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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201610719970.6 (22)申请日 2016.08.24 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 106244592 A (43)申请公布日 2016.12.21 (73)专利权人 克孜勒苏柯尔克孜自治州人民医 院 地址 845350 新疆维吾尔自治区克孜勒苏 柯尔克孜自治州阿图什市幸福路街道 (72)发明人 曲晨谭晓姚诚曹喆胡文志 李云涛宋宗纬 (74)专利代理机构 北京市诚辉律师事务所 11430 代理人 唐宁 (51)Int.Cl. C12N 15/113。
2、(2010.01) C12Q 1/6886(2018.01) A61K 48/00(2006.01) A61K 31/7088(2006.01) A61P 35/00(2006.01) (56)对比文件 Derrien,T 等.GenBank 登录号： NR_ 024367.1. NCBI .2015,参见序列部分. Harvind S.Chahal 等.Genome-wide association study identifies 14 novel risk alleles associated with basal cell carcinoma. NATURE COMMUNICATION。
3、S .2016,第 7卷(第5期),第12510:1-10页. 杨竞成.整合微阵列数据筛选肺腺癌相关长 链非编码RNA及LINC00968在其中的表达研究. 中国优秀硕士学位论文全文数据库医药卫生科 技辑 .2015, (第12期),第E072-109页. 审查员 熊壮壮 (54)发明名称 一种长非编码RNA及其在诊断/治疗非小细 胞肺癌中的应用 (57)摘要 本发明 属于 基因 工 程 领 域 ， 特 别涉 及 LINC00111在制备预测非小细胞肺癌预后及靶点 药物治疗中的应用； 在NSCLC中LINC00111表达上 调， 通过改变LINC00111的表达对非小细胞肺癌 细胞的侵袭、 迁。
4、移等产生影响， 敲低LINC00111表 达能够抑制非小细胞肺癌细胞增殖和诱导细胞 凋亡。 权利要求书1页 说明书4页 序列表2页 附图4页 CN 106244592 B 2019.01.22 CN 106244592 B 1.检测长非编码RNA LINC00111的引物组在制备用于诊断非小细胞肺癌的试剂盒中的 应用， 其特征在于其核苷酸序列为SEQ ID NO： 2和SEQ ID NO： 3所示。 2.抑制长非编码RNA LINC00111的小干扰RNA在制备治疗非小细胞肺癌药物中的应用， 其特征在于： 核苷酸序列如SEQ ID NO： 4、 SEQ ID NO： 5或SEQ ID NO： 。
5、6所示。 权利要求书 1/1 页 2 CN 106244592 B 2 一种长非编码RNA及其在诊断/治疗非小细胞肺癌中的应用 技术领域 0001 本发明属于基因工程领域， 特别涉及一种长非编码RNA及其在诊断/治疗非小细胞 肺癌中的应用。 背景技术 0002 基因组学研究表明， 人类基因组约有20000个蛋白编码基因， 约总基因数比例的 2， 其余大多数基因被转录成非编码RNA(non-codingRNA， ncRNA)。 ncRNA依其长短， 可分为 转录起始RNA、 Piwi蛋白相互作用RNA， 微小RNA、 小核仁RNA和长非编码RNA(longnon- codingRNA， lncR。
6、NA)等。 LncRNA是一类转录本长度超过200个核苷酸且自身不编码蛋白的 RNA分子。 LncRNA起初被认为是RNA聚合酶II转录的副产物， 是基因组转录的 “噪音” ， 不具有 生物学功能。 然而， 最近的研究表明， 它们可以通过多种不同的机制、 在多种层面上影响基 因的表达水平。 LncRNAs调控基因表达的方式存在多样性， 表现在lncRNAs依赖的基因表达 调控机制的多样性。 在不同机制中， lncRNAs作用不同， 既可作为主要的转录调控因子， 又可 作为共调控因子之一， 与其他组分共同发挥调控作用。 lncRNAs对于基因表达调控的层次大 体上可分为： (1)表观修饰水平调控。
7、， 通过与各种染色质修饰酶相互作用， 对染色质进行修 饰， 改变其构象， 激活或抑制相关基因的表达。 尤其在胚胎发育阶段， lncRNAs参与引起可遗 传的等位基因后期表达沉默、 表观性状的维持， 对于多细胞动物的正常发育与细胞分化至 关重要。 (2)转录水平调控， LncRNAs通过调节转录因子的结合与装配， 与调控序列DNA形成 三链复合物， 调控RNA聚合酶II， 转录干扰等方法实现。 (3)转录后水平调控， 通过和互补的 mRNA形成dsRNA， 影响mRNA的加工、 剪接、 转运、 翻译和降解等过程， 从而调节基因的表达。 0003 LncRNAs因其在致癌与肿瘤抑制途径中显露出的潜。
8、在作用而成为肿瘤研究的新热 点。 近年来， 许多研究显示， 某些LncRNAs与相应的人类肿瘤密切相关。 通过调控一系列生物 功能或者干扰正常功能， 包括转录沉默、 可变剪接等方式， LncRNAs在肿瘤的发生发展中起 着重要作用。 0004 根据世界卫生组织(WHO)公布的资料显示， 肺癌的发病率和死亡率在世界各国均 呈明显上升的趋势， 尤其是工业发达的国家。 在发达国家， 肺癌是最常见的恶性肿瘤之一， 列男性常见恶性肿瘤的第一位， 列女性常见恶性肿瘤的第2、 3位。 20世纪末肺癌已占恶性肿 瘤死亡的首位。 非小细胞肺癌占所有肺癌的80， 可分为腺癌、 鳞癌、 大细胞肺癌等。 许多肺 癌患。
9、者在诊断时已发生转移， 往往失去手术机会， 而针对肺癌的化疗方案效果亦欠佳， 五年 生存率低于5， 亟需寻找新的、 有效的治疗肺癌的方法。 随着基因工程研究的深入， 科学家 对运用基因工程研制肿瘤药表现出浓厚的兴趣。 发明人发现LINC00111在治疗非小细胞肺 癌方面具有很好应用前景。 0005 LINC00111是一条长度为469bp的LncRNA， 是由发明人提供正常肺组织与肺癌组织 标本， 由博奥生物有限公司进行芯片制备筛选出的在肺癌组织中显著高表达的RNA。 LINC00111由发明人首次发现并命名， 具有新颖性。 说明书 1/4 页 3 CN 106244592 B 3 发明内容 。
10、0006 本发明的目的是提供用于诊断非小细胞肺癌(NSCLC)预后情况或作为治疗非小细 胞肺癌药物靶点的长非编码RNA(LINC00111)， 其核苷酸序列为SEQ ID NO： 1， 0007 SEQ ID NO： 1： 0008 TCCATACACTCCGTCTCCTGAAGGGGAAGCGGGCTCTTCTCAGATGCACAGGGACAATGTGAAAATCCT GTCCTCAGATTGAGAGGCTGTTTCGTGGGCACCGAATTCGGGGTCAGGAAAGCAGCCTGCATCCACGAGTATCCTCG GGTTACTAAGTGGGGCCAGTGGCTCCAGGTGTAAC。
11、CCATTTAAGTTTGCCAGACAGCCGGGATGTTCTGGTGAAGGA TCTGAAGTGTATGGCCACACCAGTCCCAGAAGAGCCTGGGAGAAGGGAAGATGGTGAACACAGTGGAGTTCTGCTGC AAAGCCGAAGATGGTTCTGGCACGTGGCATGACCCACATGACTCAACATCAGGAGATCTGACTTCATAAAAGTGAAC TATCACAATGCTGCTTTGCAAGCTGTGTGTGAGTGTAAAAGCGTTGAAACTTCCTCAATAAATGAAAAGATATCTTT AAAAAAAAAAAAAAA 0009 本发。
12、明还涉及长非编码RNA的标记物在制备判断非小细胞肺癌治疗预后情况的诊 断产品中的应用， 所述的标记物包括但不限于： 0010 (1)结合所述长非编码RNA的引物/引物组或荧光标记的结合所述长非编码RNA的 引物/引物组； 0011 (2)结合所述长非编码RNA的小分子化合物； 0012 (3)结合所述长非编码RNA的生物大分子， 所述的生物大分子包括但不限于： 抗体 或抗体功能片段、 荧光标记的抗体或抗体功能片段、 RNA结合蛋白或其功能片段、 荧光标记 的RNA结合蛋白或其功能片段。 0013 本发明还涉及针对长非编码RNA的引物组的核苷酸序列如SEQ ID NO： 2和SEQ ID NO：。
13、 3所示： 0014 SEQ ID NO： 2： F1： CCTGGGAGAAGGGAAGA； 0015 SEQ ID NO： 3： R1： AAGCAGCATTGTGATAGTT。 0016 本发明还涉及包括所述标记物的用于判断非小细胞肺癌治疗预后情况的试剂或 试剂盒。 0017 本发明还包括针对长非编码RNA的siRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO： 4、 SEQ ID NO： 5或SEQ ID NO： 6所示： 0018 SEQ ID NO： 4 CAGTGGCTCCAGGTGTAACCCATTT 0019 SEQ ID NO： 5 GGGATGTTCTGGTGAAGGATCTGAA。
14、 0020 SEQ ID NO： 6 CAACATCAGGAGATCTGACTTCATA 0021 本发明还包括所述的标记物的用于判断非小细胞肺癌治疗预后情况的试剂或试 剂盒。 0022 本发明还包括所述的抑制剂的用于治疗非小细胞肺癌的药物或药物组合物。 0023 技术方案 0024 以下通过实施例对本发明作进一步的阐述， 但不限制本发明。 0025 一般性说明： 0026 实施例中末注明具体条件的的实验方法， 基本上都按照Sambrook， J等人编著的 分子克隆实验指南(第3版) (MolecularCloning:ALaboratoryManual,3rded.黄培堂等 译， 科学出版社。
15、.2002.8)中所述的条件及方法或按照材料提供商所建议的条件及方法进 说明书 2/4 页 4 CN 106244592 B 4 行， 其它没有详细描述的技术相应于本领域人员来说是熟知的标准方法。 0027 本发明的材料： 本申请中提及的细胞株、 慢病毒干扰载体以及培养基均有商品供 应或以别的途径能为公众所得， 它们仅作举例， 对本发明不是唯一的， 可分别用其它适合的 工具和生物材料来代替。 0028 设计特异性的针对LINC00111的干扰序列， 以干扰GAPDH基因的序列片作为对照。 将合成的的siRNA转染非小细胞肺癌细胞株A549细胞， 起到下调LINC00111表达的作用。 附图说明。
16、 0029 图1qRT-PCR测正常肺上皮细胞株16HBE与非小细胞肺癌细胞株A549的LINC00111 表达水平， GAPDH设为内参。 0030 图2、 MTT法测改变LINC00111表达前后对非小细胞肺癌A549细胞株进行顺铂处理 的IC50。 0031 图3、 MTT法测改变LINC00111表达前后对非小细胞肺癌A549细胞株进行多西他赛 处理的IC50。 0032 图4、 流式细胞术测改变LINC00111表达前后非小细胞肺癌细胞株A549对于顺铂的 细胞凋亡变化， 其中a为A549/si-NC， b为A549/si-LINC00111， c为凋亡率比较。 0033 图5、 流。
17、式细胞术测改变LINC00111表达前后非小细胞肺癌细胞株A549对于多西他 赛的细胞凋亡变化， 其中a为A549/si-NC， b为A549/si-LINC00111， c为凋亡率比较。 具体实施方式 0034 实施例1LINC00111在非小细胞肺癌中表达水平的基础验证试验 0035 (一)： LINC00111在正常肺组织与肺癌组织中的表达情况 0036 1.芯片制备及分析:按照博奥生物有限公司的要求准备正常肺组织与肺癌组织标 本， 交由博奥生物有限公司进行芯片制备， 人类长链非编码RNA芯片V1.0版本完成芯片分 析。 0037 2.芯片结果分析:LINC00111在肺癌中的表达量较正。
18、常肺组织中上调了29.08倍； 提示LINC00111在肺癌中可能作为一个癌基因发挥作用。 0038 (二)： qRT-PCR分析LINC00111在正常肺上皮细胞株16HBE与非小细胞肺癌细胞株 A549中的表达量 0039 1.方法： Trizol试剂提取细胞总RNA， qRT-PCR运用SYBRGreenPCRMasterMix (TAKARA， 大连， 中国)， 人GAPDH作为内参。 0040 2.qRT-PCR结果： 如图1所示。 0041 3.结果分析： LINC00111在16HBE中低表达， 在A549中高表达。 0042 实施例2抑制LINC00111表达对于非小细胞肺癌的。
19、治疗作用 0043 1.流式细胞仪检测细胞凋亡： 0044 LINC00111的siRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO： 4、 SEQ ID NO： 5或SEQ ID NO： 6所 示： 0045 SEQ ID NO： 4 CAGTGGCTCCAGGTGTAACCCATTT 0046 SEQ ID NO： 5 GGGATGTTCTGGTGAAGGATCTGAA 说明书 3/4 页 5 CN 106244592 B 5 0047 SEQ ID NO： 6 CAACATCAGGAGATCTGACTTCATA 0048 以干扰GAPDH基因的序列片作为对照， 并将其插入慢病毒载体中(以上载体及片。
20、段 由invitrogen公司合成)。 将包装好的慢病毒载体感染非小细胞肺癌细胞株A549细胞， 起到 下调LINC00111表达的作用， 48h后用G418筛选稳定转染细胞系， 命名为A549/si-LINC00111 (对照为A549/si-NC)。 构建si-LINC00111慢病毒干扰载体感染A549细胞株(A549/si- LINC00111)。 空载体转染A549细胞株(A549/si-NC)设为对照组。 将这些细胞株种在6孔板 上， 3105个细胞/孔。 每组给予顺铂或多西他赛处理， 48h后流式细胞术测细胞凋亡水平。 0049 与对照组相比， 感染LINC00111慢病毒干扰载。
21、体后， 给予顺铂或多西他赛处理均出 现细胞凋亡增多， 提示降低LINC00111表达可增加非小细胞肺癌细胞对化疗药物的敏感性， 并诱导细胞凋亡， 结果参见说明书附图4、 5。 0050 2细胞周期检测 0051 流式细胞仪检测细胞周期： 构建LINC00111慢病毒干扰载体感染A549细胞株 (A549/si-LINC00111)， 空载体转染A549细胞株(A549/si-NC)设为对照组。 将这些细胞株种 在6孔板上， 3105个细胞/孔。 每组给予顺铂或多西他赛处理， 24h后流式细胞术测细胞周 期。 0052 A549感染LINC00111慢病毒干扰载体后与对照组相比， 给予顺铂或多西。
22、他赛处理 均出现细胞周期G1期阻滞增加， 提示降低LINC00111表达可抑制非小细胞肺癌细胞的增殖。 0053 上述实验结果提示降低LINC00111表达能够增加非小细胞肺癌细胞对化疗药物的 敏感性， 并促进细胞的凋亡， 可作为肿瘤治疗的干预靶点， 结果参见说明书附图4、 5。 0054 实施例3细胞耐药相关实验 0055 1.MTT测细胞IC50： 构建LINC00111慢病毒干扰载体转染A549细胞株(A549/si- LINC00111)， 空载体转染A549细胞株(A549/si-NC)设为对照组。 将这些细胞株种在96孔板 上， 2500个细胞/孔。 每组给予顺铂或多西他赛处理， 。
23、给药3天后MTT染色法检测细胞活力， 进 而计算各自的药物IC50。 0056 2.结果测定:如图2、 3所示。 0057 3 .结果分析:在A549细胞株中， 给予DDP处理的si-LINC00111实验组IC50： 11.01ug/ml， 对照组IC50(NC)： 23.26ug/ml； 给予DTX处理的A549/si-LINC00111实验组 IC50:13.42ug/ml， 对照组IC50(NC):25.69ug/ml。 观察到此现象， 提示降低LINC00111表达 可以促进非小细胞肺癌细胞凋亡， 提高细胞化疗敏感。 说明书 4/4 页 6 CN 106244592 B 6 0001 序列表 1/2 页 7 CN 106244592 B 7 0002 序列表 2/2 页 8 CN 106244592 B 8 图1 图2 说明书附图 1/4 页 9 CN 106244592 B 9 图3 说明书附图 2/4 页 10 CN 106244592 B 10 图4 说明书附图 3/4 页 11 CN 106244592 B 11 图5 说明书附图 4/4 页 12 CN 106244592 B 12 。