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1、(10)授权公告号 CN 101696407 B (45)授权公告日 2011.06.15 CN 101696407 B *CN101696407B* (21)申请号 200910236538.1 (22)申请日 2009.10.30 C12N 11/10(2006.01) C12P 11/00(2006.01) (73)专利权人 北京工商大学 地址 100048 北京市海淀区阜成路 33 号 (72)发明人 王静 王成涛 曹雁平 孙宝国 (54) 发明名称 一种壳聚糖固定化蒜氨酸酶及制备大蒜素方 法 (57) 摘要 本发明涉及一种壳聚糖固定化蒜氨酸酶及制 备大蒜素方法。 大蒜具有消炎、 杀菌。
2、、 抗病毒、 降血 压， 抗氧化、 抗血栓、 抗肿瘤、 调节机体免疫力等多 种功效， 具有显著的保健作用和药用价值。 大蒜具 有的这些功效和大蒜中的大蒜素有关。大蒜素是 大蒜中的蒜氨酸酶催化蒜氨酸水解得到的含硫有 机化合物， 其化学名称为二烯丙基硫代亚磺酸脂。 大蒜素具有接近生蒜的香气和辛辣味， 纯天然， 安 全， 健康， 广泛应用于食品成味添加剂、 保健食品、 食用调和油等。本发明采用壳聚糖对蒜氨酸酶进 行固定化， 利用固定化蒜氨酸酶转化蒜氨酸生成 大蒜素， 提高蒜氨酸酶的稳定性和酶促反应速度， 提高大蒜素得率。 (51)Int.Cl. 审查员 黄磊 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (。
3、12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 2 页 CN 101696407 B1/1 页 2 1. 一种利用壳聚糖固定化蒜氨酸酶的方法， 包括以下步骤 ： a. 壳聚糖微球的制备 ： 将壳聚糖溶解在 0.5的醋酸溶液中， 制成 2的壳聚糖溶液， 用注射器将壳聚糖溶液滴加到含有 10的氢氧化钠、 95乙醇溶液中， 制成 2-3mm 左右的 壳聚糖微球， 用蒸馏水洗至中性， 保存在蒸馏水中备用 ； b. 壳聚糖的交联及微球载体的制备 ： 取壳聚糖微球与 0.5 -5的戊二醛溶液反应 30-60min， 用无水乙醇清洗数次， 再用蒸馏水洗涤 3-5 次， 真空抽滤干燥， 得到壳聚糖微球 载体， 在。
4、 4冰箱中封闭保存备用 ； c. 蒜氨酸酶固定化 ： 在 4条件下， 取制备好的壳聚糖微球载体加入一定量的蒜氨酸 酶溶液中， 中速摇床振荡 3-10h， 取出后用蒸馏水洗去残留的壳聚糖微球表面的酶， 至冲洗 液中无酶活性检出， 真空抽滤干燥， 即得到固定化蒜氨酸酶， 将此固定化酶浸于 0.1mol/L pH 为 6.5 的磷酸缓冲液中， 在 4保存备用 ； 2. 一种利用壳聚糖固定化蒜氨酸酶制备大蒜素的方法， 其特征在于将权利要求 1 所述 制备方法制备得到的固定化蒜氨酸酶固定于生物流化床反应器内连续循环式利用固定化 蒜氨酸酶催化底物转化生成大蒜素。 权 利 要 求 书 CN 10169640。
5、7 B1/2 页 3 一种壳聚糖固定化蒜氨酸酶及制备大蒜素方法 技术领域 0001 本发明涉及一种壳聚糖固定化蒜氨酸酶及制备大蒜素方法， 属于食品、 医药技术 领域， 应用于功能食品、 保健品、 医药、 饲料等行业。 背景技术 0002 大蒜 (garlic) 属百合科葱属植物蒜 (Alium Sativam L.) 的鳞茎， 大蒜具有特殊 的香辛气味， 能促进消化、 增进食欲， 有效地抑制或杀灭一些革兰氏阳性和阴性细菌及许多 真菌。 现代医学已证实， 大蒜具有消炎、 杀菌、 抗病毒、 降血压， 抗氧化、 抗血栓、 抗肿瘤、 调节 机体免疫力等多种功效， 具有显著的保健作用和药用价值。 近来研。
6、究还发现， 大蒜能阻止亚 硝胺在人体内的合成、 阻止癌细胞在人体内的扩散， 所以它还具有防癌作用。 大蒜具有的这 些功效和大蒜中的大蒜素有关。大蒜素是大蒜中的蒜氨酸酶 (alliinase， EC4.4.1.4) 催化 蒜氨酸 (alliin， 烯丙基硫代半胱氨酸亚砜 ) 生成的含硫有机化合物， 其化学名称为二烯丙 基硫代亚磺酸酯， 分子量为 162.26， 其结构式如下图所示 0003 0004 大蒜素具有多种生理和保健功能。其作用表现在 ： 抑菌杀菌。对大肠杆菌、 沙门 氏菌、 金黄色葡萄球菌、 痢疾杆菌、 伤寒杆菌、 肺炎球菌， 链球菌等有害菌有明显抑制和杀灭 作用， 对有益菌如干酪乳杆。
7、菌则无抑制作用。 可以预防多种疾病， 常有人用大蒜来治疗感冒 及慢性肠炎。保护心血管系统和降血脂作用。大蒜素可改善微循环， 增加外周血流量， 抑 制凝血因子的活性， 有明显的抗动脉粥样硬化作用， 对高胆固醇血症引起的主动脉粥样硬 化具有较好的保护作用。预防肿瘤作用。大蒜素能抑制和干扰多种化学性致癌物， 阻断 致癌物对正常细胞产生的诱变过程(如苯并芘的致癌过程)， 参与细胞遗传物质DNA正常的 分裂和修复过程， 能够预防肺癌、 肝癌、 食道癌的发生 ； 大蒜素中二烯丙基硫是非常重要的 抗癌因子， 通过防止致癌物形成， 干扰致癌物的活化， 增强解毒性能， 避免正常细胞向癌细 胞的转化， 进一步阻止。
8、肿瘤细胞的形成。诱食增食。散发独特的大蒜香味， 使动物产生食 欲感， 使之迅速摄食 ； 同时摄取后可增强胃液分泌和胃肠蠕动， 促进消化， 能够起到显著的 调节肠胃功效大蒜素可诱导人淋巴细胞转化， 增加 T 淋巴细胞转化， 增加巨噬细胞和淋 巴细胞的功能活动， 增强机体免疫功能。 因此， 大蒜素广泛用于功能食品、 临床医药， 及饲料 添加剂中。 0005 研究发现未破损的新鲜大蒜中没有游离的大蒜素， 只有它的前体物质即蒜氨酸 (S-烯丙基-L-半胱氨酸亚砜(S-allyl-L-cysteine sulfoxide ； alliin)， 蒜氨酸酶和它的 天然底物蒜氨酸存在于大蒜的不同部位， 只有当。
9、大蒜破损， 两者才能相互接触， 蒜氨酸酶将 蒜氨酸催化分解为大蒜素。因此， 在大蒜素形成过程中， 蒜氨酸和蒜氨酸酶起着重要作用。 0006 为提高大蒜素得率， 便于连续化生产， 本发明利用壳聚糖对蒜氨酸酶进行固定化， 利用固定化的蒜氨酸酶催化蒜氨酸转化为大蒜素， 提高蒜氨酸酶的稳定性和酶促反应速 说 明 书 CN 101696407 B2/2 页 4 度， 提高蒜氨酸的转化率和大蒜素的得率。 发明内容 0007 本发明提供了一种壳聚糖固定化蒜氨酸酶及制备大蒜素方法， 该技术方法利用壳 聚糖固定化蒜氨酸酶， 催化蒜氨酸转化生成大蒜素， 提高蒜氨酸转化率和大蒜素得率。 0008 本发明的技术方案 。
10、： 0009 本发明是一种壳聚糖固定化蒜氨酸酶及制备大蒜素方法， 固定化酶特征为以壳聚 糖为固定化材料， 采用交联 - 吸附相结合的方法固定化蒜氨酸酶， 利用固定化蒜氨酸酶连 续式(或间歇式)催化蒜氨酸转化为大蒜素， 提高蒜氨酸酶的稳定性， 提高蒜氨酸转化率和 大蒜素得率。 0010 本发明是通过以下技术方法实现的 ： (1) 壳聚糖微球的制备 ； (2) 壳聚糖的交联及 微球载体的制备 ； (3) 蒜氨酸酶固定化 ； (4) 固定化蒜氨酸酶催化蒜氨酸生成大蒜素。 0011 本发明的技术效果 0012 大蒜破碎后可释放蒜氨酸酶， 该酶可催化蒜氨酸转化生成大蒜素， 但蒜氨酸酶不 稳定， 容易失活。
11、， 造成酶的利用率， 产物得率低， 而且生成的产物大蒜素需要进行复杂的分 离过程， 才能将其从反应体系中分离出来。本发明是通过戊二醛交联方式将蒜氨酸酶固定 在壳聚糖微球中， 利用固定化蒜氨酸酶可以连续或间歇地催化蒜氨酸转化为产物大蒜素， 提高了酶促反应速度， 提高了蒜氨酸的转化效率和产物得率， 同时省略了产物分离过程， 降 低了生产成本。 具体实施方式 0013 本发明通过以下 5 个步骤具体实施 ： 0014 (1) 壳聚糖微球的制备 ： 将壳聚糖溶解在 0.5的醋酸溶液中， 制成 2的壳聚糖 溶液。用注射器将壳聚糖溶液滴加到含有 10的氢氧化钠和 95乙醇溶液中， 制成 2-3mm 左右的。
12、壳聚糖微球， 用蒸馏水洗至中性， 保存在蒸馏水中备用。 0015 (2) 壳聚糖的交联及微球载体的制备 ： 取壳聚糖微球与 0.5 -5的戊二醛溶液 反应 30-60min， 用无水乙醇清洗数次， 再用蒸馏水洗涤 3-5 次， 真空抽滤干燥， 得到壳聚糖 微球载体， 在 4冰箱中封闭保存备用。 0016 (3) 蒜氨酸酶固定化 ： 在 4条件下， 取制备好的壳聚糖微球载体加入一定量的 蒜氨酸酶溶液中， 中速摇床振荡 3-10h， 取出后用蒸馏水洗去残留在壳聚糖微球表面的酶， 至冲洗液中无酶活性检出。真空抽滤干燥， 即得到固定化蒜氨酸酶， 将此固定化酶浸于 0.1mol/L 磷酸缓冲液 (pH6.5) 中， 4保存备用。 0017 (4) 固定化蒜氨酸酶催化蒜氨酸生成大蒜素 ： 将固定化蒜氨酸酶膜固定于生物流 化床反应器内， 底物蒜氨酸溶液 ( 或大蒜提取液 ) 进入生物流化床反应器， 在 30-50条件 下， 固定化蒜氨酸酶催化底物转化生成大蒜素。 说 明 书 。