具有改善并稳定化的活性的固定化界面酶.pdf

本发明公开了一种通过以下步骤制备固定于不溶性载体上的界面酶的方法：提供由水性缓冲溶液和至少一种第一有机溶剂组成的双相体系；将所述界面酶与所提供的双相体系混合；将所述载体加入到所获得的混合物中并进行混合；从上一步所获得的混合物中分离出固定在所述载体上的界面酶而进行。所生成的酶被锁定在其催化活性构象，因而显示出改善的活性和稳定性。本发明还公开了所生成酶的应用，特别是在生物柴油的制备中的应用。

1.一种制备固定于不溶性多孔载体上的界面酶的方法，所述方法包括下列步骤：(a)提供由水性缓冲溶液和至少一种第一有机溶剂组成的双相体系，所述第一有机溶剂是能够在与水混合时形成双相的疏水性溶剂，其中，所述第一有机溶剂选自烷类、醇类、醛类和酮类以及它们的至少两种的任何混合物；(b)将所述界面酶与步骤(a)所提供的双相体系混合；(c)将所述载体加入到步骤(b)的混合物中并进行混合；(d)从步骤(c)所获得的混合物中分离出固定在所述载体上的界面酶；其中，在将所述载体加入到步骤(b)中获得的酶双相溶液之前，将所述载体用溶于第二有机溶剂中的表面活性剂处理，并在所述处理后将该溶剂蒸发，从而获得均匀地覆盖有表面活性剂的载体，所述第二有机溶剂是能够使所述表面活性剂溶解的有机溶剂，所述第二有机溶剂选自烷类、醚类、酮类和醇类以及它们的至少两种的任何混合物，并且其中，所述界面酶是脂肪酶或磷脂酶。 2.一种制备固定于不溶性多孔载体上的界面酶的方法，所述方法包括下列步骤：(a)提供由水性缓冲溶液和至少一种第一有机溶剂组成的双相体系，所述第一有机溶剂是能够在与水混合时形成双相的疏水性溶剂，其中，所述第一有机溶剂选自烷类、醇类、醛类和酮类以及它们的至少两种的任何混合物；(b)将所述界面酶与步骤(a)所提供的双相体系混合；(c)将所述载体加入到步骤(b)的混合物中并进行混合；(d)从步骤(c)所获得的混合物中分离出固定在所述载体上的界面酶；其中，在将所述载体加入到步骤(b)中获得的酶双相溶液之前，将所述载体用溶于第二有机溶剂中的表面活性剂处理，并在所述处理后将该溶剂蒸发，从而获得均匀地覆盖有单层表面活性剂的载体，所述第二有机溶剂是能够使所述表面活性剂溶解的有机溶剂，所述第二有机溶剂选自烷类、醚类、酮类和醇类以及它们的至少两种的任何混合物，并且其中，所述界面酶是脂肪酶或磷脂酶。 3.如权利要求1或2所述的方法，其中，必要时将所述载体洗涤以除去盐和有机物质，然后用所述表面活性剂处理。 4.如权利要求1或2所述的方法，其中，所述不溶性多孔载体能够通过吸附或通过与官能团的共价结合来与所述酶结合。 5.如权利要求4所述的方法，其中，所述多孔载体是有机多孔载体或无机多孔载体。 6.如权利要求5所述的方法，其中，所述无机多孔载体是二氧化硅或氧化铝类载体。 7.如权利要求5所述的方法，其中，所述有机多孔载体是聚合物类载体。 8.如权利要求5～7中任一项所述的方法，其中，所述载体含有选自环氧基、醛基和离子基团的活性官能团。 9.如权利要求1或2所述的方法，其中，所述表面活性剂选自糖脂肪酸酯、聚氧乙烯糖脂肪酸酯或醚、中链或长链烷基糖苷、磷脂、聚乙二醇衍生物和季铵盐。 10.如权利要求1或2所述的方法，其中，所述酶源自南极假丝酵母(Candida antarctica)、皱褶假丝酵母(Candida rugosa)、米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)、假单胞菌(Pseudomonas sp.)、雪白根霉(Rhizopus niveus)、爪哇毛霉(Mucor javanicus)、米根霉(Rhizopus oryzae)、黑曲霉(Aspergillus niger)、卡门柏青霉(Penicillium camembertii)、产碱杆菌(Alcaligenes sp.)、伯克霍尔德氏菌(Burkholderia sp.)、疏绵状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosa)、粘稠色杆菌(Chromobacterium viscosum)、木瓜籽和胰酶中的任何一种。 11.一种固定于固体多孔载体上的界面酶，所述界面酶能够通过权利要求1～10的方法获得，其中，所述酶是脂肪酶或磷脂酶，所述酶被锁定在其催化活性构象，并且所述载体均匀地覆盖有表面活性剂。 12.一种固定于固体多孔载体上的界面酶，其中，所述酶被锁定在其催化活性构象并且所述载体均匀地覆盖有单层表面活性剂，并且，所述酶是脂肪酶或磷脂酶。 13.如权利要求11或12所述的酶，其中，所述载体能够通过吸附或通过与官能团的共价结合来与所述酶结合。 14.如权利要求13所述的酶，其中，所述载体为有机载体或无机载体。 15.如权利要求14所述的酶，其中，所述载体是选自二氧化硅或氧化铝类载体的无机载体。 16.如权利要求14所述的酶，其中，所述载体是有机聚合物类载体。 17.如权利要求14所述的酶，其中，所述载体是离子交换树脂。 18.如权利要求11或12所述的酶，其中，所述表面活性剂选自糖脂肪酸酯、聚氧乙烯糖脂肪酸酯或醚、中链或长链烷基糖苷、磷脂、聚乙二醇衍生物和季铵盐。 19.如权利要求11或12所述的酶，其中，所述酶源自南极假丝酵母(Candida antarctica)、皱褶假丝酵母(Candida rugosa)、米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)、假单胞菌(Pseudomonas sp.)、雪白根霉(Rhizopus niveus)、爪哇毛霉(Mucor javanicus)、米根霉(Rhizopus oryzae)、黑曲霉(Aspergillus niger)、卡门柏青霉(Penicillium camembertii)、产碱杆菌(Alcaligenes sp.)、伯克霍尔德氏菌(Burkholderia sp.)、疏绵状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosa)、粘稠色杆菌(Chromobacterium viscosum)、木瓜籽和胰酶中的任何一种。 20.一种用于制备结构化蜡酯的酶促方法，所述方法包括将甘油三酯原料与醇在权利要求19所定义或者通过权利要求10的方法所制备的固定化脂肪酶的存在下反应的步骤，其中，所述蜡酯含有起始原材料所固有的表面活性成分，从而所述蜡酯拥有改善的水分散性。 21.如权利要求20所述的方法，其中所述醇为C烷醇。 22.如权利要求21所述的方法，其中所述醇为十六烷醇。 23.一种制备脂肪酸甲酯的方法，所述方法包括下列步骤：逐步将甲醇加入到含有脂肪酶的植物油、动物油、海藻油或鱼油或者至少两种上述油的混合物中，所述脂肪酶如权利要求11～19中任一项所定义或通过权利要求1～10中任一项所述方法所制备；并使反应在适当条件下进行直到所述油类甘油三酯被转化为脂肪酸甲酯。 24.如权利要求23所述的方法，其中，所述植物油是大豆油、芥花籽油、油菜籽油、橄榄油、棕榈油、葵花籽油、花生油、棉花籽油、废烹调油或源自可食用植物原料的任何油类甘油三酯。

技术领域

本发明涉及固定化界面酶，特别是涉及具有改善的活性和稳定性的 脂肪酶和磷脂酶以及其它水解酶。本发明还涉及制备这类酶的方法，以 及它们的各种工业应用和研究性应用。

背景技术

界面酶是一类在它们的蛋白结构中由两个域组成的酶；第一个域是 亲水域，而第二个域是疏水域。这个独特的特性使得这一酶类一旦存在 于两相体系中时就会偏好界面区域。在这种情况下，形成了活性构象， 其中酶分子的亲水域朝向水层而疏水域朝向疏水层。

脂肪酶和磷脂酶是最常见的界面酶，其一旦存在于界面体系中就表 达其催化活性。脂肪酶(甘油三酯水解酶E.C.3.1.1.3)被定义为作用于水性 体系中的甘油三酯的酯键以产生游离脂肪酸、偏甘油酯和甘油的水解酶。 磷脂酶也属于水解酶类，然而它们有利地且特异性地切断存在于水性体 系中的磷脂的酯键，从而根据磷脂酶的类型而产生游离脂肪酸、溶血磷 脂、甘油磷酯、磷脂酸和游离醇。

脂肪酶和磷脂酶广泛分布于动物、植物和微生物中。过去二十年间 对脂肪酶和磷脂酶的工业应用的兴趣快速增长。已经发现在低的水活性 下这类酶催化它们的逆水解反应。脂肪酶和磷脂酶的逆催化活性已经被 广泛用于含酯键和酰胺键的有价值的化合物或含有如羟基、羧基和氨基 等官能团的其它相关化学物质的合成。具体而言，脂肪酶和磷脂酶已经 被用于重整脂肪、油、蜡、磷脂和鞘脂以获得新的期望的功能性质，还 用于将光学活性的化合物从它们的外消旋混合物中分离。特别有意义的 是，本文将公开界面酶在独特的蜡酯和短链烷基酯(生物柴油)的合成中的 应用。

目前，超过40种的不同脂肪酶和磷脂酶可商购获得，然而其中仅有 少数是以商业化量制备的。一些最有工业前景的界面酶源自南极假丝酵 母(Candida antarctica)、皱褶假丝酵母(Candida rugosa)、米黑根毛霉 (Rhizomucor miehei)、假单胞菌(Pseudomonas sp.)、雪白根霉(Rhizopus niveus)、爪哇毛霉(Mucor javanicus)、米根霉(Rhizopus oryzae)、黑曲霉 (Aspergillus niger)、卡门柏青霉(Penicillium camembertii)、产碱杆菌 (Alcaligenes sp.)、伯克霍尔德氏菌(Burkholderia sp.)、疏绵状嗜热丝孢菌 (Thermomyces lanuginosa)、粘稠色杆菌(Chromobacterium viscosum)、木瓜 籽和胰酶。

酶的固定化已经被大量技术所说明，这些技术基本上针对降低在整 个方法中酶所占的成本、帮助从产物中回收酶和使得方法能够连续运行。 固定化技术通常根据如下条件划分：

1.酶在如二氧化硅和不溶性聚合物等固体载体上的物理吸附。

2.酶在离子交换树脂上的吸附。

3.酶与如环氧化无机载体或环氧化聚合物载体等固体载体材料的 共价结合。

4.酶在增长中的聚合物内的包埋。

5.酶在膜反应器或半渗透性凝胶中的封闭。

6.交联酶晶体(CLECS’s)或交联酶聚集体(CLEAS’s)。

所有上述的酶固定化程序都由下列步骤组成：

1.将酶溶解在对于pH、温度、缓冲盐类型和离子强度而言适当的缓 冲体系中。

2.将固体载体加入到酶溶液中并混合一段时间，直至酶分子被固定 在固体载体上。

3.过滤出含有固定化酶的固体载体。

4.以适当缓冲液洗涤所述载体以除去松散结合的酶分子，然后干燥 所述固体载体。

界面酶，主要是脂肪酶，已经按照上述技术而被固定化。这些技术 提供了拥有较低的合成活性和/或较短的工作半衰期的固定化酶制品。为 了试图增加固定化的脂肪酶和其它界面酶的合成活性，已应用了各种激 活方法。这些方法包括：

1.将酶的表面官能团与如脂肪酸或聚乙二醇等疏水残基结合。

2.用如多元醇脂肪酸酯等表面活性剂涂覆酶表面。

3.将酶与疏水载体接触，所述疏水载体通常为聚丙烯并且已经用如 乙醇或异丙醇等亲水溶剂预处理过。

4.在反应体系中加入低浓度(通常低于1％)的如盐溶液、甘油等酶激 活剂。

对于用于以工业量进行酶促逆转化的固定化界面酶的激活、稳定化 和成本效益而言，上述方法都没有产生满意的结果。此外，据报道在按 照上述程序固定化时，由于受所述固定化程序强加的某些约束，大多数 酶要么丧失了它们的极大部分合成活性，要么无法展现出它们完全的活 性性能。例如，以多元醇脂肪酸酯涂覆脂肪酶和磷脂酶遭遇到了严重挑 战，此时脂肪酶分子不是完全涂覆有激活剂；因此没有与激活剂接触的 那些酶分子仍然没有活性。

因此，本发明的一个目标是提供一种获得高度活性并稳定的用于合 成应用的固定化界面酶、特别是脂肪酶和磷脂酶的新方法。特别有意义 的是，这些酶可以用于蜡酯和生物柴油的合成。

本发明的另外一个目标是提供用于各种工业过程以及研究性过程中 的高度活性的、稳定的固定化界面酶。

随着说明的展开，本发明的这些目标和其它目标将变得显而易见。

发明内容

本发明涉及一种制备固定于不溶性载体上的界面酶的方法，所述方 法包括如下步骤：

(a)提供由水性缓冲溶液和至少一种第一有机溶剂组成的双相体系；

(b)将所述界面酶与步骤(a)所提供的双相体系混合；

(c)将所述载体加入到步骤(b)的混合物中并进行混合；

(d)从步骤(c)所获得的混合物中分离出固定在所述载体上的界面 酶。

在与酶双相溶液混合之前，必要时可将所述载体洗涤以除去盐和有 机物质，然后用溶于第二有机溶剂中的表面活性剂处理。

所述不溶性载体能够通过吸附或通过与官能团的共价结合来与界面 酶结合。所述载体优选为有机多孔载体或无机多孔载体，优选地选自由 多孔无机载体(如二氧化硅或氧化铝类载体)和有机载体(如聚合物类载体) 组成的组，其中所述载体可任选地含有如环氧基或醛基等活性官能团或 者离子基团。

在本发明的方法中，所述第一有机溶剂选自烷类(如辛烷)、醇类(如 正辛醇)、醛类(如癸醛)和酮类(如2-辛酮)以及它们的任何混合物。

所述表面活性剂优选为但不限于糖脂肪酸酯、聚氧乙烯糖脂肪酸酯 或聚氧乙烯糖醚、中链或长链烷基糖苷、磷脂、聚乙二醇衍生物或季铵 盐。

所述第二有机溶剂可以为烷类(优选正己烷)、醚类(优选乙醚)、酮类 (优选丙酮)和醇类(优选异丙醇)以及它们的任何混合物。

要通过本发明的方法制备的界面酶优选为脂肪酶或磷脂酶。具体的 非限制性实例是源自南极假丝酵母(Candida antarctica)、皱褶假丝酵母 (Candida rugosa)、米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)、假单胞菌 (Pseudomonas sp.)、雪白根霉(Rhizopus niveus)、爪哇毛霉(Mucor javanicus)、米根霉(Rhizopus oryzae)、黑曲霉(Aspergillus niger)、卡门柏 青霉(Penicillium camembertii)、产碱杆菌(Alcaligenes sp.)、伯克霍尔德氏 菌(Burkholderia sp.)、疏绵状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosa)、粘稠 色杆菌(Chromobacterium viscosum)、木瓜籽和胰酶的酶。

在另一方面，本发明涉及固定于固体多孔载体上并且锁定在其活性 构象的界面酶。

在本发明的固定化酶的一个优选实施方式中，所述载体均匀地覆盖 有表面活性剂，优选为单层的所述表面活性剂。所述载体能够通过吸附 或通过与官能团的共价结合来与所述酶结合，并且可以为有机载体或无 机载体，优选地选自如二氧化硅或氧化铝类载体等无机载体和如聚合物 类载体等有机载体，并且所述载体可以含有如环氧基或醛基等活性官能 团和离子基团，或者所述载体是离子交换树脂。

在本发明的酶制品中，所述表面活性剂优选为但不限于糖脂肪酸酯、 聚氧乙烯糖脂肪酸酯或聚氧乙烯糖醚、中链或长链烷基糖苷、磷脂、聚 乙二醇衍生物或季铵盐。

本发明的固定化界面酶优选为脂肪酶或磷脂酶。具体实例是源自南 极假丝酵母(Candida antarctica)、皱褶假丝酵母(Candida rugosa)、米黑根 毛霉(Rhizomucor miehei)、假单胞菌(Pseudomonas sp.)、雪白根霉(Rhizopus niveus)、爪哇毛霉(Mucor javanicus)、米根霉(Rhizopus oryzae)、黑曲霉 (Aspergillus niger)、卡门柏青霉(Penicillium camembertii)、产碱杆菌 (Alcaligenes sp.)、伯克霍尔德氏菌(Burkholderia sp.)、疏绵状嗜热丝孢菌 (Thermomyces lanuginosa)、粘稠色杆菌(Chromobacterium viscosum)、木瓜 籽和胰酶的酶。

在另一个实施方式中，本发明涉及一种用于制备结构化蜡酯的酶促 方法，所述结构化蜡酯含有起始原材料所固有的表面活性成分，所述方 法包括将原始蜡原料与醇在本发明的固定化脂肪酶或通过本发明的方法 制备的固定化脂肪酶的存在下反应的步骤。在该方法中，所得的结构化 蜡酯含有起始原材料所固有的表面活性成分，从而所述蜡酯拥有改善的 水分散性。

在一个具体实施方式中，本发明涉及一种制备脂肪酸短链烷基酯、 优选为脂肪酸甲酯(生物柴油)的方法，所述方法包括逐步将甲醇加入到含 有本发明的脂肪酶或通过本发明的方法制备的脂肪酶的植物油、动物油、 海藻油或鱼油或者至少两种上述油的混合物中，并使反应在适当条件下 进行，直到所述油类甘油三酯被转化为脂肪酸甲酯。

在该方法中，所述植物油可以为但不限于大豆油、芥花籽油、油菜 籽油、橄榄油、棕榈油、葵花籽油、花生油、棉花籽油、废烹调油或源 自可食用植物原料的任何油类甘油三酯。

附图说明

图1：界面区域内酶的激活过程及随后在载体上的酶固定化过程的 示意性说明。

图2：固定于单层表面活性剂覆盖的多孔载体上的被“锁定”在其活性 构象的界面酶。

具体实施方式

为了搜寻一种用于制备高度活性并且稳定的固定化界面酶的新方 法，本发明人开发了一种两步技术，基本如下：

步骤1：通过将界面酶分子混合到由水相和疏水有机相组成的双相 体系中来强迫所有界面酶分子采用其活性构象(参见图1(A和B))。

步骤2：将合适的载体加入到已经含有所述酶的双相体系中(参见图 1(B和C))。

所述载体的主要特点是其将自己定位到所述双相体系的界面中的能 力。

在这种情况下，可以通过简单吸附、与含有官能团(如环氧基或醛基 等)的活化树脂共价结合或通过在离子交换树脂上的吸附来轻易地将位于 双相界面处的活性酶分子固定到所述载体上。

在本发明的活性固定化界面酶的制备中采用了该两步技术。

因此，在第一实施方式中，本发明涉及一种用于制备稳定、高度活 性的固定化界面酶、特别是脂肪酶和磷脂酶的方法，其中，提供由水性 缓冲溶液和至少一种第一有机溶剂组成的双相体系；将所述界面酶与所 述双相体系混合；将固体载体加入到所述混合物中；并且分离出固定在 所述载体上的界面酶。

使用特征为偏好双相体系的界面区域的特定载体，它“钓”出了界面 处存在的酶分子，从而所述酶被锁定在其活性构象。所述载体的亲和力 将取决于其孔隙度、溶胀性质以及分散性，而这取决于该载体的极性和 溶剂的极性。在双相体系中，亲水载体偏好水而疏水载体偏好非极性有 机溶剂。

本发明人发现，为了改善载体对界面区域的亲和力，可以以单层的 表面活性剂覆盖载体(可以是亲水或疏水的)的表面区域。这导致载体在存 在于双相体系中时偏好界面区域。因此，该特点改善了载体捕获“锁定” 在其活性构象的界面酶的能力。因此，本发明提供了用于钓取酶并将其 稳定在其活性构象的有效工具，而不是如本领域已知的扩散到载体内的 酶。

因此，为了增强固体基质在双相界面中的定位，可以将固体基质、 优选为多孔基质(也可以使用非多孔基质)如下文详细说明的那样进行修 饰，从而使所述基质均匀覆盖有表面活性剂。经修饰的载体的主要特点 是它倾向于定位在疏水-亲水双相体系中产生的界面中。

因此，在该优选实施方式中，在与酶双相溶液混合之前，将所述固 体载体以溶于第二有机溶剂中的表面活性剂预处理。通常，首先将所述 载体(优选为多孔载体，但也可以为非多孔载体)清洁除去任何吸附的盐和 有机残留物，然后将其干燥以除去任何残留水分，然后与含有表面活性 剂的低蒸发有机溶剂(例如，正己烷、异丙醇、乙醇、甲苯、乙腈和类似 溶剂)混合。然后除去有机溶剂，从而产生了均匀地覆盖有表面活性剂的 干燥的多孔固体载体。然而，本发明的方法也可以用未经修饰的(未处理 过的)载体来进行。

表面活性剂可以为非离子型或离子型(阴离子型或阳离子型)，例如但 不限于糖脂肪酸酯、聚氧乙烯糖脂肪酸酯或聚氧乙烯糖醚、中链或长链 烷基糖苷、磷脂、聚乙二醇衍生物或季铵盐。具体的表面活性剂列于下 文实施例中。

固体载体优选为多孔载体(可以为有机多孔载体或无机多孔载体)，所 述多孔载体具体选自由如多孔无机载体(如二氧化硅或氧化铝类载体)和 有机载体(如聚合物类载体)组成的组，其中所述载体可任选地含有如环氧 基或醛基等活性官能团或者离子基团。某些特定载体在下文实施例中给 出，特别是在表1中给出。

双相体系由适当的水性缓冲液和有机溶剂制备。该有机溶剂可以为 但不限于烷(如辛烷)、醇(如正辛醇)、醛(如癸醛)、酮(如2-辛酮)和它们的 任何混合物。

在另一个实施方式中，本发明涉及固定于经预处理的(经修饰的)固体 载体上的界面酶，所述经预处理的固体载体均匀地覆盖有表面活性剂、 优选为单层该表面活性剂。该独特结构使得所述酶能有效地用于在有机 溶剂中进行的反应。在所述载体的表面区域上产生的表面活性剂单层具 有由头对头的头基和尾对尾的尾基所表示的独特结构。该结构的示意性 说明如图2所示。在不受理论约束的情况下，该结构似乎对于固定化酶 采用其活性且有利的构象具有主要作用。此外，表面活性剂仅附着于基 质，从而防止所述酶失活。所述酶制品可以含有来自本文所述的酶组中 的一种或多种脂肪酶。

要使用的基质、表面活性剂和酶详细说明如上。

本发明的固定化酶或通过本发明的方法制备的固定化酶非常有活性 且特别稳定。如下文表2中可见，即使在10次反应循环后仍有约90％的 活性被保留。该稳定性具有重大的经济意义。

在另一个实施方式中，本发明涉及一种用于制备结构化蜡酯的方法， 所述方法通过将蜡原料与醇在本发明的固定化脂肪酶或通过本发明的方 法制备的固定化脂肪酶的存在下反应而进行。

通过该方法获得的蜡酯含有起始原材料所固有的表面活性成分。如 下文实施例中所示，反应体系中油类甘油三酯与醇的摩尔比分别是1∶2。 因此，反应产物(蜡酯)与所述油固有的甘油单酯之间的摩尔比分别是2∶1。 所述醇可以为任何合适的C2～22烷醇，优选为十六烷醇。在过滤出固定化 酶后，剩余产物含有比例分别为2∶1的蜡酯和甘油单酯的混合物。由于甘 油单酯的乳化性质，所述混合物可以用于水分散性蜡的制备，所述蜡可 用作乳霜，特别是化妆品乳霜和医用乳霜，所述乳霜具有改善的透皮效 果和保湿效果。该表面活性剂的存在赋予了所述蜡酯改善的水分散性。 因此，根据本发明生产的蜡酯特别适合用作各种化妆和美容用产品(如 霜剂和洗剂)的成分，并且能够在不需要添加乳化剂或分散剂的情况下 来使用。所形成的混合物的改善的乳化性质是由在过程中生成的甘油单 酯的存在所带来的。甘油单酯是公知的良好乳化剂，因为该分子同时具 有疏水域和亲水域，这种结构赋予了甘油单酯改善蜡酯在水中的分散性 的能力。与在相同体系中不使用甘油单酯而制备的蜡酯相比，如此生成 的蜡酯具有改善的水分散性。

在一个重要实施方式中，本发明还涉及一种制备脂肪酸甲酯(生物柴 油)的方法。通常，在该方法中，首先将甲醇逐步加入到植物油、动物油、 海藻油、鱼油或源自真菌且含n-3或n-6脂肪酸的油或者至少两种这些油 的混合物中。将固定于固体载体(覆盖有表面活性剂，优选为单层的表面 活性剂)上的脂肪酶或通过本发明的方法制备的固定化脂肪酶加入甲醇/ 油混合物中，并使反应进行直至油类甘油三酯被转化为脂肪酸甲酯。

应该注意到，在本文的说明中术语载体和基质是互换使用的。

如本文所公开和说明，应该理解本发明不限于本文公开的特定的实 例、方法步骤和材料，因为这些方法步骤和材料在某种程度上可以变化。 还应该理解本文所用的术语仅仅是用于说明具体实施方式的目的而不是 意在限制，因为本发明的范围仅受所附权利要求及其等同物的限制。

必须注意的是，如本说明书和所附权利要求所用，单数形式“a”、“an” 和“the”包括了复数的指代物，除非内容中明确指出相反的情况。

在整个本说明书和后附权利要求书中，除非上下文有相反要求，否 则词语“comprise”和如“comprises”和“comprising”等变化形式将被理解为 意味着包含所说明的整体或步骤或者多个整体或多个步骤的组，但不排 除任何其它的整体或步骤或者多个整体或多个步骤的组。

下列实施例是本发明人在实施本发明的各方面时采用的技术的代 表。应该理解的是，尽管这些技术是用于本发明的实施的优选实施方式 的示例，然而本领域技术人员根据本公开将会意识到可以在不背离本发 明的预期范围的情况下进行各种修改。

实施例

实施例1——固定化脂肪酶(Lipozyme TL)的制备

首先用水洗涤酶载体(1g)以除去任何吸附的盐和有机残留物。滤出 所述载体然后在真空下干燥以除去残留水分。将干燥载体(1g)与含有非 离子表面活性剂、阴离子表面活性剂或阳离子表面活性剂(100mg)的如正 己烷或异丙醇等有机溶剂混合。在真空下蒸发有机溶剂以产生均匀地覆 盖有表面活性剂(可以为但不限于磷脂酰胆碱、AOT(琥珀酸二(2-乙基己 基)酯磺酸钠)、聚乙二醇、Tween 20、Tween 40、Tween 60、Tween 65、 Tween 80、Tween 85、Span 20、Span 40、Span 60、Span 65、Span 80、 Span 85和糖脂肪酸酯(如脱水山梨糖醇单油酸酯、二油酸酯和三油酸酯或 其它脱水山梨糖醇脂肪酸酯))的干燥载体。

将源自疏绵状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosa)的脂肪酶(1ml的 Lipozyme TL 100L，Novozymes，丹麦)混合到由10ml磷酸盐缓冲液 (0.05M，pH 6.5)和10ml正己烷组成的双相体系中。将混合物剧烈搅拌 10分钟，接着加入经表面活性剂处理过的多孔载体。将混合物再搅拌4 小时。滤出含有固定化酶的载体并在干燥器中干燥过夜从而得到高度活 性的固定化脂肪酶。所述固定化过程也可以使用未修饰的载体进行。

表1显示了固定于不同载体上的Lipozyme TL 100L的相对酯交换活 性。反应通过将固定化脂肪酶(0.5g)加入到橄榄油(10g)和十六烷醇(5.5g) (油类甘油三酯∶十六烷醇的摩尔比是2∶1)中来进行。将反应体系在60℃磁 力搅拌或通过振摇而混合。在反应3小时后通过计算反应3小时后的橄 榄油甘油三酯的峰面积总和与时间零点时的橄榄油甘油三酯的峰面积总 和之比来确定橄榄油甘油三酯向蜡酯的转化率。

表1：反应3小时后橄榄油甘油三酯向蜡酯的转化率(％)。反应条件： 橄榄油(10g)和十六烷醇(5.5g)与固定于不同载体上的脂肪酶TL 100L (0.55g)混合3小时。将反应混合物以300rpm在60℃振摇。

  载体类型   转化率(％)   (未修饰载体)   转化率(％)   (经修饰载体)   Amberlite XAD 4(Rohm&Hass，美国)   38   67   Amberlite XAD 16(Rohm&Hass)   23   77   Amberlite XAD 7HP(Rohm&Hass)   24   66   Amberlite XAD 16HP(Rohm&Hass)   30   55   Duolite XAD 761(Rohm&Hass)   41   55   Amberlite XAD 1180(Rohm&Hass)   25   61   Amberlite XAD 1600(Rohm&Hass)   23   66   Duolite XAD A7(Rohm&Hass)   19   52   Duolite XAD A561(Rohm&Hass)   18   58

  Duolite XAD A568(Rohm&Hass)   22   51   Duolite XAD C467(Rohm&Hass)   12   22   Amberlyst A-21(Rohm&Hass)   19   66   Dowex monosphere 77(DOW，美国)   32   71   Dowex optipore L493(DOW，美国)   21   51   Dow styrene DVB(DOW，美国)   14   8   MTO Dowex optipore SD-2(DOW，美国)   13   18   Dowex MAC-3   13   20   Amberlite FPA53(Rohm&Hass)   17   31   Amberlite FPC22H(Rohm&Hass)   11   22   Amberlite FPA4OCl(Rohm&Hass)   32   56   Amberlite IRC50(Rohm&Hass)   10   44   Purolire A109(Purolite，美国)   28   51

当反应达到稳态状况时，过滤出固定化酶以获得所需产物。该产物 由摩尔比分别为2∶1的蜡酯和橄榄油固有的甘油单酯组成。该独特比例赋 予了所述产物改善的水分散性，因而所述产物能用于乳霜剂特别是化妆 或医用乳霜的制备而无须使用外部乳化剂。

实施例2——固定化脂肪酶用于制备脂肪酸甲酯(生物柴油)

根据上述程序使用各种载体将各种的脂肪酶或脂肪酶混合物固定 化。产生较高的甲醇和植物油甘油三酯形成脂肪酸甲酯的酯交换活性的 主要脂肪酶包括南极假丝酵母(Candida antarctica)脂肪酶B(CALB-L， Novozymes，丹麦)、脂肪酶QLM(产碱杆菌(Alcaligenes sp.)，Meito Sangyo， 日本)、疏绵状嗜热丝孢菌(Lipozyme TL 100L，Novozymes，丹麦)、假单 胞菌(Pseudomonas sp.，脂肪酶PS，Amano enzymes，日本)。

反应条件如下：大豆油(2.5g)和甲醇(在6小时的反应时间段内将0.3 ml以每步0.1ml分步加入)。通过加入固定化脂肪酶(100mg)启动反应并 将反应介质在35℃振摇6小时。表2显示了在10次连续循环中使用同一 生物催化剂时在6小时反应时间后大豆油甘油三酯向脂肪酸甲酯的转化 率。

表2：在10次连续循环中使用同一生物催化剂时在6小时反应时间 后大豆油甘油三酯向脂肪酸甲酯的转化率。

  循环数/   转化率(％)   固定于   Amberlite   XAD 7HP上   的脂肪酶TL   固定于   AmberliteXAD   7HP上的脂肪   酶QLM   固定于   Amberlite   XAD 1600上   的脂肪酶PS   固定于   Amberlite   XAD 16HP   上的CALB   1   90   92   95   60   2   92   94   96   65   3   90   92   95   62   4   92   90   93   67   5   90   87   92   70   6   88   90   91   65   7   87   85   87   66   8   88   82   90   66   9   90   82   92   70   10   89   82   90   67

如表2中可见，所述酶的大部分活性即使在10次反应循环后仍然得 以保留。