侵染蛋白介导生产重组杆状病毒粒子方法.pdf

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1、(10)授权公告号 CN 101372686 B (45)授权公告日 2011.04.20 CN 101372686 B *CN101372686B* (21)申请号 200810140646.4 (22)申请日 2008.07.16 C12N 7/01(2006.01) C12N 15/866(2006.01) (73)专利权人 南阳师范学院 地址 473061 河南省南阳市卧龙路 1386 号 南阳师范学院 (72)发明人 姚伦广 张祥满 孙京臣 张二辉 阚云超 刘宗才 (74)专利代理机构 郑州红元帅专利代理事务所 ( 普通合伙 ) 41117 代理人 徐皂兰 US 5824538 A,。

2、1998.10.20, 全文 . Petra Dersch 等 .a region of the Yersinia pseudotuberculosis invasin protein enhances integrin-mediated uptake into mammalian cells and promotes self-association.The EMBO Journal .1999, 第 18 卷 ( 第 5 期 ),11991213. Kumaran Narayanan 等 .DNA modi® cation and functional delivery into h。

3、uman cells using Escherichia coli DH10B. Nucleic Acids Research .2003, 第 31 卷 ( 第 9 期 ),e51 1 7. 刘德立等 . 双拷贝 v-cath 基因的重组 HaPV 的构建及毒力分析 .中国病毒学 .2003, 第 18 卷 ( 第 3 期 ),254 258. (54) 发明名称 侵染蛋白介导生产重组杆状病毒粒子方法 (57) 摘要 本发明公开了侵染蛋白介导生产重组杆状病 毒粒子方法， 其按下列步骤进行 ： (1) 构建 DAP 营 养缺陷型菌株 E.coliASDDH10B ； (2) 将杆状病 毒 Ba。

4、cmid 和转座辅助质粒以及表达侵染蛋白助 手质粒 PGB2inv 电转化进 E.coliASDDH10B， 构 建 新 的 感 染 性 受 体 菌 ASDDH10Bac/ PGB2inv ； (3) 通过 Tn7 转座方式将外源基因引 入杆状病毒 Bacmid 中， 获得含目标基因的重组 Bacmid 的感染性菌株 ； (4) 用含重组 Bacmid 的细 菌 ASDDH10Bac/PGB2inv 直接感染培养昆虫 细胞 sf21， 从而获得重组杆状病毒粒子。本发明 避免了传统方法中 DNA 转染昆虫细胞的局限性， 做到真正经济、 快速、 高效， 有利于杆状病毒表达 系统的广泛利用。 (51。

5、)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 张颖 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 4 页 附图 2 页 CN 101372686 B1/1 页 2 1. 一种侵染蛋白介导生产重组杆状病毒粒子方法，其特征在于 ：该方法按下列步骤 进行 ： (1) 构建 DAP 营养缺陷型菌株 E.coliASD DH10B ； (2) 将 ACBacmid 和转座辅助质粒以及表达侵染蛋白助手质粒 PGB2inv 电转化进 E.coliASD DH10B，构建新的感染性受体菌 ASDDH10Bac/PGB2inv ； (3) 用 pFastBacI 载 体 将 。

6、外 源 基 因 同 源 重 组 入 上 述 ACBacmid 中， 获 得 重 组 ASDDH10Bac/PGB2inv ； (4) 重组 ASDDH10Bac/PGB2inv 直接感染昆虫细胞 sf21 从而获得重组杆状病毒 粒子。 权 利 要 求 书 CN 101372686 B1/4 页 3 侵染蛋白介导生产重组杆状病毒粒子方法 技术领域 0001 本发明属于基因工程和蛋白工程领域，具体是一种侵染蛋白介导生产重组杆状 病毒粒子的方法。 背景技术 0002 因具有对人及哺乳动物安全、超强的多角体启动子 (pplb) 驱动外源基因在昆虫细 胞内高效表达、昆虫细胞培养方便、病毒操作简单、克隆外。

7、源片段能力大 (30-50kb)、表 达产物具有正确后加工等特点，杆状病毒表达系统 (BES， Baculovirus Expresson System) 已经成为表达真核生物基因的优秀表达系统之一。 目前，利用杆状病毒表达系统表达 外源基因的来源遍及病毒、细菌、真菌、动物和植物等各种生物，其应用范围涉及蛋 白质结构和功能、蛋白质与蛋白质之间相互作用方面的基础研究和疫苗生产、疾病诊 断以及病毒杀虫剂的改良等。 目前主要使用两种杆状病毒表达系统，一种为商业化的 AcNPV-sf9 或者 AcNPV-High5 系统，该系统利用重组 AcNPV 在离体培养细胞 sf9 或者 High5 中进行外源。

8、基因表达。 另外一种就是 BmNPV- 家蚕幼虫表达系统，该系统利用重 组 BmNPV 在家蚕活体内进行蛋白表达。 家蚕饲养在我国具悠久的历史，其培养方式简 单，成本较低，其成本为细胞培养的 1/10，而蛋白表达量则为培养细胞的 10 倍左右，因 此杆状病毒 - 家蚕表达系统在经济高效大量表达外源蛋白方面具有极为诱人的前景和优 势。 0003 无论何种重组杆状病毒，最后都必须通过将提取的重组病毒 DNA 转染昆虫细 胞产生杆状病毒粒子，以达到蛋白质结构和功能、蛋白质与蛋白质之间相互 作用研究和 疫苗生产、疾病诊断以及病毒杀虫剂的改良等应用。 目前将 DNA 载体 ( 包括 Bacmid DNA。

9、) 转染进昆虫宿主细胞的方法有脂质体 (lipofectin) 介导的转染法，磷酸钙 -DNA 共 沉淀法和显微注射法。 其中磷酸钙-DNA共沉淀法成本最低，对DNA质量要求非常高， 而且对操作以及 PH 值要求严格， PH 值微小的改变就可导致转染效率急剧下降，因此总 体转染效率不高，重复性较差，转染效果不稳定。 脂质体 (lipfectin) 介导的转染方法简 单，且转化常规小质粒效率较高 (40-80 )，而转染 100kb 以上的大质粒的效率相对较 低 (5-10 )。 但是脂质体价格极其昂贵，实验成本太高，和磷酸钙转染一样，依然需要 提取和精制高质量 DNA，再与脂质体进行混合，转染。

10、过程比较复杂耗时。 显微注射法操 作过程烦琐，需要价值上百万的显微操作系统支持，成本极高，和操作者的经验密切相 关，主要用于单细胞注射试验，普通实验室根本不可能使用。 无论是磷酸钙还是脂质体 转染法，都需要制备高纯度的 DNA 和试剂按一定的比例进行混合，让 DNA 与脂质体或者 磷酸钙形成复合体，再经过复杂的转染操作过程才能转染进细胞。因此现有的这几种DNA 进入昆虫宿主细胞的转染方法都有其局限性，限制了杆状病毒表达系统的广泛利用。 发明内容 ： 0004 为解决现有技术存在的上述问题，本发明提供了一种避免复杂昂贵的昆虫细胞 说 明 书 CN 101372686 B2/4 页 4 转染过程，。

11、从而经济、快速、高效侵染蛋白介导生产重组杆状病毒粒子的方法。 0005 为实现上述发明目的，本发明所述的侵染蛋白介导生产重组杆状病毒粒子的方 法按下述步骤实现 ：(1) 构建 DAP 营养缺陷型菌株 E.coli ASD DH10B ； 0006 (2) 将 ACBacmid 和转座辅助质粒以及表达侵染蛋白助手质粒 PGB2inv 电转 化进 E.coli ASD DH10B，构建新的感染性受体菌 ASD DH10Bac/PGB2inv ；(3) 用 pFastBacI 载体将外源基因同源重组入上述 ACBacmid 中，获得重组 ASDDH10Bac/ PGB2inv ；(4) 重组 ASD。

12、DH10Bac/PGB2inv 直接感染昆虫细胞 sf21 从而获得重组 杆状病毒粒子。 0007 本发明的理论依据 ：asd 是编码二氨基庚二酸的基因，是细胞壁合成的重要成 分，在确实 asd 基因的情况下，细菌必须补加 DAP( 二氨基庚二酸 ) 以维持细菌的生存和 繁殖。 Inv 基因来自 Yersinia pesudotuberculosis 的基因组，编码 103kDa 的细菌外膜侵染 蛋白 Invasin，Yersinia pesudotuberculosis 可以感染人和动物，其感染主要方式是通过侵染 蛋白 Invasin 与 1 受体家族的结合，帮助细菌进入人或哺乳动物细胞。 。

13、采用缺失大肠杆 菌 DH10B 基因组中的 asd 基因，使大肠杆菌细胞壁合成受阻，大肠杆菌菌液和昆虫细胞 混合后，通过 PGB2inv 质粒表达的 Invasin 蛋白，与昆虫细胞上的受体结合，通过受体 介导的内吞作用，大肠杆菌进入昆虫细胞，然后不再对其补加 DAP，大肠杆菌在细胞内 裂解，释放出 DNA 感染昆虫细胞。 0008 采用上述技术方案的有益效果 ： 0009 该方法可以不需要提取和纯化 Bacmid DNA，只需要将携带重组 Bacmid 的细菌 和昆虫细胞按一定的比例直接混合就可以获得感染性重组杆状病毒粒子。 在侵染蛋白 (invision protein) 的帮助下，直接使。

14、用携带目的重组杆状病毒 Bacmid DNA 的细菌感染昆 虫细胞，从而直接获得重组病毒粒子。 从细菌到病毒，一步到位，省去了重组Bacmid的 提取、纯化精制、Bacmid DNA 与转染试剂的混合等复杂的转染程序，而生产重组病毒的 效率为常规转染的 4 倍。 因此该方 法十分方便，快速和经济，为大规模构建重组病毒表 达外源蛋白打下基础，是一种极具应用前景的新技术。 附图说明 0010 图 1 是高效转座系统构建含重组 Bacmid 及直接生产重组病毒过程示意图 ； 0011 图 2 是侵染蛋白辅助携带重组 Bacmid-red 的细菌在 sf21 细胞中直接生产病毒粒 子 ；其中 (A) 。

15、是 543nm 荧光观察感染 72 小时后的 sf21 细胞，(b) 是同一视野下普通光下 观察感染 72 小时后的 sf21 细胞。 具体实施方式 0012 下面结合附图对本发明的具体实施例作进一步详细的说明。 0013 应当说明的是，这些实施例仅用于本发明而不用于限制本发明要求的保护范 围，下列实施例中未注明具体实验条件和方法，按照常规条件如 ：J. 萨姆布鲁克等主 编，科学出版社，1992，分子克隆实验指南 ( 第二版 ) ；孙明主编，高等教育出版社， 2006，基因工程 ( 第十七章，病毒基因工程，姚伦广编著 ) ；黎路林编著，华中师范大 学出版社，1996，杆状病毒表达载体系统，或按。

16、照制造厂商的操作指南所建议的方法进 说 明 书 CN 101372686 B3/4 页 5 行。 0014 实施例 1 ： 0015 构建 ASDAcDH10Bac/PGB2inv 以及获得病毒粒子的方法 0016 1.DAP 营养缺陷型菌株 E.coli ASD DH10B 的构建 0017 使用高效的 GET 重组系统进行 E.coli DH10B 染色体中 asd 基因缺失。 以 pcp15( 两侧有 FRT 序列的 Knr) 为模板，扩增出带 50bp 同源重组臂和 FRT 序列的卡那抗 性基因表达盒 Knr。 引物设计为 ASD50UP ：GAGACC GGCACAT TTATACA。

17、GCACACA TCTTTGCAGGAAAAAAACGCTTAGAATTCGAGCTCGGTAC CCGGG( 下划线表示 asd 基因 50bp 同源左臂 ) 和 ASD50DOWN ：ASD50DOWN ：CTCCTG TATTACGCACTAA CAGGGGCGGCATCGCGCCCCAGATTAATGACTTA AGCTTAAAA GCGCTCTGAA( 下 划线为 asd 基因 50bp 同源右臂 )。 以质粒 pcp15 为模板进行扩增，产物大小为 1.6kb(50bpLHA-FRT-knr-FRT-50bp RHA)，PCR产物首先使用DpnI充分酶切，去掉可能 存在的模板质粒，。

18、然后经凝胶回收备用。 0018 壮观霉素抗性质粒 pML104 含有由半乳糖启动子 (Plac) 控制的重组酶基因 red 和 gam，经 CaCl2转化进 DH10B。 将 DH10B/pml104 于 30培养到 OD600为 0.2，加入 IPTG(0.4mM)继续培养30分钟，以诱导重组酶red和gam表达。 然后将上述两则含50bp 同源重组臂和 FRT 序列的卡那抗性基因 PCR 产物 (50bp 0019 LHA-FRT-kn-FRT-50bp RHA) 电 转 化 进 经 IPTG 诱 导 的 DH10B 菌 株 中， 经 Kn+平板 ( 补加 DAP)42筛选出阳性菌落，并经。

19、菌落 PCR 验证。 用 42培 养 目 的 是 为 了 去 掉 温 度 敏 感 型 质 粒 pML104。 菌 落 PCR 引 物 为， Asdshortup ： GAGACCGGCACATTTATACA ；Asdshort down ：CTCCTGTATTACGCA CTAAC。 大 肠 杆菌基因组中 asd 基因大小为 1.2kb，而含 FRT 序列的 Knr大小为 1.6kb。 为方便以后 Bacmid(knr) 的引入，需要利用 FLP 重组酶将 Knr去掉。 将能表达 FLP 位点特异性重组 酶和温度敏感型质粒 pcp20 转化进经过菌落 PCR 验证的菌落，筛选出卡那抗性基因被重。

20、 组掉的阳性菌落 (Kn-，Amp+)，然后 42培养去掉 pcp20。 经菌落 PCR 进一步确定阳性 菌株，所得菌株命名为 asd DH10B。 0020 2. 受体菌 ASDAc DH10Bac/PGB2inv 的构建 0021 将 AcBacmid(Knr，购自 Invitrgen Bac-to-Bac 系统 ) 和转座辅助质粒 pHelper( 提 供转座酶，Tetr) 以及表达侵染蛋白助手质粒 PGB2inv(Patrice Courvalin 提供 ) 电转化进 E.coli ASDDH10B，在Kn/Tet/Sp/IPTG/X-gal/DAP 平板上挑取蓝色阳性菌落，获得新 的。

21、转座受体系统 ASDAcDH10Bac。 0022 3. 重组 ASD AcDH10Bac/PGB2inv 的获得 0023 pDsRed 经 BamHI 和 NotI 酶切，回收红色荧光蛋白基因 red 片段，按照常规方式 克隆到载体 pFastBacI，获得重组转移载体 pFastBacI-red，按照 Bac-to-Bac 操作流程获得 阳性白斑菌落，注意在培养基中补加 DAP。 0024 4. 重组 ASDAcDH10Bac/PGB2inv 直接感染 Sf21 细胞获得重组杆状病毒粒 子。 0025 如图 (1) 所示，挑取含重组 Bacmid 和助手质粒 PGB2inv 白色单菌落，。

22、接种到 5ml 含 kn( 终浓度 50ug/ml) 和 DAP(0.5mM) 的 LB 培养基中，于 37 200rpm 摇床培养 说 明 书 CN 101372686 B4/4 页 6 到 OD 值约 0.4 左右，无菌条件下取 400ul 菌液至灭菌的 1.5mlEppendorf，2500rpm 离心 5min，弃上清。 无菌条件下加入1ml无血清无双抗的grace培养基(含0.5mM DAP)重悬 沉淀。 Sf21 细胞置六孔板培养，待细胞汇片 90左右，去上清，加入 500ul 上述菌液和 500ul grace基础培养基混合液感染昆虫细胞(moi100)。 吸附两小时后，吸走上清。

23、，用 1ml无血清，无双抗grace培养基洗两次，加入1ml含双抗，庆大霉素和10血清的grace 培养基，4 天后即可收获重组病毒粒子上清。 0026 重组病毒在细胞中的表达 0027 选择重组 Bacmid-red 的阳性菌落进行培养，按照上述方法转染 Sf21 细胞后 3-5 天，置于倒置荧光显微镜下观察细胞中红色荧光的表达情况。 如图 2-A 所示，转染后第 4-5 天，有大量的细胞发出红色荧光，而对照图 2-B 则没有细胞产生荧光。 说 明 书 CN 101372686 B1/2 页 7 图 1 说 明 书 附 图 CN 101372686 B2/2 页 8 图 2 说 明 书 附 图 。