 0.79cM、 0.94cM、 0.。
13、63cM。 2.根据权利要求书1所述利用SNP和SSR技术共同筛选不结球白菜隐性核不育系育性相 关分子标记的方法， 其特征在于： 所述步骤7)中， 使用下述SSR引物分别进行PCR扩增 SSR60-1:5 -GACATTTGGCTTGATCCTTTTC-3 /5 -TGACTCGAAGTGAGTAGGACTAGGT-3 ， SSR60-2:5 -AGCTGTGATTGAACAGAAGACCT-3 /5 -CACCAAGGATAAACTCAAGGGA-3 ， SSR8-2:5 -GACCAAGCAAACTCACAAGTCA-3 /5 -GACCAACCCGAAACAAAATAAC-3 ； 扩增产。
14、物在6聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离后， 分别获得三个扩增产物片段， 片段大小 权利要求书 8/9 页 9 CN 105441544 B 9 分别为325bp、 288bp、 175bp。 权利要求书 9/9 页 10 CN 105441544 B 10 利用SNP和SSR技术共同筛选不结球白菜隐性核不育系育性相 关分子标记的方法及应用 技术领域 0001 本发明属于不结球白菜育种及生物技术领域， 具体涉及到一种利用SNP芯片技术 及SSR标记技术共同筛选不结球白菜隐性核不育系育性相关分子标记的方法及应用。 背景技术 0002 不结球白菜(Brassica campestrisssp.Chinens。
15、is Makino)， 又名小白菜、 青菜、 鸡毛菜， 在东亚地区栽培十分广泛， 是一种重要的叶菜类蔬菜。 不结球白菜属十字花科芸薹 属白菜亚种， 是典型的异花授粉作物， 杂种优势明显(邓晓辉， 2007)。 目前， 利用雄性不育系 制种是植物杂种优势利用的有效途径， 因此对白菜雄性不育系的选育及其应用研究深受育 种工作者的重视。 0003 国内外众多研究者开展了白菜分子标记的开发工作。 其中， Ying等(2003)利用BSA 法结合AFLP技术对大白菜隐性核雄性不育基因进行遗传连锁图谱分析， 找到了4个与恢复 基因紧密连锁的特异性片段， 并成功转换成STS标记。 沈向群和杨文俊(2004)。
16、筛选出一个与 大白菜核基因显性雄性不育育性恢复基因连锁的RAPD标记。 邓晓辉等(2007)利用RAPD技术 对不结球白菜pol系及其保持系基因组DNA的扩增图谱进行了比较， 获得了不育系的特异扩 增片段， 并转化为稳定的SCAR标记。 张淑江等(2008)对大白菜显性细胞核雄性不育系的不 育基因进行了RAPD标记并转化为SCAR标记。 Feng等(2009)找到了与复等位雄性不育基因相 连锁的SSR标记， 并定位在A7连锁群中。 利用分子标记技术寻找与雄性不育性状相关基因连 锁的标记， 为分子标记辅助育种打下良好的基础。 目前上 述研究者开发的与育性基因连锁 的分子标记已成功应用于分子标记辅。
17、助相应白菜雄性不育系选育中(王丽丽等， 2011)， 极 大降低了选育群体的数量， 缩短了选育年限， 实现了不育系的高效选育。 但已有研究成果主 要是在大白菜育种工作中加以利用， 针对小白菜隐性核不育材料的分子标记开发较少报 道。 0004 目前， 随着芯片及新一代高通量测序技术的推广应用， SNP检测和分析技术得到进 一步发展， SNP标记成为新一代遗传标记， 广泛应用于高密度遗传连锁图谱构建、 全基因组 关联分析及重要农艺性状基因定位与克隆工作中， 为分子标记辅助育种带来了前所未有的 机遇(Ganal et al.,2009)。 研究发现， 水稻每268bp就有1个SNP位点(Sheng 。
18、et al., 2004)； 玉米基因组编码区域每124bp有1个SNP位点， 非编码每31bp有1个SNP位点(Ching et al.,2002)； 甜菜基因组编码区域每72bp有1个SNP位点， 非编码每58bp有1个SNP位点 (Schneider et al.,2007)。 研究表明， 与传统分子标记相比， SNP标记可大大提高定位的精 度， 能够快速锁定目标基因区段， 提出候选基因， 更加有利于目标基因的克隆(Buckler et al.,2009； Kim et al.,2010； Yu et al.,2011； Poland et al.,2011)。 发明内容 0005 本发。
19、明所要解决的技术问题就是提供一种利用SNP芯片技术及SSR标记技术共同 说明书 1/18 页 11 CN 105441544 B 11 筛选不结球白菜隐性核不育系育性相关分子标记的方法及应用； 其通过获得的与矮脚黄A 育性基因紧密连锁的SSR标记来辅助优良不育系的选育。 0006 为了实现上述目的， 本发明提供了一种利用SNP芯片技术及SSR标记技术共同筛选 不结球白菜隐性核不育系育性相关分子标记的方法， 包括以下步骤： 0007 1)利用矮脚黄A不育系与贺B矮可育系为亲本杂交获得F1代杂种； 0008 2)F1代人工去雄授粉获得F2代分离群体； 0009 3)F2代群体中各单株编号挂牌， 选。
20、取30个不育单株和30个可育单株， 利用试剂盒 分单株提取样品DNA， 每10份单株样品DNA等量混合， 分别混合得到三个不育集团池和三个 可育集团池； 0010 4)将上述六个集团池样品DNA分别与芯片杂交， 然后对芯片进行清洗、 染色和扫 描， 收集扫描的SNP数据； 0011 5)将SNP数据经GenomeStudio软件分析， 三个不育集团池与三个可育集团池芯片 数据评估后共获得73个SNP差异位点， 将获得的SNP差异位点序列提交白菜基因组数据库比 对分析后显示， 上述差异位点分布于白菜A2连锁群的共计56个， A5、 A3、 A9、 A8连锁群各一 个； 其中， 基因分型后， 不育。
21、材料基因型为 “AA/BB” 对可育材料基因型 “AB” 为差异， 或不育材 料缺失 “NC” 对可育材料 “AA/BB” 为差异， 共计四种差异类型。 0012 6)根据分布于A2连锁群上的SNP差异位点序列设计17对AS-PCR引物。 以三个可育 集团池和三个不育集团池为模板， 用17对AS-PCR引物分别进行PCR， 共获得6个差异标记， 0013 7)将上述获得的6个差异标记序列与白菜基因组A2连锁群进行比对， 获得的相应 区段作为候选区段。 每个标记序列上下游各选取约10K长度的序列， 作为引物设计提交序 列； 设计64对SSR引物； 以三个可育集团池和三个不育集团池为模板， 用64。
22、对SSR引物分别进 行PCR， 6聚丙烯酰胺凝胶电泳检测， 获得10对差异标记分别为:SSR 4-1， SSR 60-1， SSR 60-2， SSR 60-5， SSR 7-1， SSR 8-2， SSR 8-3， SSR 810-6， SSR 810-12。 0014 8)将上述10个SSR标记进行F2代2623个单株的分离大群体验证： 0015 a.利用可育和不育表型差异， 在2623个单株组成的F2代分离群体中， 花期根据表 型鉴定挑选出632株不育单株， 提取单株DNA。 利用SSR4-1， SSR 60-1， SSR 60-2， SSR 60-5， SSR 7-1， SSR 8-2。
23、， SSR 8-3， SSR 810-6， SSR 810-8， SSR810-12标记进行大群体PCR扩增检 测。 0016 b.基于孟德尔和摩尔根遗传连锁和分离规律， 将上述10个SSR分子标记及6个SNP 差异标记的F2代群体单株基因型数据以及单株育性性状统计数据， 运行MAPMAKER/EXP Version 3.0软件分析， 确定其遗传距离。 结果表明： SSR60-1， SSR60-2， SSR8-2与目标基因 遗传距离1cM， 分别为0.79cM、 0.94cM、 0.63cM。 0017 进一步地， 所述步骤6)中， 17对AS-PCR引物序列分别为： 说明书 2/18 页 1。
24、2 CN 105441544 B 12 0018 说明书 3/18 页 13 CN 105441544 B 13 0019 0020 进一步地， 所述步骤6)中， 扩增6个标记引物序列为： 0021 LX4:5 -GCCTCGAAAAAATTAAGCTAGGTA-3 /5 -GCCTCGAAAAAATTAAGCTAGGTA-3 ， 0022 LX5:5 -AAGTATATACTGGCTTCCCTTCCCCC-3 /5 -CTTTGCACTGGATGGCTCAGAAGAGG- 3 ， 0023 LX7:5 -ACTGGTCGAGCTGTTTCTGCTGAAA-3 /5 -TGACGTGGATTA。
25、TTGGTTTGATTCCG-3 ， 0024 LX8:5 -TTATGTTTTGTACTGCAAGGAACGCG-3 /5 -CGATGGCTGGAGGCAAGGGTC-3 ， 0025 LX11:5 -TTGATCCGGTTACCATAGAGTTCG-3 /5 -GGGTTTGGTGTTTGGGGTGTTTG-3 ， 0026 LX12-1:5 -CATCGTTGTTGGTCCCGGAACTC-3 /5 -CATCGTTGTTGGTCCCGGAACTA-3 。 0027 再进一步地， 所述步骤7)中， 64对SSR引物序列分别为： 说明书 4/18 页 14 CN 105441544 B 。
26、14 0028 说明书 5/18 页 15 CN 105441544 B 15 0029 说明书 6/18 页 16 CN 105441544 B 16 0030 说明书 7/18 页 17 CN 105441544 B 17 0031 说明书 8/18 页 18 CN 105441544 B 18 0032 0033 再进一步地， 所述步骤8)中， 扩增10个SSR标记引物序列分别为： 0034 SSR4-1:5 -AGTGTTTTGGTTTGCATCCAGT-3 /5 -AGGAGAATGTTGGTGAAATGCT-3 ， 0035 SSR60-1:5 -GACATTTGGCTTGATCC。
27、TTTTC-3 /5 -TGACTCGAAGTGAGTAGGACTAGGT-3 ， 0036 SSR60-2:5 -AGCTGTGATTGAACAGAAGACCT-3 /5 -CACCAAGGATAAACTCAAGGGA-3 ， 0037 SSR60-5:5 -CCTTAATGTTCGTCGTTTATGC-3 /5 -AAACCATATCCAAATCCTACGG-3 ， 0038 SSR7-1:5 -CAAAGAAACAAAACCGGAGAAG-3 /5 -CACAAGACAATAGGCGTGAGAG-3 ， 0039 SSR8-2:5 -GACCAAGCAAACTCACAAGTCA-3 /5。
28、 -GACCAACCCGAAACAAAATAAC-3 ， 0040 SSR8-3:5 -TATTGTTGCAGACGGATTTCAC-3 /5 -AAGAGTACGATGAAGAGGCGAC-3 ， 0041 SSR810-6:5 -TCTTGACGAATTACCGATGGAT-3 /5 -GTGCAGAGAGCTATTTTGAGTTGA-3 ， 0042 SSR810-8:5 -CAGTCCACGAAACTAACACCAA-3 /5 -ATCACACCTCAATTCTCTTGCC-3 ， 说明书 9/18 页 19 CN 105441544 B 19 0043 SSR810-12:5 -TA。
29、CCAAGGTTGTGATGATTTGC-3 /5 -CCAAGAAAGAAAAGGGGATCA-3 。 0044 本发明还提供了一种上述筛选获得的3个与不结球白菜隐性核不育系矮脚黄A育 性基因连锁的SSR标记SSR60-1、 SSR60-2及SSR8-2的应用包括： 在以矮脚黄A为不育源向其 他优良材料转育创制不育系过程中的基因型分析。 0045 a)不结球白菜隐性核不育系矮脚黄A为母本， 选择农艺性状优良的不结球白菜可 育系1个为父本， 分别与之杂交产生F1代。 以F1代为母本， 上述优良可育自交系为父本回交， 产生BC1F1代。 0046 b)种植BC1F1代植株， 单株挂牌取样， 提取。
30、单株DNA样品， 利用标记引物SSR60-1、 SSR60-2及SSR8-2进行单株PCR扩增， 6聚丙烯酰胺凝胶电泳检测， 记录单株带型， 进行基 因型分析。 在两种基因型MSMS(单带扩增)和MSms(双带扩增)中， 选择三个标记扩增带型均 为MSms基因型的单株， 继续与优良可育系回交， 产生BC2F1代。 0047 c)种植BC2F1代单株， 如步骤b中所示方法继续用标记SSR60-1、 SSR60-2及SSR8-2 进行基因型分析， 选择MSms的基因型的单株作为母本单株与优良可育系回交。 如此回交多 代(一般4-5代)后， 观察轮回后代与优良可育系的田间表型。 如基本一致， 即可利。
31、用SSR60- 1、 SSR60-2及SSR8-2进行基因型分析， 选择BCnF1代中基因型为MSms的单株自交， 即可获取 优良不育系转育材料。 0048 本发明的有益效果 0049 1.利用分子标记辅助不结球白菜优良不育系转育的优势在于： 在利用SSR分子标 记辅助隐性核不育源转移至优良可育系的过程中， 可以帮助育种工作者提前获得转育群体 单株的基因型。 在回交当代选择自己所需的单株， 而无需回交后再自交观察田间表型， 节省 了大量的投入， 缩短了育种年限。 0050 2.获得了与不结球白菜隐性核不育育性基因紧密连锁的分子标记， 为下一步基因 克隆奠定了良好的基础。 附图说明 0051 图。
32、1为SNP标记及小群体验证图； 0052 图中， LX4、 LX5、 LX7、 LX8、 LX11、 LX12-1为标记名称， B代表可育集团池， A代表不育 集团池， B1-B12代表可育单株， A1-A12代表不育单株， M:Marker； 0053 图2为 SSR标记筛选图； 0054 图中， A表示不育集团混合池， B表示可育集团混合池， 4-1、 60-1、 60-2、 60-5、 7-1， 8-2、 8-3、 810-6、 810-8和810-12为SSR标记名称。 具体实施方式 0055 实施例1： 不结球白菜隐性核不育系育性基因连锁的分子标记筛选 0056 1.DNA提取 00。
33、57 对F2代分离群体中各单株编号挂牌， 于苗期选取0.5g鲜嫩叶片， 装于2.0ml离心 管， 于-20或-70储存备用。 基因组DNA提取采用CTAB法(Lu et al,2004)。 具体步骤是： 将叶片倒于研钵中， 加入700-800 l 2的CTAB缓冲液(2CTAB； EDTA： 20mmol/L； pH 8.0Tris-HCl： 100mmol/L； NaCl： 1.4mol/L； PVP1)， 磨成匀浆。 65水浴60min， 每隔15min 说明书 10/18 页 20 CN 105441544 B 20 轻摇一次。 室温放置10min， 加入等体积的氯仿:异戊醇(24:1)。
34、轻摇， 混匀。 12,000r/min离心 15min， 轻轻取出， 吸取上清至新的2ml的离心管中， 加1/10体积的3MNaAC (PH5.2)， 再加 入两倍体积的冰冻无水乙醇， 上下翻转数次混匀， 冰浴30min。 10,000r/min离心2min， 小心 的倒去上清， 加1,000 l漂洗液(76乙醇， 10mM醋酸铵)， 漂洗两次。 小心的倒掉漂洗液， 于 室温下晾干至透明无色。 视DNA量， 酌情加入TE缓冲液(含0.1的RNase)溶解DNA， -20保 存备用。 总DNA质量用0 .8的琼脂糖凝胶电泳检测。 总DNA浓度用紫外分光光度计 (Pharmacia Biotech。
35、,Gene Quant )测量， 根据检测结果， 将各样品的DNA浓度用ddH2O调 整到50ng/ l， 于-20保存备用。 0058 2 SNP标记筛选 0059 2.1 DNA制备及样品池的构建 0060 使用天根生化科技(北京)有限公司生产的 新型植物基因组DNA提取试剂盒 提取 样品DNA， 以备后续扩增所用。 所用产品目录号： DP320， 具体操作按照产品使用说明中的操 作步骤执行。 产品说明书版本号： DP121221。 在F2群体内选取30个不育单株和30个可育单 株， 利用试剂盒分单株提取样品DNA， 每10份单株样品等量混合， 混成三个不育集团池， 和三 个可育集团池， 。
36、用于后续DNA的扩增。 本实验利用Illumina 60K BrassicanapusSNP芯片技 术对六份混合样品进行分析。 0061 2.2 DNA扩增准备 0062 0.1N NaOH(4gNaOH溶于100ml水)DNA变性， MA2中和作用， 37孵育20-24h， DNA充 分扩增。 0063 2.3样本与芯片杂交-DNA片段化 0064 加入50l FMS 37温育1h， DNA被酶切为300-600bp的小片段； 沉淀DNA， 加 100PM1， 300 l异丙醇， 4静止30min， 3000g离心20min， 干燥1h。 回溶DNA片段， 加入RA1， 48 1h。 DNA。
37、变性， 9520min， 室温静止30min。 准备杂交盒， 加入PB1， 48杂交16-24h。 0065 2.4芯片清洗 0066 在玻璃槽中加入200ml PB1， 放入洗架， 沿对角线撕去芯片表面的封膜， 把去封膜 的芯片放到洗架上， 上下拉动1min， 洗去未杂交上的DNA片段。 0067 2.5芯片染色 0068 150ml PB1放入安装盒中， 放入黑色框架， 把芯片放到黑色框架上， 放入塑料垫片， 放上Alignment Bar， 将玻璃板放到芯片上， 用金属夹固定玻璃板、 塑料垫片、 芯片、 黑色框 架， 剪除垫片多余的部分。 准备染色试剂， 将水循环加热仪事先预热至44， 。
38、用测温仪测定 预热水循环加热仪的温度， 使其稳定于44。 把制作完成的芯片装置放到水循环加热仪上， 按照实验流程操作(单碱基延伸、 染色)， PB1作为洗液， XC4用于封膜。 取下芯片， 放在 staining rack上， PB1中上下拉动10次， 静止5min， XC4中上下拉动10次， 静止5min， 0.68bar 真空抽干50-55min。 以上操作流程由inlumina公司网站提供(英文版)。 0069 2.6芯片扫描 0070 采用BeadArray Reader激光共聚焦扫描系统， 进行数据采集。 0071 2.7芯片数据分析 0072 SNP数据分析使用的软件为Genome。
39、Studio Software软件， 该软件由以下网站 说明书 11/18 页 21 CN 105441544 B 21 genomestudio.aspx提供。 数据分析过程中， 分析软件参数设置为默认参数。 其中基因分型 后， 不育材料基因型为 “AA/BB” 对可育材料基因型 “AB” 为差异， 或不育材料缺失 “NC” 对可育 材料 “AA/BB” 为差异， 共计四种差异类型。 三个不育集团池与三个可育集团池芯片数据分析 评估后共获得73个SNP差异位点(表1)， 将获得的SNP差异位点序列提交白菜基因组数据库 比对分析后显示， 上述差异位点分布于白菜A2连锁群的共计 56个， A5、。
40、 A3、 A9、 A8连锁群各 一个(表2)。 0073 表1评估后SNP标记差异表 说明书 12/18 页 22 CN 105441544 B 22 0074 0075 表1续 说明书 13/18 页 23 CN 105441544 B 23 0076 0077 注： A1-A3是不育集团混池样品名， B1-B3是可育集团混池样品名。 0078 表2比对分析后SNP差异位点分布表 说明书 14/18 页 24 CN 105441544 B 24 0079 0080 表2续 说明书 15/18 页 25 CN 105441544 B 25 0081 0082 2.8 AS-PCR引物设计 00。
41、83 由于SNP标记只有转化为可电泳检测的分子标记， 才便于后续实验操作及实际应 用。 由于本实验中绝大部分SNP差异位点集中分布在A2连锁群， 因此引物设计重点选取A2连 锁群的SNP差异位点进行标记转化。 根据PCR引物3 末端必须与模板完全互补才能产生有效 聚合反应的原理， 将SNP差异位点序列提交网站http:/pga.mgh.harvard.edu/cgi-bin/ snap3/websnaper3.cgi在线设计Allele-Specific PCR(AS-PCR)引物， 共设计17对AS-PCR 引物。 0084 2.9 AS-PCR引物的琼脂糖凝胶检测： 0085 50ng D。
42、NA， 1PCR缓冲液， 2.0mmol/L MgCl2， 0.2mmol/L dNTPs， 0.5U Taq酶， 正向 及反向AS-PCR引物各12.5ng， 反应总体积为10 l。 PCR循环参数为： 94(2min)； 94(30s)， 55(30s)， 72(1min)， 35个循环； 4保存。 扩增产物于1琼脂糖凝胶上电泳分离， 通常 用0.5TAE， 180W电压。 电泳完成后， 用伯乐凝胶成像系统GelDocTM XR+拍照并保存图片。 17 对AS-PCR引物扩增三个可育集团池和三个不育集团池， 共获得6个差异标记(图1)， 以上标 记序列见表3所示。 说明书 16/18 页 。
43、26 CN 105441544 B 26 0086 表3 SNP标记引物序列 0087 0088 3.SSR标记筛选 0089 3.1 SSR引物设计 0090 将以上获得的6个SNP标记序列与白菜基因组A2连锁群进行比对， 获得的相应区段 作为候选区段。 每个标记序列上下游各选取约10K长度的序列， 作为引物设计提交序列。 共 计提交6段白菜基因组A2连锁群上的候选序列至 在 线进行SSR引物设计。 0091 3.2 PCR反应体系 0092 共设计SSR引物64对， 按以下PCR体系扩增： 50ng DNA， 1PCR缓冲液， 2.0mmol/L MgCl2， 0.2mmol/L dNTP。
44、s， 0.5U Taq酶， 正向 及反向SSR引物各12.5ng， 反应总体积为10 l。 PCR循环参数为： 94(2min)； 94(30s)， 60(-0.5/循环)(30s)， 72(45s)， 9个循环； 94(30s)， 55(30s)， 72(1min)， 30个循环； 4保存。 0093 3.3 SSR引物检测及标记筛选 0094 扩增产物于6变性PAGE凝胶上电泳分离， 通常用0.5TBE， 80W电压。 电泳完成 后， 银染法显带， 用数码相机拍照保存图片。 通过SSR引物在不育集团池和可育集团池的扩 增， 在64对SSR引物中共计有10对SSR引物在不育集团池和可育集团池。
45、扩增出差异条带(图 2)。 0095 4与育性基因连锁的分子标记遗传距离估算 0096 将上述获得的差异标记， 进行F2代2623个单株的分离大群体验证。 基于孟德尔和 摩尔根遗传连锁和分离规律， 将上述10个SSR分子标记的F2群体单株基因型数据和育性性 状统计数据输入计算机， 运行MAPMAKER/EXP Version 3.0软件分析， 确定其遗传距离。 结果 表明： SSR4-1、 SSR60-1、 SSR60-2、 SSR60-5、 SSR7-1、 SSR8-2、 SSR8-3、 SSR810-6、 SSR810-8、 SSR810-12的遗传分别为2.5cM、 0.79cM、 0.。
46、94cM、 1.1cM、 1.4cM、 0.63cM、 1.2cM、 1.4cM、 1.5cM、 3.1cM。 同时遗传距离1cM的SSR标记为3个(差异标记序列如表4所示)， 0097 表4 SSR标记引物序列 说明书 17/18 页 27 CN 105441544 B 27 0098 0099 实施例2： 利用与不结球白菜矮脚黄A育性基因连锁的分子标记辅助选育优良不育 系转育， 步骤如下： 0100 a)不结球白菜隐性核不育系矮脚黄A为母本， 选择农艺性状优良的不结球白菜可 育自交系为父本， 杂交产生F1代。 0101 b)以F1代为母本， 上述优良可育自交系为父本回交， 产生BC1F1代。
47、。 0102 c)种植BC1F1代植株， 单株挂牌取样， 提取单株DNA样品， 利用标记SSR60-1、 SSR60- 2及SSR8-2引物进行单株PCR扩增， 6聚丙烯酰胺凝胶电泳， 银染显影后， 记录单株扩增带 型， 进行基因型分析。 单株基因型分为两类MSMS单带扩增和MSms双带扩增， 选择三个标记扩 增带型均为MSms基因型的单株， 继续与优良可育系回交， 产生BC2F1代。 0103 d)种植BC2F1代单株， 如步骤c中所示方法继续用标记SSR60-1、 SSR60-2及SSR8-2 进行基因型分析， 选择MSms的基因型的单株作为母本单株与优良可育系回交。 如此回交多 代(一般。
48、4-5代)后， 观察轮回后代与优良可育系的田间表型。 如基本一致， 即可利用SSR60- 1、 SSR60-2及SSR8-2进行基因型分析， 选择BCnF1代中为MSMs的基因型的单株自交。 即获得 优良的不育系转育材料。 0104 其它未详细说明的部分均为现有技术。 尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描 述， 但它仅仅是本发明一部分实施例， 而不是全部实施例， 人们还可以根据本实施例在不经 创造性前提下获得其他实施例， 这些实施例都属于本发明保护范围。 说明书 18/18 页 28 CN 105441544 B 28 0001 序列表 1/29 页 29 CN 105441544 B 29 。
49、0002 序列表 2/29 页 30 CN 105441544 B 30 0003 序列表 3/29 页 31 CN 105441544 B 31 0004 序列表 4/29 页 32 CN 105441544 B 32 0005 序列表 5/29 页 33 CN 105441544 B 33 0006 序列表 6/29 页 34 CN 105441544 B 34 0007 序列表 7/29 页 35 CN 105441544 B 35 0008 序列表 8/29 页 36 CN 105441544 B 36 0009 序列表 9/29 页 37 CN 105441544 B 37 0010 序列表 10/29 页 38 CN 105441544 B 38 0011 序列表 11/29 页 39 CN 105441544 B 39 0012 序列表 12/29 页 40 CN 105441544 B 40 0013 序列表 13/29 页 41 CN 105441544 B 4。