技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种稳定表达AQP2蛋白的人源化小鼠足细胞模型及其构建方法和应用。
背景技术
目前已有研究证明，遗传性尿崩症有一种遗传类型为常染色体遗传，由Aquporin2(AQP2)的基因突变所致，突变位点1731A>C。因而，从理论上讲，建立人源化AQP2蛋白高表达细胞模型是可行的。通常来说，我们都通过人源化的动物来验证单克隆抗体或者其他特异性靶向人源分子的药物的药效以及其他相关药性评估，其中，人源化的小鼠为常用的实验动物，而且主要通过转基因的方法来实现。这一类方法在临床前的药性评估过程中发生着非常重要的作用，但是也存在着诸多不足，首要的一点就是建立稳定、高效表达目标蛋白的人源化小鼠细胞模型不仅耗时长而且费用也相对较高。因此，构建快捷成本低，用于相关蛋白研究、抗体的临床前药效药性评估的稳定、高表达AQP2蛋白的人源化细胞模型非常必要，也具有相当高的应用价值。
发明内容
本发明的目的在于提供一种稳定表达AQP2蛋白的人源化小鼠足细胞模型及其构建方法以解决现有技术中的问题，不仅能够稳定、高效表达AQP2蛋白，而且构建快捷、成本低。
为实现上述目的，本发明实施例的技术方案如下：
本发明实施例提供一种稳定表达AQP2蛋白的人源化小鼠足细胞模型，所述细胞模型为保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，并且保藏号为CGMCC NO.：16201的细胞或其后代细胞。
本发明实施例中所述细胞模型的分类命名为小鼠足细胞AQP2细胞株，保藏单位为中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2018年7月19日，保藏编号为CGMCC NO.：16201。
本发明实施例中所述的稳定表达AQP2蛋白的人源化小鼠足细胞模型的构建方法，所述方法包括步骤如下：
I、构建AQP2-DYK载体，具体包括如下步骤：
(1)以人的cDNA为模板，以SEQ ID No:1(也可称为A1F)和SEQ ID No:2(也可称为A1R)所示的引物扩增，通过PCR扩增引入两个限制性内切酶切位点HindIII，获得SEQ ID No:3所示的目的AQP2片段的扩增产物，将所述扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后回收目的AQP2片段；
(2)将回收的目的AQP2片段与质粒PUC19连接，用引物鉴定有效后，经碱性裂解法提取质粒DNA，获得具有目的AQP2片段的质粒PUC19-hAQP2；
(3)再用两个限制性内切酶HindIII和Kpn1酶切，将所述质粒PUC19-hAQP2的目的AQP2片段克隆到ANXA11-DYK载体的相应的酶切位点中，用引物鉴定后，获得质粒AQP2-DYK；
II、构建AQP2蛋白的人源化小鼠足细胞模型，具体包括如下步骤：
(4)将小鼠足细胞进行细胞培养；
(5)将步骤(3)制得的质粒AQP2-DYK转染至步骤(4)所培养的小鼠足细胞中；
(6)再以G418浓度为400～700ug/ml的培养基筛选，单个细胞继续培养形成团细胞群，对团细胞群进行阳性克隆细胞筛选，获得稳定表达AQP2蛋白的人源化小鼠足细胞株。
优选地，所述步骤(2)中以SEQ ID No:4(也可称为A2F)和SEQ ID No:5(也可称为A2R)所示的引物进行鉴定。
优选地，所述步骤(3)中以SEQ ID No:6(也可称为A3F)和SEQ ID No:7(也可称为A3R)所示的引物进行鉴定。
需要说明的是，在了解本发明目的以及如上引物序列的前提下，能够对引物进行各种常规的修饰，例如，添加酶切位点、添加保护碱基等。
本发明中，步骤(6)中所述的G418(Geneticin,遗传霉素)是一种氨基糖苷类抗生素,在分子遗传试验中，是稳定转染最常用的抗性筛选试剂。
更优选地，为了保证筛选出的单个细胞形成团细胞群，步骤(6)中用于筛选的培养基中G418浓度为400～700ug/ml。
本发明的发明人发现步骤(6)中先以G418浓度400～700ug/ml的培养基筛选后，单个细胞继续培养能够形成团细胞群，G418浓度过低(如300ug/ml左右)时，培养5-7天后，细胞死亡率达到80％以上，单个细胞无法形成团细胞群；G418浓度过高(如800ug/ml左右)时，培养1天后,细胞死亡率就达到80％以上，单个细胞也无法形成团细胞群。
更优选地，为了保证单个细胞形成团细胞群，步骤(6)中继续培养的培养基中G418浓度为400～900ug/ml。
更优选地，为了保证单个细胞形成团细胞群，步骤(6)中继续培养过程中需要每2-4天更换一次培养基。最优选地，每3天更换一次培养基。
本发明还提供上述方法构建的稳定表达AQP2蛋白的人源化小鼠足细胞模型。
优选地，所述细胞模型能够稳定表达AQP2蛋白至少40代。
优选地，所述细胞模型传代50代后仍能表达AQP2的比生成速率为15-22pg/cell/day。
本发明还提供上述稳定表达AQP2蛋白的人源化小鼠足细胞模型在AQP2蛋白研究，抗体的临床前药效药性评估或药物筛选等方面的应用。
本发明具有如下优点：
本发明采用合适的扩增引物和鉴定引物构建质粒AQP2-DYK，经其转染后的小鼠足细胞通过G418筛选和阳性克隆筛选后构建的细胞模型，不仅能够稳定、高效表达AQP2蛋白，而且构建快捷、成本低。
附图说明
图1免疫印迹法确定AQP2蛋白在小鼠足细胞模型中表达
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
下述实施例中所用的实验材料、生物制剂等，如无特殊说明，均为市购。并且，如无特殊说明，下述实施例中所用的细胞培养、分子遗传学、核酸化学、免疫学实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。
实施例1构建AQP2-DYK载体
(1)以人的cDNA为模板，设计引物序列A1F和A1R，引入两个限制性内切酶切位点HindIII，通过PCR扩增AQP2蛋白编码区，获得0.8kb目的AQP2片段的扩增产物，将所述扩增产物经2％琼脂糖凝胶电泳后回收目的AQP2片段，其中，引物序列和目的AQP2片段序列如下:
A1F:TAAGCTTGGATGTGGGAGCTCCGCTCCAT
A1R:AGGTGTTCGAAGGCCTTGGTACCCCGTGGCA
目的AQP2片段:
TAAGCTTGGATGTGGGAGCTCCGCTCCATAGCCTTCTCCAGGGCTGTGTTCGCAGAGTTCCTGGCCACACTCCTCTTCGTCTTCTTTGGCCTCGGCTCTGCCCTCAACTGGCCACAGGCCCTGCCCTCTGTGCTACAGATTGCCATGGCGTTTGGCTTGGGTATTGGCACCCTGGTACAGGCTCTGGGCCACATAAGCGGGGCCCACATCAACCCTGCCGTGACTGTGGCCTGCCTGGTGGGCTGCCACGTCTCCGTTCTCCGAGCCGCCTTCTACGTGGCTGCCCAGCTGCTGGGGGCTGTGGCCGGAGCCGCTCTGCTCCATGAGATCACGCCAGCAGACATCCGCGGGGACCTGGCTGTCAATGCTCTCAGCAACAGCACGACGGCTGGCCAGGCGGTGACTGTGGAGCTCTTCCTGACACTGCAGCTGGTGCTCTGCATCTTCGCCTCCACCGATGAGCGCCGCGGAGAGAACCCGGGCACCCCTGCTCTCTCCATAGGCTTCTCTGTGGCCCTGGGCCACCTCCTTGGGATCCATTACACCGGCTGCTCTATGAATCCTGCCCACTCCCTGGCTCCAGCTGTCGTCACTGGCAAATTTGATGACCACTGGGTCTTCTGGATCGGACCCCTGGTGGGCGCCATCCTGGGCTCCCTCCTCTACAACTACGTGCTGTTTCCGCCAGCCAAGAGCCTGTCGGAGCGCCTGGCAGTGCTGAAGGGCCTGGAGCCGGACACCGATTGGGAGGAGCGCGAGGTGCGACGGCGGCAGTCGGTGGAGCTGCACTCGCCGCAGAGCCTGCCACGGGGTACCAAGGCCTTCGAACACCT；
(2)将回收的目的AQP2片段与质粒PUC19连接，再用引物A2F和A2R鉴定有效后，经碱性裂解法提取质粒DNA，获得具有目的AQP2片段的质粒PUC19-hAQP2；
(3)通过两个限制性内切酶HindIII和Kpn1酶切，将所述质粒PUC19-hAQP2的目的AQP2片段克隆到ANXA11-DYK载体的相应的酶切位点中，用引物A3F和A3R鉴定后，获得质粒AQP2-DYK；
实施例2构建稳定表达AQP2蛋白的人源化小鼠足细胞株
(4)将小鼠足细胞AQP2培养于3个6cm培养皿中，培养液RPMI-1640(10％FBS、1％PS、50-100U/ml Y-IFN),PH 7.2,35-37度，5％二氧化碳培养箱培养20h，细胞密度为20％；
(5)将实施例1中制得的1μg质粒AQP2-DYK通过FuGENE6 Transfection(Promega公司)试剂转染至上述小鼠足细胞中，培养24h；
(6)再以G418浓度500ug/ml培养基进行培养，1天后观察死亡率出现细胞死亡，每3天更换1次G418浓度为500ug/ml的培养基继续培养，15天后原单细胞形成团细胞群，挑选团小的细胞刮下，用0.25％胰酶消化5分钟，用10vol.％胎牛血清G418浓度为500ug/ml的培养基中和后分别种于新的6孔培养皿中细胞浓度1％，细胞不再出现大片死亡。每3天更换1次G418高浓度为800ug/ml的培养基，15天后，第二次挑选团状细胞，使用抗体AQP2(C-17)进行免疫印迹确定蛋白表达(如图1)，筛选出能稳定表达AQP2蛋白的阳性克隆，再将上述阳性克隆细胞稀释至6/ml，细胞传代40代后，仍能保持AQP2的比生成速率为22pg/cell/day的细胞株，细胞传代50代后，仍能保持AQP2的比生成速率为20pg/cell/day的细胞株。
实施例3构建表达AQP2蛋白的人源化小鼠足细胞株
步骤(6)中再以G418浓度为500ug/ml的培养基进行培养，3天后更换G418浓度为800ug/ml的培养基继续培养，其他条件均与实施例2相同，细胞传代40代后，能保持AQP2的比生成速率为18pg/cell/day，细胞传代50代后，仍能保持AQP2的比生成速率为15pg/cell/day。
对比例1构建稳定表达AQP2蛋白的人源化小鼠足细胞株
步骤(4)和步骤(5)同实施例2，步骤(6)中再以G418浓度300ug/ml的培养基进行培养，1天后观察死亡率几乎无异常，3天后更换G418浓度为300ug/ml的培养基，再培养3天，G418浓度为300ug/ml的培养皿中细胞死亡率80％，继续培养，培养皿中细胞几乎全部死亡，无法形成团细胞群，不能构建出稳定表达AQP2蛋白的人源化小鼠足细胞株。
对比例2构建稳定表达AQP2蛋白的人源化小鼠足细胞株
步骤(4)和步骤(5)同实施例2，步骤(6)中再以G418浓度800ug/ml的培养基进行培养，1天后观察死亡率出现大片死亡，继续培养细胞几乎全部死亡，无法形成团细胞群，不能构建出稳定表达AQP2蛋白的人源化小鼠足细胞株。
可见，本发明的方法能够构建稳定、高效表达AQP2蛋白细胞模型。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 山西省人民医院
<120> 一种稳定表达AQP2蛋白的人源化小鼠足细胞模型及其构建方法和应用
<130> 18166592
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 1
taagcttgga tgtgggagct ccgctccat 29
<210> 2
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 2
aggtgttcga aggccttggt accccgtggc a 31
<210> 3
<211> 833
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 3
taagcttgga tgtgggagct ccgctccata gccttctcca gggctgtgtt cgcagagttc 60
ctggccacac tcctcttcgt cttctttggc ctcggctctg ccctcaactg gccacaggcc 120
ctgccctctg tgctacagat tgccatggcg tttggcttgg gtattggcac cctggtacag 180
gctctgggcc acataagcgg ggcccacatc aaccctgccg tgactgtggc ctgcctggtg 240
ggctgccacg tctccgttct ccgagccgcc ttctacgtgg ctgcccagct gctgggggct 300
gtggccggag ccgctctgct ccatgagatc acgccagcag acatccgcgg ggacctggct 360
gtcaatgctc tcagcaacag cacgacggct ggccaggcgg tgactgtgga gctcttcctg 420
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tacaccggct gctctatgaa tcctgcccac tccctggctc cagctgtcgt cactggcaaa 600
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aagggcctgg agccggacac cgattgggag gagcgcgagg tgcgacggcg gcagtcggtg 780
gagctgcact cgccgcagag cctgccacgg ggtaccaagg ccttcgaaca cct 833
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 4
aggcgattaa gttgggta 18
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 5
ggaaacagct atgaccatg 19
<210> 6
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<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 6
ttaatacgac tcactatag 19
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 7
ttatcgtcgt catccttgt 19