技术领域
本发明涉及一种检测水体重金属镉的微生物学方法，具体涉及利用基因工程技术改造的大肠埃希氏菌的构建方法，及建立其在检测水体环境中重金属镉的方法。
背景技术
重金属镉(Cadmium，Cd)是被国际癌症研究署(IARC)归类为第一类的人类致癌物；美国国家毒理学计划(NTP)也把镉确认为人类致癌物。水体重金属镉污染已经在我国局部地区表现为公害病，如广东镉大米事件、广西龙江镉污染事件等，引起了人们的高度重视。镉在环境中非常稳定，不易被生物降解，在水体和土壤中的含量逐年增加，继而在一些植物或动物体内积累，如镉污染区的大米、贝壳类海鲜、动物肝肾脏等，并通过食物链在人体内蓄积，为目前已知的最易在体内蓄积的毒物之一。镉对人体毒性很大，对肾、肺、肝、睾丸、脑、骨骼及血液系统均可产生毒性，主要积蓄在肾脏，引起泌尿系统的功能变化，一旦进入人体将很难排除。镉能够干扰骨中钙，如果长期摄入微量镉，使骨骼严重软化，骨头寸断，引起骨痛病，其还会引起胃脏功能失调，并干扰人体和生物体内锌的酶系统，导致高血压症上升。随着工业的迅速发展，镉及其化合物被广泛应用于电镀等行业。镉对环境的污染，主要是由工业废水排放引起(我国《污水综合排放标准》---GB8978-1996规定工业废水中镉的最高排放浓度为0.1mg·L-1)。因此，对环境水体中重金属镉的检测显得尤为必要。
目前监测和检测重金属污染物主要有两种方法：(1)物理化学分析法，如电感耦合等离子体原子发射光谱(ICP-AES)、电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)等，其优点是具备高检测灵敏度和高特异性，但也存在一些不足，如仪器设备昂贵，操作复杂，检测周期长，最重要的一点是，传统的物理化学方法主要是对环境重金属总量进行测定，不能检测重金属的生物可利用度；(2)基于生物有机体的微生物法，其一般分为基于质粒和基于基因组整合型两种。质粒整合型具有成本低、特异性强、快速、易操作等优点，但是基于质粒载体的工程菌株存在细菌传代后质粒拷贝数不均一，数量过高或丢失而导致检测信号不稳定、荧光本底 值高和独立实验重复性不好等缺陷。
生物检测技术的基本原理即是利用模式生物对特定化学物质的分子反应机理。对于生物检测技术而言需要三种必需的元件：针对特定或具有相似性质的化学物质的感应器；由感应器控制的启动子；受此启动子控制的报告基因。在设计生物检测技术时，由于细菌具有在环境中大量存在、生长快速、低成本及易维护等优点而受到研究人员普遍亲睐。在过去的研究中利用生物检测法来检测环境中的特定污染物已经引起了极大的关注，至今已经研发了一系列针对特定有机物和无机化合物的工程菌株及其产品，如：重金属、甲苯及其衍生物等。
目前对镉离子测定的生物检测技术也有所研发，但是目前大肠埃希氏菌对镉的具体耐受机制仍未清晰，大肠埃希氏菌具有精细的调控系统使得细胞内镉离子保持在较低的水平，但我们已发现大肠埃希氏菌中负责编码将镉离子泵出的P-Type ATPase基因zntA及其调节蛋白基因zntR。由于zntA基因的启动子对镉并非完全特异，它还能被锌、铅等离子非特异性启动，所以不能直接利用zntA基因的启动子来介导特异反应。另据Kaisa M.Hakkila等在文献Cd-specific mutants of mercury-sensing regulatory protein MerR，generated by directed evolution，Appl Environ Microbiol.2011Sep；77(17)：6215-24.报道，经过定点突变后的革兰阴性菌中汞离子调节蛋白MerR突变体，能与镉离子特异结合从而特异启动子启动下游基因表达，其对镉离子的特异性已得到证实。因此我们将在大肠埃希氏菌工程菌中引入定点突变后的MerR突变体基因MerR(M)作为镉离子特异反应蛋白的编码基因。我们尝试将异源的调节蛋白基因MerR(M)、启动子pmerR和报告基因gfpmut2融合在一起组成含有双启动子的检测元件，整合到大肠埃希氏菌基因组中。荧光蛋白基因是常用的报告基因，此发明我们将gfpmut2荧光蛋白作为报告基因用来替换启动子下游基因，所以当环境中的镉离子与调节基因结合后，启动子启动下游荧光蛋白基因的表达，从而通过荧光蛋白荧光强度反应镉离子浓度。这个机理提供了一个很好的检测模式，但镉是一种常见的剧毒性环境污染重金属，大部分细菌对镉具有耐受性以及抗性，故其敏感性不高。且这些研究是基于质粒作为表达载体，然而基于质粒载体的生物检测元件存在本底值高，细菌传代后质粒拷贝数不均一，数量过高或丢失，导致检测信号不稳定等缺陷。其作为检测镉的宿主菌会造成检测的不稳定和最低检测限偏高，这些非常不利于污染物的 检测，必须采用新的方法提高生物学检测方法检测镉离子的敏感性，以有效解决当前环境监测工作中遇到的瓶颈问题。Riether K等在文献Assessment of heavy metal bioavailability using Escherichia coli zntAp::lux and copAp::lux-based biosensors.Applied Microbiology and Biotechnology，2002；57(5-6)：712-6.中构建的基于质粒的pZNT-lux的大肠埃希氏菌生物传感器，其构建策略是将大肠埃希氏菌zntA启动子与luxCDABE基因进行基因融合，再连接到pUCD615质粒载体上。其同时能被镉、铅、汞、锌诱导发光，因此，缺乏特异性，且是在野生大肠埃希氏菌基础上构建检测镉离子的模式生物，存在上述缺陷。在专利《一种检测镉生物可利用度的微生物细胞传感器》CN公开号：102911906A中，大肠埃希氏菌E.coli作为宿主细胞承载重组质粒。重组质粒为含有金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureu p1258质粒镉抗性操纵子cad的启动子序列、镉抗性系统调控基因cadC、荧光素酶基因luc和T7终止子串联序列的pUC18质粒，同样是基于质粒的微生物传感器，存在上述基于质粒作为表达载体的多种缺陷，且金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureu p1258质粒镉抗性操纵子cad，可同时被铅、镉、锌诱导，缺乏特异性检测镉的特性。
本发明所述大肠埃希氏菌工程菌株可以克服这些不足，构建一种特异、敏感和快速检测镉的大肠埃希氏菌菌株，为检测水体中镉奠定基础。经检索本研究构建的工程菌株在国内外均无文献报道。
发明内容
本发明的目的是通过基因敲除和基因敲入技术构建一种检测元件整合到基因组上的大肠埃希氏菌工程菌株，从而建立一种特异、稳定和快速检测水体中重金属镉的微生物学方法，本发明具体构建及荧光检测示意图如附图1所示。
发明内容之一：提供一种检测水体中重金属镉的大肠埃希氏菌工程菌株，本发明的大肠埃希氏菌(Escherichia coli)WMC-009，已于2014年9月29日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其简称为CGMCC No.9747(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)保藏，分类命名为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)WMC-009，保藏编号为CGMCC No.9747。
1.本发明E.coli WMC-009 CGMCC No.9747的构建方法如下：
1.1基因敲除野生型大肠埃希氏菌基因组中zntA和zntR基因
采用Red重组系统，敲除野生型大肠埃希氏菌基因组中两个镉离子“外排泵”基因：zntA，序列如SEQ ID NO.1所示和zntR，序列如SEQ ID NO.2所示，构建大肠埃希氏菌双基因敲除菌株ΔzntAΔzntR；
1.2构建金属镉检测元件pmerR-MerR(M)-pmerR-gfpmut2融合基因
将异源镉离子调节基因MerR(M)，序列如SEQ ID NO.5所示，启动子pmerR，序列如SEQ ID NO.4所示以及荧光报告基因gfpmut2，序列如SEQ ID NO.3所示，通过交叉PCR技术，构建含有双启动子的重金属镉离子特异反应的检测元件：pmerR-MerR(M)-pmerR-gfpmut2融合基因；
1.3采用基因敲入技术构建检测重金属镉的大肠埃希氏菌工程菌株
采用基因敲入技术将含有增强型绿色荧光蛋白报告基因检测元件pmerR-MerR(M)-pmerR-gfpmut2置换到ΔzntAΔzntR菌株基因组中zntR基因编码框位置。具体方法为：通过交叉PCR技术，形成含有融合基因pmerR-MerR(M)-pmerR-gfpmut2和zntR基因两侧同源臂，的融合片段zntRNo-Ni-pmerR-MerR(M)-pmerR-gfpmut2-zntRCi-Co，该DNA融合片段大小约为2.3kb，zntR基因N端同源臂基因zntR-N，序列如SEQ ID NO.26所示以及zntR基因C端同源臂基因zntR-C，序列如SEQ ID NO.27所示，然后连接到pKOV条件复制质粒，构建pKOV-zntRNo-Ni-pmerR-MerR(M)-pmerR-gfpmut2-zntRCi-Co打靶载体，并将该打靶载体转化到ΔzntAΔzntR菌株中，通过温度及蔗糖的选择，挑选成功发生两次同源重组的菌株，并进一步通过菌落PCR及测序鉴定筛选目的菌株。
2.本发明所述大肠埃希氏菌菌株可以定量检测水体中重金属镉的原理如下：
本发明所述大肠埃希氏菌菌株定量检测水体中镉离子是采用pmerR启动子直接启动gfpmut2基因表达模式。在此构建中，当未添加外源性镉离子时，E.coli WMC-009基因组中MerR(M)基因编码产生的MerR(M)蛋白结合于pmerR启动子序列区，阻止GFPmut2表达；当外源性镉离子进入大肠埃希氏菌胞内后，Cd2+与MerR(M)蛋白结合，使MerR(M)蛋白从启动子上脱落，激活E.coli WMC-009 基因组中pmerR-MerR(M)-pmerR-gfpmut2融合基因的表达，从而产生GFPmut2蛋白，并且产生的GFPmut2蛋白的量或其荧光强度与镉离子浓度呈剂量依赖关系，所以通过测定荧光强度可以达到定量检测镉离子浓度的目的。
发明内容之二：建立一种本发明所构建的大肠埃希氏菌菌株检测水体中镉的微生物学方法。
本发明所述大肠埃希氏菌菌株检测水体中重金属镉的应用实施方案如下：
1.环境水体样品测定的准备：
取10-50ml待测环境水体样品，12,000g离心5min，取上清，用0.5M稀盐酸或氢氧化钠溶液调节上清样品的pH值为6-8，再用0.22μm的无菌针头滤器过滤，过滤后样品用于后续的测定。
2.LB培养基的配制：
LB培养基组份浓度为1％(W/V)Tryptone、0.5％(W/V)Yeast Extract、1％(W/V)NaCl、80％(V/V)去离子水，高温高压灭菌后冷却至室温，加入10％(V/V)体积pH 7.2的400mmol/L的无菌MOPS缓冲液后均匀混合。
3.标准曲线的制定：
把镉单元素标准品用无菌MilliQ级的纯水稀释成适当的浓度梯度。
3.1从保存的甘油菌E.coli WMC-009菌株中取5-10μl接入新鲜5ml LB培养基，37℃，250rpm过夜培养；
3.2取5-10μl步骤3.1的E.coli WMC-009过夜菌加入到LB培养基中，37℃，250rpm，恒温震荡培养至OD600值在0.02-0.6，OD600值0.3时为最佳值，取90-900μl菌液分装至96孔透明底黑色微孔板或15×150mm规格的检测管内，同时在每个检测孔或检测管内加入10-100μl镉单元素标准品，另加等体积无菌MilliQ级纯水作为阴性对照，每种水体样品或标准品各做3个平行孔或3个平行管，37℃、250rpm振荡孵育2-6h，最佳孵育时间为5h；
3.3将步骤3.2经诱导后的菌液，4,000rpm，水平离心10min，弃上清，收获的菌体重悬于1ml DB缓冲液中，制成菌悬液，其中DB缓冲液含有500mMNaCl、20mM Tris-HCl、20μg/ml氯霉素并调节pH至8.0；
3.4将步骤3.3的菌悬液稀释0-20倍，使E.coli WMC-009全细胞悬浮液的OD600≤0.3，混匀，分别测量其稀释液OD600值与荧光值，激发波长为481nn，发射波长为510nm；
3.5数据处理：
相对荧光值(Relative fluorescence unit，RFU)：RFUM＝FM/OD600M，FM为与镉单元素标准品孵育E.coli WMC-009菌悬液的荧光值，OD600M为与镉单元素标准品孵育E.coli WMC-009菌悬液的吸光度；RFUW＝FW/OD600W，FW为与MilliQ级纯水孵育E.coli WMC-009菌悬液的背景荧光值，OD600W为与MilliQ级纯水孵育E.coli WMC-009菌悬液的吸光度；
绝对荧光值(Absolutee fluorescence unit，AFU)：AFU＝RFUM-RFUW，RFUM为与镉单元素标准品孵育E.coli WMC-009菌悬液的相对荧光值，RFUW为与MilliQ级纯水孵育E.coli WMC-009菌悬液的相对背景荧光值。
3.6以镉单元素标准品诱导的绝对荧光值为纵坐标，镉单元素标准品浓度值为横坐标，绘制标准曲线，并进行曲线拟合获得标准方程。
4.环境水体中镉浓度的测定：
4.1从保存的甘油菌E.coli WMC-009菌株中取5-10μl接入新鲜LB培养基，37℃，250rpm过夜培养；
4.2取5-10μl步骤4.1的E.coli WMC-009过夜菌加入到LB培养基中，37℃，250rpm，恒温震荡培养至OD600值在0.02-0.6，OD600值0.3时为最佳值，取90-900μl菌液分装至96孔透明底黑色微孔板或15×150mm规格的检测管内，同时在每个检测孔或检测管内加入步骤1的10-100μl水体样品，另加等体积无菌MilliQ级纯水作为阴性对照，每种水体样品各做3个平行孔或3个平行管，37℃、250rpm振荡孵育2-6h，最佳孵育时间为5h；
4.3将步骤4.2经诱导后的菌液，4,000rpm，水平离心10min，弃上清，收获的菌体重悬于1ml DB缓冲液中，制成菌悬液，其中DB缓冲液含有500mMNaCl、20mM Tris-HCl、20μg/ml氯霉素并调节pH至8.0；
4.4将步骤4.3的菌悬液稀释0-20倍，使E.coli WMC-009全细胞悬浮液的 OD600≤0.3，混匀，分别测量其OD600值与稀释液荧光值，激发波长为481nm，发射波长为510nm；
4.6数据处理：然后根据同批次已知浓度的镉离子标准溶液诱导制作绿色荧光强度标准曲线获得的标准曲线及其方程，将测得的未知环境水体样品荧光强度值代入步骤3.6的方程中，计算得到未知环境水体样品中镉的浓度。
本发明所述工程菌株E.coli WMC-009，具有以下创新点和技术优势：
1.荧光本底值低：相对于质粒载体的工程菌株存在的本底值高，本发明检测元件整合到基因组中，且融合双启动子，明显降低本底值，具有优越性；
2.检测信号稳定：相对于质粒载体的工程菌株存在的细菌传代后质粒拷贝数不均一，数量过高或丢失，而导致检测信号不稳定的缺陷，本发明具有检测信号稳定，独立实验重复性好、结果可信的特性；
3.荧光信号强：本发明所述大肠埃希氏菌菌株采用增强型绿色荧光蛋白GFPmut2所发荧光作为检测信号，它比野生型GFP的荧光强100多倍，提高了大肠埃希氏菌菌株对Cd2+检测的灵敏度。并且以gfpmut2作为报告基因，具备无需底物和辅助因子的参与、检测方便、肉眼便可观察、灵敏度高、荧光稳定、无毒害、通用性、易于构建载体和可进行活细胞定时定位观察等特点；
4.不需专用仪器设备、专业操作人员和易在基层和现场应用并且价格低廉，便于推广：相对于传统的检测方法如原子吸收分光光度法(AAS)和电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)等，本发明操作简便、样品预处理简单、标准化检测流程操作简便、检测时间短、能够批量生产、价格低廉且易于推广实施；
5.E.coli WMC-009菌株中未导入任何外源抗生素抗性基因，不会危及人类健康或对环境造成污染；
6.实现生物有效性分析检测：本发明将重金属镉从总量分析转变到生物有效性分析检测，更能反映生理毒性，是重金属分析检测方法研究的必然趋势。重金属生物有效性是指能够被生物体吸收并引起不良反应或影响生物体生存的那一部分形式的重金属，是衡量重金属毒力大小的重要指标。重金属在环境中是以 多种形态存在的，如残渣态重金属几乎不能被生物体利用，传统的AAS和ICP-MS以及各种色谱-质谱联用仪等理化分析法检测的是样品中重金属总量，而微生物细胞作为一个生命系统，存在重金属的代谢与抗性机制，可以选择性吸收不同形态的重金属，能够有效评价环境中重金属的生物有效性和毒性效应。此外，微生物对保持土壤肥力和水体自净能力是必不可少的，因此研究重金属的生物有效性对环境微生物也是非常重要的。
附图说明
图1.本发明构建以及荧光检测示意图
本发明所述大肠埃希氏菌菌株定量检测水体中镉离子是采用pmerR启动子直接启动gfpmut2基因表达模式。在此构建中，当未添加外源性镉离子时，E.coli WMC-009基因组中MerR(M)基因编码产生的MerR(M)蛋白结合于pmerR启动子序列区，阻止GFPmut2表达；当外源性镉离子进入大肠埃希氏菌胞内后，Cd2+与MerR(M)蛋白结合，使MerR(M)蛋白从启动子上脱落，激活E.coli WMC-009基因组中pmerR-MerR(M)-pmerR-gfpmut2融合基因的表达，从而产生GFPmut2蛋白，并且产生的GFPmut2蛋白的量或其荧光强度与镉离子浓度呈剂量依赖关系，所以通过测定荧光强度可以达到定量检测镉离子浓度的目的。
图2.单基因敲除流程图
H1/H2：zntA/zntR基因两侧的同源臂；P1/P2：cat基因两侧同源臂；GeneA：zntA/zntR基因上游基因；GeneB：zntA/zntR基因；GeneC：zntA/zntR基因下游基因；Gene cat：氯霉素抗性基因。
图3.基因敲入流程图
A：zntR基因上游500bp基因zntR-N；B：zntR基因；C：zntR基因下游500bp基因zntR-C；D：pmerR-MerR(M)-pmerR-gfpmut2检测元件。
图4.cat基因PCR电泳图
M：DL 5,000DNA Marker；1/2：cat基因(1200bp)
图5.zntA单基因敲除PCR电泳图
M：DL 5,000DNA Marker；1：野生型zntA基因(2499bp)；2：含有cat基因的野生型(zntA::cat)(1249bp)；3：成功敲除zntA的突变菌(498bp)。
图6.zntR单基因敲除PCR电泳图
M：DL 5,000DNAMarker；1：野生型zntR基因(726bp)；2：含有cat基因的野生型(zntR::cat)(1249bp)；3：成功敲除zntR的突变菌(408bp)
图7.ΔzntA-ΔzntR菌株PCR鉴定电泳图
M：DL 5,000DNA Marker；1：ΔzntA-ΔzntR菌株的ΔzntA(498bp)；2：ΔzntA-ΔzntR菌株的ΔzntR(408bp)。
图8.pmerR-MerR(M)、pmerR-gfpmut2、pmerR-MerR(M)-pmerR-gfpmut2基因鉴定电泳图
M：DL 5,000DNA Marker；1：pmerR-MerR(M)(506bp)；2：pmerR-gfpmut2(788bp)；3：pmerR-MerR(M)-pmerR-gfpmut2(1294bp)。
图9.pmerR-MerR(M)-pmerR-gfpmut2-pMD19-T转化到野生型大肠埃希氏菌鉴定电泳图
M：DL 5,000DNA Marker；1：zntA(2499bp)；2：zntR(426bp)；3：pmerR-MerR(M)-pmerR-gfpmut2(1294bp)。
图10.pmerR-MerR(M)-pmerR-gfpmut2-pMD19-T/ΔzntA-ΔzntR鉴定电泳图
M：DL 5,000DNA Marker；1：pmerR-MerR(M)-pmerR-gfpmut2(1294bp)；2：zntA(2499bp)；3：zntR(426bp)。
具体实施方式
实施例1.突变菌的制备
一、引物信息及合成
基因敲除引物：根据http://ecogene.org/提供基因敲除的引物序列，Primer5.0及DNAMAN软件，设计同源重组引物，见表1，5′端为cat基因两侧的同源臂，见表1无下划线部分，3′端为用于扩增氯霉素抗性基因见表1下划线部分。上游同源臂引物zntA-Nf，序列如SEQ ID NO.6所示和zntR-Nf，序列如SEQ ID NO.8所示；下游同源臂引物zntA-Cr，序列如SEQ ID NO.7所示和zntR-Cr，序列如SEQ ID NO.9所示。
基因敲除鉴定引物：利用Harvard Molecular Technology Group&Lipper Center for Computational Genetics网站 http://arep.med.harvard.edu/labgc/adnan/projects/EcoliKO-primers/EcoliKOprimers.htm提供的一对跨越待敲除基因的外侧设计敲除鉴定引物，见表2。鉴定zntA基因敲除引物设计：上游引物zntA-H1P1，序列如SEQ ID NO.10所示，位于zntA基因上游150bp，下游引物zntA-H2P2，序列如SEQ ID NO.11所示，位于zntA基因下游150bp；鉴定zntR基因敲除引物设计：上游引物zntR-H1P1，序列如SEQ ID NO.12所示，位于zntR基因上游150bp，下游引物zntR-H2P2，序列如SEQ ID NO.13所示，位于zntR基因下游150bp，单基因敲除流程图见附图2。
引物由invitrogene公司合成。用无菌去离子水将引物溶解，配成浓度为10μmol/L。
表1.基因敲除引物
表2.基因敲除鉴定引物
二、单突变菌ΔzntA的制备
2.1质粒pKD46转化至大肠埃希氏菌
用接种针从大肠埃希氏菌的细菌平板中挑取1个单菌落接种于3ml LB液体 培养基，37℃，250rpm振荡培养过夜并通过冷CaCl2法制备感受态细胞，将pKD46质粒转化入大肠埃希氏菌感受态细胞中，然后均匀涂板于LB-Amp+平板，待菌液充分吸收后倒置平板，30℃培养过夜。平板上长出菌落说明pKD46已转入大肠埃希氏菌中。
2.2带FRT位点的cat基因PCR扩增
取含有pKD3质粒的过夜菌液1ml于1.5ml的EP管中，8,000rpm，离心3min，弃上清，菌体用1ml MilliQ H2O重悬洗涤两次后，沸水煮10min，12,000rpm离心3min，作为模板，混匀。利用引物zntA-Nf和zntA-Cr，按表3配制PCR反应体系。
表3
PCR反应条件如下：94℃1min；88℃4min；94℃10sec，66℃3min，35个循环；72℃10min 4℃保存。取5μl PCR产物以1.0％的Agarose凝胶电泳鉴定。PCR产物用PCR产物纯化试剂盒进行纯化，最后加适量的ddH2O溶解洗脱备用。如图4显示，已扩增得到1kb左右的cat基因。
2.3含有pKD46的大肠埃希氏菌电转感受态细胞的制备
2.3.1种子液制备：从步骤2.1中LB-Amp+平板上长出的菌落中，取一单菌落接种于3ml LB-Amp+液体培养基，30℃，250rpm振荡培养过夜。
2.3.2取步骤2.3.1的过夜菌50μl于10ml TB-Amp+试管中，扩大培养1.5h左右，加入20％L-Arab 5μl，终浓度为0.02％，诱导1.5h；
2.3.3取出步骤2.3.2菌液置冰浴15min，将菌液转移至预冷的15ml离心管中，4℃，4,000rpm离心15min，弃上清，加入预冷的10％甘油10ml，4℃，4,000rpm离心15min，弃上清，重复步骤2.3.3两次，然后，加40μl 10％甘油重悬，即制备得到含有pKD46的大肠埃希氏菌电转感受态细胞。
2.4电转化cat基因
取步骤2.2制备的5μl cat基因PCR纯化后产物与步骤2.3.3制备的40μl感受态细胞混匀，转移至电击杯中，冰上操作。打开电转仪，调至Manual，参数设置为：电压：2.5kV，电容：25μF，电阻：200Ω，电击杯：2mm。将电击杯放入电击转化仪，按一下pusle键，听到蜂鸣声后，向电击杯中迅速加入1ml TB重悬，转移至EP管，37℃，150rpm振荡培养1h进行抗性恢复。然后将菌液于5,000rpm，25℃离心5min，取200μl上清重悬沉淀，涂于TB-CM+平板，37℃培养过夜，平板上出现菌落，说明转化成功。
2.5cat基因的PCR鉴定
从步骤2.4转化平板上取一单菌落接种于3ml TB-Cm+试管中，37℃，250rpm振荡培养4h，待菌液出现明显浑浊后取1ml菌液作PCR鉴定。将菌液于1.5ml的EP管中，8,000rpm，离心3min，弃上清，菌体用1ml MilliQ H2O重悬洗涤两次后，沸水煮10min，12,000rpm离心3min，作为模板，混匀。利用引物zntA-H1P1和zntA-H2P2，按表4配制PCR反应体系。
表4
PCR反应条件如下：PCR反应条件如下：95℃5min；95℃40sec，66℃2min，72℃2min 25个循环；4℃保存。取PCR产物5μl以1.0％的Agarose凝胶电泳鉴定。结果如图5所示，在1,500bp左右出现亮带，证明zntA基因已被cat基因替换。
2.6pCP20的转化
将pCP20质粒转化入通过冷CaCl2法制备的步骤2.5鉴定正确的含有cat基因的感受态细胞，菌液均匀涂板于LB-Amp+-Cm+板上，待菌液充分吸收后倒置平板，30℃培养过夜。
2.7cat抗性基因的消除
用接种针从步骤2.6细菌转化平板上取一个单菌落接种于3ml LB液体培养 基中，42℃，250rpm振荡培养4h左右；取一菌环四区划线接种于LB平板上，37℃培养过夜。用接种针分别从37℃培养过夜的细菌平板上挑取3个单菌落，此时cat基因已去除，pCP20质粒已丢失，分别点种于LB-Cm+与LB空白平板上，置于37℃培养6h左右；在LB-Cm+平板上不生长而LB平板上生长的细菌，cat基因已成功去除。进一步通过PCR鉴定，证明cat基因已完全清除。挑取菌落直接加入100μl水中煮沸10min后，离心作为模板，用鉴定引物按表4配制PCR体系进行PCR扩增。结果如图5所示，基因条带大小与理论值相符，说明已经成功完成zntA基因的敲除，得到zntA单突变菌ΔzntA。
2.8ΔzntA单突变菌的纯化
从步骤2.7中ΔzntA四区划线平板上挑取单菌落，用接种环蘸取少许细菌四区划线于新的LB平板，37℃培养过夜。余下菌落挑至100μl无菌水中，煮沸10min后离心，去上清作为模板用鉴定引物按2.5中步骤进行PCR鉴定，鉴定正确后得到纯化的单突变菌。
三、双突变菌ΔzntAΔzntR制备
在ΔzntA单突变菌基础上敲除zntR基因，制备得到双基因突变菌，方法同单突变菌的制备，具体步骤如下：
3.1PCR扩增含zntR上下游50bp同源臂带FRT位点的氯霉素抗性基因
取含有质粒pKD3的大肠埃希氏菌过夜菌液1ml于1.5ml的EP管中，12,000rpm，离心1min，弃上清，菌体用1ml无菌MilliQ H2O重悬洗涤两次后，沸水煮10min，12,000rpn离心3min，按照表5配制PCR反应管，混匀。
表5
PCR反应条件如下：95℃3min；95℃40sec，48℃40sec，72℃2min， 35个循环；72℃10min，4℃30min。产物以1.0％的Agarose凝胶电泳鉴定，如附图4。PCR产物用纯化试剂盒进行纯化，最后加适量的无菌MilliQ H2O溶解洗脱备用。
3.2将扩增的氯霉素抗性基因转入Red重组酶的菌株中
将转化有pKD46的大肠埃希氏菌接种于3ml LB-Amp+液体培养基中，30℃培养过夜，次日1∶100接种至含有50ml LB-Amp+液体培养基中，30℃培养至OD600＝0.1时，1∶500加入20％L-阿拉伯糖，诱导至OD600≈0.5时制备电转感受态，40μl/每管。将步骤3.1中扩增的片段取5μl加入感受态菌株，用Bio-Rad电击仪电转化，电击条件：200Ω，25μF，电击电压2.5kV，电击时间5ms，电击后迅速加入1ml LB，250rpm，37℃培养1.5h，之后涂布于LB-Cm+平板，次日观察。
3.3选择氯霉素抗性转化体
挑取步骤3.2中氯霉素平板上长出的菌落，接种于5ml LB-Cm+液体培养基中，250rpm，37℃培养至肉眼可见的浑浊。取1ml于1.5ml的EP管中，12,000rpm，离心1min，弃上清，菌体用1ml无菌MilliQ H2O重悬洗涤两次后，沸水煮10min，12,000rpm离心3min，按照表6配制PCR反应体系，混匀。
表6
PCR反应条件如下：95℃3min；95℃40sec，52℃40sec，72℃2min，25个循环；72℃10min，4℃30min。产物以1.0％的Agarose凝胶电泳鉴定，如附图6。
3.4FLP重组酶消除氯霉素抗性基因
将pCP20转入步骤3.3氯霉素抗性阳性的菌落中，30℃培养10h后转换温度至42℃，250rpm振荡培养过夜。接种环醮取过夜菌液涂布于无抗性LB平板，37℃培养过夜。过夜无抗平板长出的菌落，分别先后分格划线于新氯霉素抗性和无抗性LB平板，37℃培养过夜。选取氯霉素抗性无生长和无抗性LB平板生长的单菌落增菌，用鉴定引物按表6配制PCR体系进行PCR扩增。PCR鉴定结果如附图6所示，然后菌株再用2种鉴定引物鉴定，PCR扩增的条带中，两条为500bp左右，说明已经完成ΔzntA-ΔzntR双突变菌制备，结果如附图7。
实施例2.融合报告基因pmerR-MerR(M)-pmerR-gfpmut2的构建
一、引物信息及合成
根据GenBank公布的目的基因pmerR和MerR(M)序列及已知的gfpmut2基因序列，使用Primer5.0软件设计引物，见表7，部分引物在基因的5′端或3′端引入酶切位点，设计扩增pmerR-MerR(M)的引物Pmer-MerR-m-F，序列如SEQ ID NO.20所示和Pmer-MerR-m-R，序列如SEQ ID NO.21所示，扩增pmerR-gfpmut2基因的引物Pmer-GFPmut2-F序列如SEQ ID NO.22所示和GFPmut2-R序列如SEQ ID NO.23所示，以及最终融合片段连接到质粒载体pMD19-T的鉴定引物M13F，序列如SEQ ID NO.24所示和M13R，序列如SEQ ID NO.25所示。具体信息见表7，引物由invitrogene公司合成。用无菌ddH2O将引物溶解，配成浓度为10μmol/L的储存液，-20℃保存。
表7.基因融合引物详细信息表
二、pmerR-MerR(M)-pmerR-gfpmut2基因的融合及与pMD19-T载体连接
2.1扩增pmerR-MerR(M)基因
取含有质粒merR-MerR(M)-pmerR-gfpmut2-pMD19-T(Clonetech)的过夜菌液1ml于1.5ml的EP管中，8,000rpm，离心3min，弃上清，菌体用1ml MilliQ H2O重悬洗涤两次后，沸水煮10min，12,000rpm离心3min，取24μl上清作为模板。按下表配成体系，做PCR鉴定。
表8
PCR反应条件如下：95℃、5min；95℃、40sec，50℃、40sec，72℃、1.5min，35个循环；72℃、10min，4℃保存。取5μl产物以1.0％的Agarose凝胶电泳鉴定。结果如附图8所示。PCR产物用纯化试剂盒进行纯化，最后加适量的无菌MilliQ H2O溶解洗脱备用。
2.2PCR扩增merR-gfpmut2基因
取含有质粒merR-MerR(M)-pmerR-gfpmut2-pMD19-T的过夜菌液1ml于1.5ml的EP管中，8,000rpm，离心3min，弃上清，菌体用1ml MilliQ H2O重悬洗涤两次后，沸水煮10min，12,000rpm离心3min，取24μl上清作为模板。按下表配成体系，做PCR鉴定。
表9
PCR反应条件如下：95℃、5min；95℃、40sec，50℃、40sec，72℃、1.5 min，35个循环；72℃、10min，4℃保存。取5μl产物以1.0％的Agarose凝胶电泳鉴定。结果如附图8所示。PCR产物用纯化试剂盒进行纯化，最后加适量的无菌MilliQ H2O溶解洗脱备用。
2.3pmerR-MerR(M)-pmerR-gfpmut2基因的融合
将步骤2.1和步骤2.2的PCR产物，按下表10配制体系，接着再按下表11在表10基础上添加体系
表10
PCR反应条件如下：95℃、3min；95℃、40sec，62℃、40sec、-1℃，72℃、3min，8个循环；72℃、2min，4℃保存。
表11
PCR反应条件如下：95℃、3min；95℃、40sec，52℃、40sec，72℃、2min，35个循环；72℃、10min，4℃保存。取5μl产物以1.0％的Agarose凝胶电泳鉴定。结果如图8所示。PCR产物用纯化试剂盒进行纯化，最后加适量的无菌MilliQ H2O溶解洗脱备用。
2.4PCR产物加A反应与纯化
将步骤2.3的PCR产物按下表配成反应体系：
表12
PCR反应条件如下：72℃、1h，4℃保存。PCR产物用纯化试剂盒进行纯化，最后加适量的无菌MilliQ H2O溶解洗脱备用。
2.5目的片段与pMD19-T simple载体连接
按TaKaRa公司的pMD19-T simpLe Vector试剂盒说明书进行T载体与目的基因的连接。将步骤2.4的产物与pMD19-T simple Vector连接反应体系如下：
表13
16℃，连接过夜。
2.6转化
通过冷CaCl2法将步骤2.5连接产物转化入大肠埃希氏菌DH5α感受态细胞 中。
2.7测序
挑选一个经M13F/R引物，PCR鉴定正确的单克隆菌株送上海捷瑞生物工程有限公司测序，测序结果与NCBI上提供的标准参考序列比对。
2.8转化
2.8.1经步骤2.7测序正确的菌株提取质粒，质粒的提取采用TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver.3.0试剂盒小提质粒；
2.8.2通过冷CaCl2法将步骤2.8.1质粒分别转化入ΔzntA-ΔzntR感受态细胞中，标记为pmerR-MerR(M)-pmerR-gfpmut2-pMD19-T/ΔzntA-ΔzntR和野生型大肠埃希氏菌感受态细胞中，并且通过PCR鉴定转化菌种的正确性，结果如附图9和10所示。
实施例3.基因敲入
一、引物信息及合成
使用Primer5.0软件发计引物，见表14，设计pmerR-MerR(M)-pmerR-gfpmut2基因N末端和C末端的内侧引物，P2：zntR-cd-Ni，序列如SEQ ID NO.15所示和P5：zntR-cd-gfpmut2-Ci，序列如SEQ ID NO.16所示以及外侧引物，P1：zntR-No，序列如SEQ ID NO.14所示和P6：zntR-Co，序列如SEQ ID NO.17所示，使P2：zntR-cd-Ni与P3：pmerR-MerR(M)-pmerR-gfpmut2-F，序列如SEQ ID NO.18所示，P4：pmerR-MerR(M)-pmerR-gfpmut2-R，序列如SEQ ID NO.19所示，与P5：zntR-cd-gfpmut2-Ci之间存在互补序列，基因敲除两个外侧引物不变，P3与P4为一对扩增pmerR-MerR(M)-pmerR-gfpmut2的基因引物，P7：pkov-SalI，序列如SEQ ID NO.28所示与P8：pkov-NotI，序列如SEQ ID N0.29所示，为一对扩增pKOV的基因引物。具体信息见表14，引物由invitrogene公司合成。用无菌ddH2O将引物溶解，配成浓度为10μmol/L的储存液，-20℃保存。
表14.基因敲入引物详细信息表
注：下划线为酶切位点
二、pKOV-zntRNo-Ni-pmerR-MerR(M)-pmerR-gfpmut2-zntRCi-Co的融合与报告菌株的构建
2.1两侧同源臂的扩增
取含有pmerR-MerR(M)-pmerR-gfpmut2-pMD19-T质粒的过夜菌液1ml于1.5ml的EP管中，8,000rpm，离心3min，弃上清，菌体用1ml MilliQ H2O重悬洗涤两次后，沸水煮10min，12,000rpm离心3min，取24μl上清作为模板。按下表配成体系，做PCR鉴定。
表15
PCR反应条件如下：94℃、1min；88℃、4min；94℃、10sec，66℃、3min，25个循环；72℃、10min，4℃保存。取5μl产物以1.0％的Agarose凝胶电泳鉴定。PCR产物用纯化试剂盒进行纯化，最后加适量的无菌MilliQ H2O溶解洗脱备用。
2.2pmerR-MerR(M)-pmerR-gfpmut2基因的扩增
取含有pmerR-MerR(M)-pmerR-gfpmut2质粒的过夜菌液1ml于1.5ml的EP管中，12,000rpm，离心5min，弃上清，菌体用1ml MilliQ H2O重悬洗涤两次，沸水煮10min，12,000rpm离心5min，取24μl上清作为模板。按下表配成体系，做PCR鉴定。
表16
PCR反应条件如下：94℃、1min；88℃、4min；94℃、10sec，66℃、3min，25个循环；72℃、10min，4℃保存。取5μl产物以1.0％的Agarose凝胶电泳鉴定。PCR产物用纯化试剂盒进行纯化，最后加适量的无菌MilliQH2O溶解洗脱备用。
2.3一侧同源臂与pmerR-MerR(M)-pmerR-gfpmut2基因融合
PCR反应体系如下：
表17
PCR反应条件如下：94℃、1min；88℃、4min；94℃、10sec，66℃、3min，25个循环；72℃、10min，4℃保存。取5μl产物以1.0％的Agarose凝胶电泳鉴定。PCR产物用纯化试剂盒进行纯化，最后加适量的无菌MilliQ H2O溶解洗脱备用。
2.4两侧同源臂与pmerR-MerR(M)-pmerR-gfpmut2基因融合构建zntRNo-Ni-pmerR-MerR(M)-pmerR-gfpmut2-zntRCi-Co
PCR反应体系如下：
表18
PCR反应条件如下：94℃、1min；88℃、4min；94℃、10sec，66℃、3min，25个循环；72℃、10min，4℃保存。PCR产物用纯化试剂盒进行纯化，最后加适量的无菌MilliQ H2O溶解洗脱备用。取5μl产物以1.0％的Agarose凝胶电泳鉴定。结果显示，两侧同源臂与pmerR-MerR(M)-pmerR-gfpmut2基因成功融合。
2.5pKOV线性载体片段的制备
取15ml TB培养基生长的含pKOV质粒的过夜菌，采用TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver.5.0试剂盒抽提质粒。
pKOV质粒的单酶切
表19
37℃，酶切2h。
酶切反应后产物于65℃加热5min，灭活酶的活性，再以酶切产物为模板扩增pKOV载体片段，PCR反应体系如下：
表20
PCR反应条件如下：PCR反应条件如下：94℃、5min；94℃、40sec；63℃、40sec，72℃、6min，30个循环；72℃、10min，4℃保存。取5μl产物以1.0％的Agarose凝胶电泳鉴定。PCR产物用纯化试剂盒进行纯化，最后加适量的无菌MilliQ H2O溶解洗脱备用。
2.6打靶载体pKOV-zntRNo-Ni-pmerR-MerR(M)-pmerR-gfpmut2-zntRCi-Co的构建及保存
2.6.1测胶回收片段zntRNo-Ni-pmerR-MerR(M)-pmerR-gfpmut2-zntRCi-Co和纯化的线性化pKOV载体浓度，连接反应体系如下：
表21
16℃，连接过夜，其中同源臂融合片段与pKOV载体的摩尔比为10∶1。
2.6.2提取菌落鉴定正确的E.coli DH5α中的质粒pKOV-zntRNo-Ni-pmerR-MerR(M)-pmerR-gfpmut2-zntRCi-Co转化入双敲菌ΔzntA-ΔzntR感受态中，涂LB CM+平板，30℃恒温培养，长出菌落，说明转化成功。
2.6.3PCR鉴定阳性克隆菌株
用接种针挑取上述步骤2.6.2LB CM+平板上生长的单菌落少许分别划线接种于一个新的无菌LB CM+平板上，30℃恒温培养箱中倒置培养10h。然后，用接种针分别挑取该LB CM+平板上生长的单菌落少许，混于含50μl无菌水的EP管中，沸水煮10min，12,000rpm离心3min后，取上清5μl加入200μl PCR反应管中作为PCR鉴定模板。取以下体系加入该管中，混匀。
表22
PCR反应条件如下：94℃、1min；88℃、4min；94℃10sec，66℃5min，25个循环；72℃10min，4℃保存。取5μl产物以1.0％的Agarose凝胶电泳鉴定。电泳显示PCR片断长度在2.3kb左右的单克隆被挑选出来，进行下面的质粒提取。
2.7第一步同源重组，pKOV-zntRNo-Ni-pmerR-MerR(M)-pmerR-gfpmut2-zntRCi-Co整合到大肠埃希氏菌的基因组，
取于30℃孵育的pKOV-zntRNo-Ni-pmerR-MerR(M)-pmerR-gfpmut2-zntRCi-Co/ΔzntA-ΔzntR过夜菌液10μl接种于42℃预热的含5ml LB CM+培养基的试管中，于42℃，250rpm的恒温培养箱中振荡培养2h，然后分别取42℃孵育2h后的菌液20μl分区划线接种于3-4个42℃预热的LB CM+的平板上。待菌液完全吸收后，倒置于42℃恒温培养箱中培养过夜。
用接种针挑取经42℃孵育的LB CM+平板上生长的单菌落少许分别划线接种于一个新的42℃预热的LB CM+平板上，42℃恒温培养箱中倒置培养10h。然后，用接种针分别挑取该LB CM平板上生长的单菌落少许，混于含50μl无菌水的EP管中，沸水煮10min，12,000rpm离心3min后，取上清5μl加入200μlPCR反应管中作为PCR鉴定模板。PCR反应体系同表22。
PCR反应条件如下：94℃、1min；88℃、4min；94℃、10sec，66℃、5min，25个循环；72℃、10min，4℃保存。取5μl产物以1.0％的Agarose凝胶电泳鉴定，PCR产物为两条带，其亮度相当，约1,000bp和2,300bp左右的长度，证明已经发生了第一步同源重组，片断及质粒已经整合到基因组上。
2.8第二步同源重组，pKOV质粒与基因组分离并丢失
选取一株步骤2.7第一步同源重组成功的菌株于42℃孵育过夜培养的菌液50μl接种于30℃预热的5mL含5％蔗糖的LB培养液的试管中，于30℃，250rpm的恒温培养箱中振荡培养2h，然后分别取30℃孵育2h后的菌液进行十倍系列稀释，选取10-2、10-3、10-4三个稀释梯度的菌液各0.1mL分别涂布于30℃预热的含5％蔗糖的LB平板上。待菌液完全吸收后，倒置培养皿，30℃过夜，用接种针挑取30℃、5％蔗糖LB平板上生长的单菌落，分别划线接种于一个LB CM+平板和5％蔗糖LB平板上，30℃恒温培养箱中倒置培养过夜，进行氯霉素平板的负筛选，然后挑取在5％蔗糖LB平板上生长，对应于CM+/LB平板上不生长 的单菌落做菌落PCR鉴定，PCR反应体系同表22，取5μl产物以1.0％的Agarose凝胶电泳鉴定，PCR产物约为2.3kb的菌落初步证实为已经发生基因敲入的阳性菌落。分纯菌落，PCR进一步鉴定证实基因敲入成功。并置于-80℃保存，备用。
实施例4.工程菌株检测水体中重金属镉浓度流程的制定
4.1环境水体样品测定的准备：
取10-50ml待测环境水体样品，12,000g离心5min，取上清，用0.5M稀盐酸或氢氧化钠溶液调节上清样品的pH值为6-8，再用0.22μm的无菌针头滤器过滤，过滤后样品用于后续的测定。
4.2LB培养基的配制：
LB培养基组份浓度为1％(W/V)Tryptone、0.5％(W/V)Yeast Extract、1％(W/V)NaCl、80％(V/V)去离子水，高温高压灭菌后冷却至室温，加入10％(V/V)体积pH 7.2的无菌MOPS缓冲液(400mmol/L)后均匀混合。
4.3标准曲线的制定：
把镉单元素标准品用无菌MilliQ级的纯水稀释成适当的浓度梯度。
4.3.1从保存的甘油菌E.coli WMC-009菌株中取5-10μl接入新鲜5ml LB培养基，37℃，250rpm过夜培养；
4.3.2取5.-10μl步骤4.3.1的E.coli WMC-009过夜菌加入到LB培养基中，37℃，250rpm，恒温震荡培养至OD600值在0.02-0.6，OD600值0.3时为最佳值，取90-900μl菌液分装至96孔透明底黑色微孔板或15×150mm规格的检测管内，同时在每个检测孔或检测管内加入10-100μl镉单元素标准品，另加等体积无菌MilliQ级纯水作为阴性对照，每种水体样品或标准品各做3个平行孔或3个平行管，37℃、250rpm振荡孵育2-6h，最佳孵育时间为5h；
4.3.3将步骤4.3.2经诱导后的菌液，4,000rpm，水平离心10min，弃上清，收获的菌体重悬于1ml DB缓冲液中，制成菌悬液，其中DB缓冲液含有500mM NaCl、20mM Tris-HCl、20μg/ml氯霉素并调节pH至8.0；
4.3.4将步骤4.3.3的菌悬液稀释0-20倍，使E.coli WMC-009全细胞悬浮液 的OD600≤0.3，混匀，分别测量其稀释液OD600值与荧光值，激发波长为481nm，发射波长为510nm；
4.3.5数据处理：
相对荧光值(Relative fluorescence unit，RFU)：RFUM＝FM/OD600M，FM为与镉单元素标准品孵育E.coli WMC-009菌悬液的荧光值，OD600M为与镉单元素标准品孵育E.coli WMC-009菌悬液的吸光度；RFUW＝FW/OD600W，FW为与MilliQ级纯水孵育E.coli WMC-009菌悬液的背景荧光值，OD600W为与MilliQ级纯水孵育E.coli WMC-009菌悬液的吸光度；
绝对荧光值(Absolutee fluorescence unit，AFU)：AFU＝RFUM-RFUW，RFUM为与镉单元素标准品孵育E.coli WMC-009菌悬液的相对荧光值，RFUW为与MilliQ级纯水孵育E.coli WMC-009菌悬液的相对背景荧光值。
4.3.6以镉单元素标准品诱导的绝对荧光值为纵坐标，镉单元素标准品浓度值为横坐标，绘制标准曲线，并进行曲线拟合获得标准方程。
4.4环境水体中镉浓度的测定：
4.4.1从保存的甘油菌E.coli WMC-009菌株中取5-10μl接入新鲜LB培养基，37℃，250rpm过夜培养；
4.4.2取5-10μl步骤4.4.1的E.coli WMC-009过夜菌加入到LB培养基中，37℃，250rpm，恒温震荡培养至OD600值在0.02-0.6，OD600值0.3时为最佳值，驭90-900μl菌液分装至96孔透明底黑色微孔板或15×150mm规格的检测管内，同时在每个检测孔或检测管内加入步骤1的10-100μl水体样品，另加等体积无菌MilliQ级纯水作为阴性对照，每种水体样品各做3个平行孔或3个平行管，37℃、250rpm振荡孵育2-6h，最佳孵育时间为5h；
4.4.3将步骤4.4.2经诱导后的菌液，4,000rpm，水平离心10min，弃上清，收获的菌体重悬于1ml DB缓冲液中，制成菌悬液，其中DB缓冲液含有500mM NaCl、20mM Tris-HCl、20μg/ml氯霉素并调节pH至8.0；
4.4.4将步骤4.4.3的菌悬液稀释0-20倍，使E.coli WMC-009全细胞悬浮液的OD600≤0.3，混匀，分别测量其OD600值与稀释液荧光值，激发波长为481nm， 发射波长为510nm；
4.4.5数据处理：然后根据同批次已知浓度的镉离子标准溶液诱导制作绿色荧光强度标准曲线获得的标准曲线及其方程，将测得的未知环境水体样品荧光强度值代入步骤4.3.6的方程中，计算得到未知环境水体样品中镉的浓度。
实施例5.本发明检测水体中重金属镉浓度的方法学评估及应用实例
一、工程菌株E.coli WMC-009对强酸强碱模拟标本中镉离子的回收实验
用移液枪吸取计算好的E.coli WMC-009过夜菌种子液加入到90ml新鲜LB液体培养基中，使起始菌液OD600值约为0.02，37℃，250rpm诱导至OD＝0.02-0.6，OD为0.3时最佳，分装，0.9mL/管，分别加入100μl六种不同pH值范围在0.42-13.84的样品，然后再分别加入等体积Cd2+溶液至各管菌液使其终浓度均一致，另加等体积无菌MilliQ H2O作为空白对照。每种pH值样品各做3个平行管。将以上菌液于37℃，250rpm振荡培养2-6h后，最佳孵育时间为5h，4,000rpm，水平离心10min，弃上清，收获的菌体重悬于1ml Desalting buffer中，然后取50μl重悬菌液20倍稀释于0.95mL Desalting buffer中，混匀，分别测量其稀释液荧光值与OD600值。实验结果为三次独立实验的平均值±SD值，n＝3。
实验结果：E.coli WMC-009对强酸强碱模拟标本中镉离子的回收率均在80％-120％之间。用该方法测定的结果与采用原子吸收光谱法(AAS)测定的结果相接近。说明E.coli WMC-009具备客观检测水体中镉的含量而不受水体中强酸强碱的影响。
二、工程菌株E.coli WMC-009对温州鹿城区某造纸厂废水标本中镉离子的回收实验
从温州鹿城区采集一个造纸厂废水样品，经0.22μm的无菌过滤器过滤。用移液枪吸取计算好的E.coli WMC-009过夜菌种子液加入到90ml新鲜LB液体培养基中，使起始菌液OD600值约为0.02，37℃，250rpm诱导至OD＝0.02-0.6，最佳OD＝0.3，分装(0.9mL/管)，加入等体积不同浓度的Cd2+溶液至各管菌液，使其终浓度在10-9-10-3M/L之间，然后再分别加入100μl过滤后的湖水至每管菌液，每种浓度各做3个平行管。将以上菌液于37℃，250rpm振荡培养2-6h，最佳孵育时间为5h，4,000rpm，水平离心10min，弃上清，收获的菌体重悬于1ml Desalting buffer中，然后取50μl重悬菌液20倍稀释于0.95ml Desalting buffer中，混匀，分别测量其稀释液荧光值与OD600值。实验结果为三次独立实验的平均值±SD值，n＝3。
实验结果：E.coli WMC-009对造纸厂废水镉离子的回收率均在90％-120％之间。用该方法测定的结果与采用原子吸收光谱法(AAS)测定的结果相接近。说明E.coli WMC-009具备客观检测实际水体中镉的含量的应用前景。