藜草花叶病毒检测用引物及其检测方法.pdf

本发明提供了一种藜草花叶病毒检测用引物及其检测方法，所述引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.1：5′-TGTTATGGGCAGGGCTATG-3′和SEQ ID NO.2：5′-TGTAAATCGCAAGGGCAG-3′。本发明还进一步提供了检测藜草花叶病毒的方法。该方法以样品总RNA为模板，利用上述引物进行反转录PCR(RT-PCR)扩增，反应结束后根据扩增片段的位置判定结果。本发明的引物特异性好，检测方法快速简单，准确性高，为可能携带藜草花叶病毒的进境植物繁殖材料的检疫提供保证。

1、  一种藜草花叶病毒检测用引物，该引物的正向引物序列SEQID NO.1和反向引物序列SEQ ID NO.2的核苷酸序列如下：
SEQ ID NO.1：5′-TGTTATGGGCAGGGCTATG-3′
SEQ ID NO.2：5′-TGTAAATCGCAAGGGCAG-3′。

2、  一种检测藜草花叶病毒的方法，该方法以样品总RNA为模板，利用核苷酸序列为SEQ ID NO.2的引物进行反转录反应合成cDNA。以合成的cDNA为模板，利用核苷酸序列为SEQ ID NO.1的引物和核苷酸序列为SEQ ID NO.2的引物进行PCR扩增，反应结束后根据特异性扩增DNA片段的位置判定藜草花叶病毒的存在。

3、  根据权利要求2所述的方法，RT的反应条件是在20μL反应体系中加入4.75μL DEPC处理水，6μL总RNA，1μL SoMV-R，1μL dNTP，混匀后于65℃保持5min，迅速转移到冰上骤冷5min；然后向反应管中加入2μL DTT，4μL 5×反转录缓冲液，1μL RNA酶抑制剂，0.25μL反转录酶，42℃反应50min；72℃15min灭活反转录酶后获得反转录产物cDNA。

4、  根据权利要求2或3所述的方法，其中PCR扩增的反应条件是在50μL的反应体系中加入30.5μL DEPC处理水，2μL cDNA，2μL SoMV-F，2μL SoMV-R，10×PCR缓冲液5μL，8μL dNTP，0.5μLDNA聚合酶。

5、  根据权利要求2-4任一项所述的方法，其中PCR扩增的条件为：94℃，5min；94℃30s，54℃45s，72℃1min，共30个循环；72℃延伸5min。

6、  一种用于检测藜草花叶病毒的试剂盒，该试剂盒包含引物SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2。

藜草花叶病毒检测用引物及其检测方法
技术领域
本发明涉及生物检测技术，具体地说涉及藜草花叶病毒检测用引物及其检测方法。
背景技术
藜草花叶病毒(Sowbane mosaic virus，SoMV)为南方菜豆花叶病毒属(Sobemovirus)成员之一，被列为我国进境植物检疫性有害生物。SoMV的自然寄主为藜科(Chenopodiaceae)植物。SoMV主要分布于澳大利亚、欧洲、日本、北美、南美和南非地区。
本研究选择申请人测定的SoMV外壳蛋白基因序列设计一对引物，建立了SoMV的RT-PCR检测方法，反应结束即可根据扩增片段的大小判定是否有SoMV。
发明内容
本发明目的在于提供用于SoMV RT-PCR检测的引物序列。
本发明通过分析申请人测定的SoMV外壳蛋白基因序列的基础上，设计引物。所述的引物对由正向和反向引物组成，其核苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
具体地，本发明提供了一种SoMV检测用引物，该引物的正向引物序列SEQ ID NO.1(SoMV-F)和反向引物序列SEQ ID NO.2(SoMV-R)的核苷酸序列为：
SEQ ID NO.1：5′-TGTTATGGGCAGGGCTATG-3′
SEQ ID NO.2：5′-TGTAAATCGCAAGGGCAG-3′
本发明还提供了一种检测SoMV的方法，该方法以样品总RNA为模板，利用核苷酸序列为SEQ ID NO.2的引物SoMV-R进行反转录反应(RT)合成cDNA。以合成的cDNA为模板，利用核苷酸序列为SEQ ID NO.1的引物SoMV-F和核苷酸序列为SEQ ID NO.2的引物SoMV-R进行PCR扩增，反应结束后根据特异性扩增DNA片段的位置判定藜草花叶病毒的存在。
优选地，上述方法中的PCR反应过程中的退火温度为54℃。
本发明还提供了一种用于检测SoMV的试剂盒，该试剂盒含有上述引物SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2。
具体地，本发明中检测SoMV的方法是以样品总RNA为模板，进行RT-PCR反应，反应条件是在反应体系中加入超纯水，cDNA，引物SoMV-F，引物SoMV-R，DNA聚合酶。
更具体地，本发明中检测SoMV的方法是以样品总RNA为模板，进行RT-PCR反应：
RT的反应条件是在20μL反应体系中加入4.75μL DEPC处理水，6μL总RNA，1μL SoMV-R(10μmol/L)，1μL dNTP(10mmol/L)，混匀后于65℃保持5min，迅速转移到冰上骤冷5min；然后向反应管中加入2μL DTT(0.1mmol/L)，4μL 5×反转录缓冲液，1μL RNA酶抑制剂(40U/μL)，0.25μL反转录酶(200U/μL)，42℃反应50min；72℃15min灭活反转录酶后获得反转录产物cDNA。
PCR的反应条件是在50μL的反应体系中加入30.5μLDEPC处理水，2μL cDNA，2μL SoMV-F(10μmol/L)，2μL SoMV-R(10μmol/L)，10×PCR缓冲液5μL，8μL dNTP(2.5mmol/L)，0.5μL DNA聚合酶(5U/μL)。PCR的反应参数是：94℃，5min；94℃30s，54℃45s，72℃1min，共30个循环；72℃延伸5min。
当然，可以根据本发明给出的引物的扩增产物序列设计其他引物，以适用于不同的PCR检测方法。
进一步，还可以将本发明引物及相关试剂组装成试剂盒，以方便使用。
根据SoMV外壳蛋白基因序列设计的本发明的引物是经过大量筛选得到的，而且应用该引物及本发明中的检测方法准确性高，能够快速地判断样品是否有SoMV，为进出口安全提供了保证。
附图说明
图1是藜草花叶病毒的RT-PCR检测结果，其中M：DL2000 DNAladder；1.SoMV；2.SBMV；3.SCPMV；4.RYMV；5.健康对照。
图2是本发明检测方法的灵敏度试验结果。其中M：DL2000DNA ladder；1-7表示反转录反应体系中加入的总RNA体积分别为：6μL，5μL，4μL，3μL，2μL，1μL，0.5μL。
具体实施方式
下面实施例用于对本发明的进一步说明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1
引物的设计和合成
根据SoMV外壳蛋白基因序列，采用Primer Premier 5.0设计引物，经过大量筛选得到如下序列的引物序列和探针：
正向引物(SoMV-F)的序列为SEQ ID NO.1，反向引物(SoMV-R)的序列为SEQ ID NO.2，具体序列的组成如下：
SEQ ID NO.1：5′-TGTTATGGGCAGGGCTATG-3′
SEQ ID NO.2：5′-TGTAAATCGCAAGGGCAG-3′
根据上述核苷酸序列信息合成正向引物SoMV-F和反向引物SoMV-R。将上述引物SoMV-F和SoMV-R分别配制成浓度为10μmol/L的溶液，备用。
总RNA的提取
1)取0.1g发病叶片，剪成小段，用液氮研磨成粉末状，移入灭菌的1.5ml离心管中，然后加入1ml的Trizol试剂，剧烈震荡摇匀；
2)室温下保持5min，加0.2ml氯仿，剧烈振荡15s，然后在室温下保持2-15min后，4℃，12000g离心15min；
3)将上层水相转移到新的1.5ml离心管中，加0.5ml异丙醇，颠倒混匀，室温下保持15min；
4)4℃，12000g离心10min，RNA就会在管的侧壁和底部形成沉淀；
5)倒掉上清液，加入75％的乙醇洗涤沉淀，然后4℃，7500g离心5min(如沉淀悬浮起来，则用12000g)，弃去乙醇；
6)沉淀于室温下充分干燥后，溶于40μl dH₂O(DEPC处理)中，-20℃保存备用。
RT-PCR扩增
1、RT反应
在20μL反应体系中加入4.75μL DEPC处理水，6μL总RNA，1μL SoMV-R(10μmol/L)，1μL dNTP(10mmol/L)，混匀后于65℃保持5min，迅速转移到冰上骤冷5min；然后向反应管中加入2μLDTT(0.1mmol/L)，4μL 5×反转录缓冲液，1μL RNA酶抑制剂(40U/μL)，0.25μL反转录酶(200U/μL)，42℃反应50min；72℃15min灭活反转录酶后获得反转录产物cDNA。
2、PCR扩增
在50μL的反应体系中加入30.5μL DEPC处理水，2μL cDNA，2μL SoMV-F(10μmol/L)，2μL SoMV-R(10μmol/L)，10×PCR缓冲液5μL，8μL dNTP(2.5mmol/L)，0.5μL DNA聚合酶(5U/μL)。PCR的反应参数是：94℃，5min；94℃30s，54℃45s，72℃1min，共30个循环；72℃延伸5min。扩增结果如附图所示。
试验结果
按照本发明中的检测方法，利用引物SoMV-F和SoMV-R可从感染SoMV的叶片提取的总RNA中检测出510bp DNA片段，而从同属其他三种病毒(SBMV，SCPMV，RYMV)和健康材料中均未检出510bpDNA片段。结果表明，建立的RT-PCR方法具有良好的特异性，可准确判定样品中是否存在SoMV。
实施例2
相对灵敏度试验
在反转录反应体系中加入不同体积的总RNA，进行相对灵敏度试验。具体地，在20μL反转录体系中，总RNA分别为6L，5μL，4μL，3μL，2μL，1μL，0.5μL。按照本发明的方法，PCR反应体系中加入2μL的cDNA，利用SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2进行扩增，结果如图2所示，本发明方法的检测低限是1μL总RNA，本发明方法用于检测藜草花叶病毒灵敏度高，效果非常好。
序列表
<110>厦门出入境检验检疫局检验检疫技术中心
<120>藜草花叶病毒检测用引物及其检测方法
<130>
<160>2
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
tgttatgggcagggctatg                                        19
<210>2
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
tgtaaatcgcaagggcag                                         18