一种L-天冬氨酸的质控生产方法及其应用.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201811148809.3 (22)申请日 2018.09.29 (71)申请人 宿州学院 地址 234000 安徽省宿州市教育园区宿州 学院东区 (72)发明人 徐礼生张兴桃陈红玲高贵珍 赵亮苏博段腾飞 (74)专利代理机构 合肥市浩智运专利代理事务 所(普通合伙) 34124 代理人 苏园园 (51)Int.Cl. C12P 13/20(2006.01) G01N 21/78(2006.01) G01N 21/31(2006.01) (54)发明名称 一种L-天冬氨酸的质控。

2、生产方法及其应用 (57)摘要 本发明公开一种L-天冬氨酸的质控生产方 法及其应用， 包括L-天冬氨酸发酵液的制备以及 L-天冬氨酸发酵液的含量检测， 其中， L-天冬氨 酸发酵液的制备方法包括： 菌株在培养基中培养 发酵， 离心、 得到湿菌体， 湿菌体加入转化液中， 经酶促反应后， 得到L-天冬氨酸的发酵液； L-天 冬氨酸发酵液的含量检测方法包括： 确定最大吸 收波长、 标准曲线的制作、 含量确定； 通过本发明 公开的L-天冬氨酸发酵液含量检测方法,为实时 追踪发酵反应的进程提供了可能， 相对于传统的 高效液相色谱法、 在线衍生HPLC等检测手段， 紫 外分光光度法更加简便、 合理， 时间。

3、短， 速度快， 适合应用到工业化生产中。 权利要求书2页 说明书4页 附图1页 CN 109337941 A 2019.02.15 CN 109337941 A 1.一种L-天冬氨酸的质控生产方法， 其特征在于， 包括L-天冬氨酸发酵液的制备以及 L-天冬氨酸发酵液的含量检测； 所述L-天冬氨酸发酵液的制备方法包括以下步骤： S1、 将具有L-天冬氨酸酶活性的菌株在培养基中培养发酵， 离心后得到含L-天冬氨酸 酶的湿菌体； S2、 将湿菌体加入转化液中， 于3550条件下进行酶促反应后， 得到L-天冬氨酸的发 酵液； 所述L-天冬氨酸发酵液的含量检测方法如下： 步骤一： 取4-6ml L-天冬。

4、氨酸的标准溶液和2-4ml的茚三酮显色剂溶液在室温下进行 反应， 6-8ml茚三酮溶液作为空白对照， 将L-天冬氨酸的标准溶液和空白对照在400-600nm 波长下进行扫描， 通过扫描结果确定最大吸收波长； 步骤二： 标准曲线的制作； 步骤三： 样品中L-天冬氨酸的含量确定： 将发酵液稀释至0.1-1mg/ml后， 取发酵液4mL， 加入2ml的茚三酮显色剂溶液在室温下进行反应， 6ml茚三酮溶液作为空白对照， 在最大吸 收波长处测定其吸光度值， 将吸光度值代入线性回归方程计算样品中L-天冬氨酸的含量。 2.根据权利要求1所述L-天冬氨酸的质控生产方法， 其特征在于， 所述步骤二中标准曲 线的。

5、制作方法如下： 配制不同浓度梯度的L-天冬氨酸标准溶液， L-天冬氨酸标准溶液浓度梯度为： 0.1mg/ ml、 0.2mg/ml、 0.3mg/ml、 0.4mg/ml、 0.5mg/ml、 0.6mg/ml、 0.7mg/ml、 0.8mg/ml、 0.9mg/ml、 1.0mg/ml； 分别取上述标准溶液4-6ml加入10ml的试管中， 然后往试管里再加入2-4ml茚三 酮显色剂进行显示反应， 在最大吸收波长处测定浓度不同的L-天冬氨酸的标准溶液的吸光 度值， 根据测定的结果制作标准曲线； 线性回归方程为： Y0.0678X+0.0135， R20.9995， 其中Y为吸光度值， X为L。

6、-天冬氨酸 浓度。 3.根据权利要求1所述L-天冬氨酸的质控生产方法， 其特征在于， 所述转化液中含有 32-38的富马酸， 余量为水， 采用氨水调转化液的pH至611。 4.根据权利要求3所述L-天冬氨酸的质控生产方法， 其特征在于， 所述转化液中含有 35的富马酸， 余量为水， 采用氨水调转化液的pH至7.5。 5.根据权利要求1所述L-天冬氨酸的质控生产方法， 其特征在于， 所述步骤一和步骤三 中茚三酮溶液的质量浓度为1.5。 6.根据权利要求1所述的L-天冬氨酸的质控生产方法， 其特征在于， 所述所述步骤一中 L-天冬氨酸的标准溶液采用1cm比色皿测定待测样品溶液， 确定L-天冬氨酸的。

7、标准溶液的 最大吸收波长为510nm。 7.根据权利要求1所述L-天冬氨酸的质控生产方法， 其特征在于， 所述步骤一中取4ml 2.5mg/ml的L-天冬氨酸作为标准溶液。 8.根据权利要求1所述L-天冬氨酸的质控生产方法， 其特征在于， 所述步骤一中取4ml 2.5mg/ml的L-天冬氨酸作为标准溶液。 9.根据权利要求1所述L-天冬氨酸的质控生产方法， 其特征在于， 所述步骤二中分别取 上述标准溶液4ml加入10ml的试管中， 然后往试管里再加入2ml茚三酮显色剂进行显示反 权利要求书 1/2 页 2 CN 109337941 A 2 应。 10.一种采用如权利要求1-9任一所述的L-天冬。

8、氨酸的质控生产方法， 在工业化生产L- 天冬氨酸中的应用。 权利要求书 2/2 页 3 CN 109337941 A 3 一种L-天冬氨酸的质控生产方法及其应用 技术领域 0001 本发明涉及微生物发酵工程领域， 尤其涉及的是一种L-天冬氨酸的质控生产方法 及其应用。 背景技术 0002 L-天冬氨酸(L-aspartic acid)， 又称L-天门冬氨酸， 是一种 -氨基酸， 分子式为 C4H7NO4， 熔点高， 微溶于水， 是一种具有甜味的特殊氨基酸， L-天冬氨酸身为一种具有特殊 甜味的氨基酸， 通常用于食品行业、 美容行业、 以及化工行业和医药等行业。 可用于生化试 剂， 是食品添加剂。

9、阿斯巴甜甜味剂的原料。 0003 基于L-天冬氨酸的广泛应用， L-天冬氨酸已经作为重要的工业生产原料， 在工业 化生产中应用。 0004 然而， 对于眼下L-天冬氨酸的工业化发酵生产， 其含量检测成为技术难点。 工业化 发酵生产L-天冬氨酸中， 影响发酵反应的因素较多， 如温度、 车间湿度等， 导致L-天冬氨酸 的工艺不稳定。 产生的负面影响是： 往往按照工艺规定的发酵反应时间， 停止发酵反应后， 反应液检测显示发酵反应并未完全， 然而， 此时无法通过再继续升温发酵， 因此， 容易产生 废料。 0005 造成上述技术缺陷的原因是： 现有技术中关于L-天冬氨酸的检测手段较为落后， 以及工艺较为。

10、落后。 现有检测手段， 往往是反应过程中取发酵液样品溶液， 将发酵液样品溶 液分离， 通过柱前在线衍生后， 通过HPLC法测定天冬氨酸， 而采用HPLC法测定天冬氨酸不仅 需要经过分离、 衍生等步骤(主要原因是： L-天冬氨酸分子中没有共轭基团， 紫外检测器无 响应)， 检测时间周期较长。 同时， 由于HPLC采用色谱柱分离的方式检测， 色谱柱具有较高的 理论塔板数， 导致HPLC检测周期也长。 基于上述技术缺陷， 现有技术中样品检测与发酵反应 无法有效的配合， 即HPLC检测无法实时追踪发酵反应情形。 0006 因此， 采用一种较为方便、 快捷、 有效的检测手段， 能够实时追踪发酵反应的反应。

11、 情况， 配合发酵工艺， 对于提高L-天冬氨酸发酵工程意义重大。 发明内容 0007 本发明所要解决的技术问题在于： 提供一种紫外分光光度法快速测定L-天冬氨酸 的发酵液， 配合发酵工艺， 能够实时追踪发酵反应的进程。 0008 本发明是通过以下技术方案解决上述技术问题的： 0009 一种L-天冬氨酸的质控生产方法， 包括L-天冬氨酸发酵液的制备以及L-天冬氨酸 发酵液的含量检测； 0010 所述L-天冬氨酸发酵液的制备方法包括以下步骤： 0011 S1、 将具有L-天冬氨酸酶活性的菌株在培养基中培养发酵， 离心后得到含L-天冬 氨酸酶的湿菌体； 0012 S2、 将湿菌体加入转化液中， 于3。

12、550条件下进行酶促反应后， 得到L-天冬氨酸 说明书 1/4 页 4 CN 109337941 A 4 的发酵液； 0013 所述L-天冬氨酸发酵液的含量检测方法如下： 0014 步骤一： 取4-6ml L-天冬氨酸的标准溶液和2-4ml的茚三酮显色剂溶液在室温下 进行反应， 6-8ml茚三酮溶液作为空白对照， 将L-天冬氨酸的标准溶液和空白对照在400- 600nm波长下进行扫描， 通过扫描结果确定最大吸收波长； 0015 步骤二： 标准曲线的制作； 0016 步骤三： 样品中L-天冬氨酸的含量确定： 将发酵液稀释至0.1-1mg/ml后， 取发酵液 4mL， 加入2ml的茚三酮显色剂溶液。

13、在室温下进行反应， 6ml茚三酮溶液作为空白对照， 在最 大吸收波长处测定其吸光度值， 将吸光度值代入线性回归方程计算样品中L-天冬氨酸的含 量。 0017 优选地， 所述步骤二中标准曲线的制作方法如下： 0018 配制不同浓度梯度的L-天冬氨酸标准溶液， L-天冬氨酸标准溶液浓度梯度为： 0.1mg/ml、 0.2mg/ml、 0.3mg/ml、 0.4mg/ml、 0.5mg/ml、 0.6mg/ml、 0.7mg/ml、 0.8mg/ml、 0.9mg/ml、 1.0mg/ml； 0019 分别取上述标准溶液4-6ml加入10ml的试管中， 然后往试管里再加入2-4ml茚三酮 显色剂进行。

14、显示反应， 在最大吸收波长处测定浓度不同的L-天冬氨酸的标准溶液的吸光度 值， 根据测定的结果制作标准曲线， 线性回归方程为： Y0.0678X+0.0135， R20.9995， 其 中Y为吸光度值， X为L-天冬氨酸浓度。 0020 优选地， 所述转化液中含有32-38的富马酸， 余量为水， 采用氨水调转化液的pH 至611。 0021 优选地， 所述转化液中含有35的富马酸， 余量为水， 采用氨水调转化液的pH至 7.5。 0022 优选地， 所述步骤一和步骤三中茚三酮溶液的浓度为1.5。 0023 优选地， 所述所述步骤一中L-天冬氨酸的标准溶液采用1cm比色皿测定待测样品 溶液， 确。

15、定L-天冬氨酸的标准溶液的最大吸收波长为510nm。 0024 优选地， 所述步骤一中， 取4ml 2.5mg/ml的L-天冬氨酸作为标准溶液。 0025 优选地， 所述步骤二中分别取上述标准溶液4ml加入10ml的试管中， 然后往试管里 再加入2ml茚三酮显色剂进行显示反应。 0026 同时， 本发明将上述L-天冬氨酸的质控生产方法应用到工业化生产L-天冬氨酸 中。 0027 本发明相比现有技术具有以下优点： 0028 现有高效液相色谱法、 在线衍生HPLC法和谱络合吸附波测定L-天冬氨酸含量的样 品处理操作复杂， 紫外分光光度法更加简便、 合理， 时间短， 速度快， 实现直接对发酵液中L-。

16、 天冬氨酸含量的准确测定， 灵敏度高， 选择性好， 适用于发酵液中L-天冬氨酸的的实际检 测， 紫外分光光度法测定能够实时监控发酵发酵反应情形。 附图说明 0029 图1是本发明实施例中L-天冬氨酸的紫外分光光度的吸收光谱图。 0030 图2是本发明实施例中L-天冬氨酸的标准曲线图。 说明书 2/4 页 5 CN 109337941 A 5 具体实施方式 0031 下面对本发明的实施例作详细说明， 本实施例在以本发明技术方案为前提下进行 实施， 给出了详细的实施方式和具体的操作过程， 但本发明的保护范围不限于下述的实施 例。 0032 实施例1 0033 一种L-天冬氨酸的质控生产方法， 包括。

17、L-天冬氨酸发酵液的制备以及L-天冬氨酸 发酵液的含量检测； 0034 所述L-天冬氨酸发酵液的制备方法包括以下步骤： 0035 S1、 将具有L-天冬氨酸酶活性的菌株在培养基中培养发酵， 离心后得到含L-天冬 氨酸酶的湿菌体； 0036 S2、 将湿菌体加入转化液中， 于50条件下进行酶促反应后， 得到L-天冬氨酸的发 酵液； 其中， 所述转化液中含有38的富马酸， 余量为水， 采用氨水调转化液的pH至11。 0037 所述L-天冬氨酸发酵液的含量检测方法如下： 0038 步骤一： 取4ml L-天冬氨酸的标准溶液和2ml、 质量浓度为1.5茚三酮显色剂溶 液在室温下进行反应， 6ml茚三酮。

18、溶液作为空白对照， 将L-天冬氨酸的标准溶液和空白对照 在510nm波长下进行扫描， 通过扫描结果确定最大吸收波长； L-天冬氨酸标准溶液的紫外吸 收光谱如图1所示； 0039 步骤二： 标准曲线的制作， 配制不同浓度梯度的L-天冬氨酸标准溶液， L-天冬氨酸 标准溶液浓度梯度为： 0.1mg/ml、 0.2mg/ml、 0.3mg/ml、 0.4mg/ml、 0.5mg/ml、 0.6mg/ml、 0.7mg/ml、 0.8mg/ml、 0.9mg/ml、 1.0mg/ml； 0040 分别取上述标准溶液4ml加入10ml的试管中， 然后往试管里再加入2ml质量浓度为 1.5的茚三酮显色剂进。

19、行显示反应， 在最大吸收波长处测定浓度不同的L-天冬氨酸的标 准溶液的吸光度值， 根据测定的结果制作标准曲线， 线性回归方程为： Y0.0678X+0.0135， R20.9995， 其中Y为吸光度值， X为L-天冬氨酸浓度， 标准曲线如图2所示； 0041 步骤三： 样品中L-天冬氨酸的含量确定： 将发酵液稀释至2.5mg/ml后， 取发酵液 4mL， 加入2ml的茚三酮显色剂溶液在室温下进行反应， 6ml茚三酮溶液作为空白对照， 在最 大吸收波长处测定其吸光度值， 将吸光度值代入线性回归方程计算样品中L-天冬氨酸的含 量。 0042 实际工业化生产过程中， 采用上述L-天冬氨酸发酵液的含量。

20、检测方法， 替代传统 的柱前衍生法HPLC检测， 大大缩短了检测周期， 且能够实时监控发酵反应的反应情形。 0043 实施例2 0044 一种L-天冬氨酸的质控生产方法， 包括L-天冬氨酸发酵液的制备以及L-天冬氨酸 发酵液的含量检测； 0045 所述L-天冬氨酸发酵液的制备方法包括以下步骤： 0046 S1、 将具有L-天冬氨酸酶活性的菌株在培养基中培养发酵， 离心后得到含L-天冬 氨酸酶的湿菌体； 0047 S2、 将湿菌体加入转化液中， 于35条件下进行酶促反应后， 得到L-天冬氨酸的发 酵液； 其中， 所述转化液中含有35的富马酸， 余量为水， 采用氨水调转化液的pH至7.5。 004。

21、8 所述L-天冬氨酸发酵液的含量检测方法如下： 说明书 3/4 页 6 CN 109337941 A 6 0049 步骤一： 取6ml L-天冬氨酸的标准溶液和2ml、 质量浓度为1.5茚三酮显色剂溶 液在室温下进行反应， 6ml茚三酮溶液作为空白对照， 将L-天冬氨酸的标准溶液和空白对照 在510nm波长下进行扫描， 通过扫描结果确定最大吸收波长； 0050 步骤二： 标准曲线的制作， 配制不同浓度梯度的L-天冬氨酸标准溶液， L-天冬氨酸 标准溶液浓度梯度为： 0.1mg/ml、 0.2mg/ml、 0.3mg/ml、 0.4mg/ml、 0.5mg/ml、 0.6mg/ml、 0.7mg。

22、/ml、 0.8mg/ml、 0.9mg/ml、 1.0mg/ml； 0051 分别取上述标准溶液4ml加入10ml的试管中， 然后往试管里再加入2ml质量浓度为 1.5的茚三酮显色剂进行显示反应， 在最大吸收波长处测定浓度不同的L-天冬氨酸的标 准溶液的吸光度值， 根据测定的结果制作标准曲线， 线性回归方程为： Y0.0678X+0.0135， R20.9995， 其中Y为吸光度值， X为L-天冬氨酸浓度； 0052 步骤三： 样品中L-天冬氨酸的含量确定： 将发酵液稀释至2.5mg/ml后， 取发酵液 4mL， 加入2ml的茚三酮显色剂溶液在室温下进行反应， 6ml茚三酮溶液作为空白对照，。

23、 在最 大吸收波长处测定其吸光度值， 将吸光度值代入线性回归方程计算样品中L-天冬氨酸的含 量。 0053 实施例3 0054 一种L-天冬氨酸的质控生产方法， 包括L-天冬氨酸发酵液的制备以及L-天冬氨酸 发酵液的含量检测； 0055 所述L-天冬氨酸发酵液的制备方法包括以下步骤： 0056 S1、 将具有L-天冬氨酸酶活性的菌株在培养基中培养发酵， 离心后得到含L-天冬 氨酸酶的湿菌体； 0057 S2、 将湿菌体加入转化液中， 于45条件下进行酶促反应后， 得到L-天冬氨酸的发 酵液； 其中， 所述转化液中含有35的富马酸， 余量为水， 采用氨水调转化液的pH至6。 0058 所述L-天。

24、冬氨酸发酵液的含量检测方法如下： 0059 步骤一： 取6ml L-天冬氨酸的标准溶液和4ml、 质量浓度为1.5茚三酮显色剂溶 液在室温下进行反应， 8ml茚三酮溶液作为空白对照， 将L-天冬氨酸的标准溶液和空白对照 在510nm波长下进行扫描， 通过扫描结果确定最大吸收波长； 0060 步骤二： 标准曲线的制作， 配制不同浓度梯度的L-天冬氨酸标准溶液， L-天冬氨酸 标准溶液浓度梯度为： 0.1mg/ml、 0.2mg/ml、 0.3mg/ml、 0.4mg/ml、 0.5mg/ml、 0.6mg/ml、 0.7mg/ml、 0.8mg/ml、 0.9mg/ml、 1.0mg/ml； 0。

25、061 分别取上述标准溶液4ml加入10ml的试管中， 然后往试管里再加入2ml质量浓度为 1.5的茚三酮显色剂进行显示反应， 在最大吸收波长处测定浓度不同的L-天冬氨酸的标 准溶液的吸光度值， 根据测定的结果制作标准曲线， 线性回归方程为： Y0.0678X+0.0135， R20.9995， 其中Y为吸光度值， X为L-天冬氨酸浓度； 0062 步骤三： 样品中L-天冬氨酸的含量确定： 将发酵液稀释至2.5mg/ml后， 取发酵液 4mL， 加入2ml的茚三酮显色剂溶液在室温下进行反应， 6ml茚三酮溶液作为空白对照， 在最 大吸收波长处测定其吸光度值， 将吸光度值代入线性回归方程计算样品中L-天冬氨酸的含 量。 0063 以上所述仅为本发明的较佳实施例而已， 并不用以限制本发明， 凡在本发明的精 神和原则之内所作的任何修改、 等同替换和改进等， 均应包含在本发明的保护范围之内。 说明书 4/4 页 7 CN 109337941 A 7 图1 图2 说明书附图 1/1 页 8 CN 109337941 A 8 。