鉴定太平洋牡蛎种群的新方法.pdf

本发明涉及鉴定牡蛎种群的方法。鉴定太平洋牡蛎种群的新方法，样本采集：分别采集褶牡蛎、太平洋牡蛎和近江牡蛎不同的种群样本个体；基因组提取：提取上述样本每种牡蛎群体的多个样本的基因组；引物设计：根据含有微卫星的EST序列设计EST-SSRs引物；PCR扩增：利用EST-SSRs引物进行PCR扩增，得到目的片段的PCR产物；EST-SSRs特异位点的鉴定：对PCR产物先进行琼脂糖凝胶电泳，得到具有清晰且稳定条带的PCR产物，再进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，进行多态性位点检测，鉴定出具有特异的EST微卫星序列的等位基因位点太平洋牡蛎种群。本发明利用了EST-SSRs分子标记技术，引物设计合理，二步电泳检测，达到鉴定太平洋牡蛎种群的目的，方法简单，省时且分析准确。

1、  鉴定太平洋牡蛎种群的新方法，其特征是：
1)样本采集：分别采集褶牡蛎、太平洋牡蛎和近江牡蛎不同的种群样本个体；
2)基因组提取：提取上述样本每种牡蛎群体的多个样本的基因组；
3)引物设计：根据含有微卫星的EST序列设计EST-SSRs引物；
4)PCR扩增：利用EST-SSRs引物进行PCR扩增，得到目的片段的PCR产物；
5)EST-SSRs特异位点的鉴定：对PCR产物先进行琼脂糖凝胶电泳，得到具有清晰且稳定条带的PCR产物，再进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，进行多态性位点检测，鉴定出具有特异的EST微卫星序列的等位基因位点太平洋牡蛎种群。

2、  根据权利要求1所述的鉴定太平洋牡蛎种群的新方法，其特征是：样本采集：分别选取褶牡蛎、太平洋牡蛎、近江牡蛎，每个牡蛎取其闭壳肌放入1.5ml离心管中，加入95％乙醇后放入-20℃冰箱中保存备用。

3、  根据权利要求1所述的鉴定太平洋牡蛎种群的新方法，其特征是：基因组提取：采用经典酚-仿抽提法从牡蛎肌肉中提取牡蛎的全基因组DNA。

4、  根据权利要求1所述的鉴定太平洋牡蛎种群的新方法，其特征是：EST-SSRs引物设计：从NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)的EST库中搜索太平洋牡蛎的EST序列，然后用在线软件SSRIT(http://www.gramene.org/db/markers/ssrtool)找出含有微卫星的EST序列，根据这些含有微卫星的EST序列利用在线引物设计软件Premier3.0(http://frodo.wi.mit.Edu/cgibin/primer3/primer3_www.cgi)设计EST-SSRs引物，引物设计主要参数为：引物长18-22bp，最适20bp；引物退火温度55-65℃，上下引物之间退火温度不超过5℃；GC含量40％-60％，最适50％；PCR预期产物长150-300bp。

5、  根据权利要求1所述的鉴定太平洋牡蛎种群的新方法，其特征是：EST-SSRs引物设计：设计适用于太平洋牡蛎的引物序列：
F--------5’GCAGAGATGGTCTGGAAAGC  3’
R---------5’CTGGCTGGAGAAGAACAAGG  3’。

6、  根据权利要求1所述的鉴定太平洋牡蛎种群的新方法，其特征是：EST-SSRs的PCR扩增：以提取的全基因组DNA样品分别为模板，对EST-SSRs引物进行PCR扩增。

7、  根据权利要求1-6任一所述的鉴定太平洋牡蛎种群的新方法，其特征是：EST-SSRs特异位点的鉴定：首先经过琼脂糖凝胶电泳，得到扩增条带稳定、条带清晰的PCR产物；再进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，扩增条带稳定、条带清晰且有多态性的EST-SSRs引物即是太平洋牡蛎群体。

鉴定太平洋牡蛎种群的新方法
技术领域：
本发明涉及一种新的快速准确鉴定牡蛎种群的方法。
背景技术：
牡蛎的贝壳可塑性强，贝壳外部形态差异极大，研究人员积极寻求其它研究手段，以求解决牡蛎分类中存在的疑难问题。大部分学者认为牡蛎软体部的结构差异很小，可提供的分类证据少。绝大多数的牡蛎具有恒定的染色体数目(2n＝20)，并且核型的差异甚微，无法为区别牡蛎物种提供证据(参见Ahmed M.Cytogenetics of oysters.Cytologia，1973，28：337-346.)。在借助生化手段方面，蛋白质和同工酶电泳技术被用于研究属间的遗传多样性分析以及对分布区重叠的种群间的种类鉴定，但电泳分析结果应用于种类鉴别上的有效性，尚存在诸多争议(参见HedgecockD，Okazaki N B.Genetic diversity within and between population ofAmerican oyster(Crassostrea).Malacologia，1984，25：535-549.)。此外，地理分布常是牡蛎物种鉴定的主要依据之一，但有不少研究表明，一些具有不同地理分布而被界定为不同种的牡蛎，很容易杂交，产生可存活的并且具有繁育能力的后代(参见Gaffney P M，Allen S KJr.Hybridization among Crassostrea species：a criticalreviews.Aquaculture，1993，116：1-13.)。因此，由于缺少有效的鉴定种群的方法，在相当长的一段时期内，牡蛎的种名混乱，同物异名和异物同名等现象十分严重。
此外异地引种养殖频繁，打破了牡蛎种间的地理隔离，对我国的牡蛎种质资源造成了严重的影响，进一步加剧了现有牡蛎形态分类的难度。分类方面的混乱已严重影响到牡蛎的养殖和育种，给杂交育种工作的开展带来了诸多不便。
微卫星最早应用之一是制作DNA指纹图来进行个体、品种(系)鉴定。2006年，D.Lallias等人用微卫星分子标记技术首次绘制出欧洲牡蛎的遗传图谱(参见D.Lallias，A.R.BeaumontSchool of Ocean Sciences，College of Natural Sciences，University of Wales，Bangor，MenaiBridge，Gwynedd，LL595AB，UK.A first-generation genetic linkagemap of the European flat oyster Ostrea edulis(L.)based on AFLP andmicrosatellite markers[J].Mol Ecol.2006，15(13)：29-42.)
现中国养殖的主要经济牡蛎太平洋牡蛎，为了更好的准确鉴定牡蛎种群和顺利地进行遗传育种工作，迫切需要一种省时准确的方法，从而达到保护牡蛎资源的目的。
发明内容：
本发明的目的是解决牡蛎种质鉴定和遗传育种存在的不足问题，提供一种鉴定太平洋牡蛎种群的新方法，应用EST-SSRs分子标记技术，从不同种群牡蛎(褶牡蛎，近江牡蛎，太平洋牡蛎等)中分离出太平洋牡蛎群体，方法简单，分析准确。
本发明为实现上述目的采用的技术方案是：鉴定太平洋牡蛎种群的新方法，
1)样本采集：分别采集褶牡蛎、太平洋牡蛎和近江牡蛎不同的种群样本个体；
2)基因组提取：提取上述样本每种牡蛎群体的多个样本的基因组；
3)引物设计：根据含有微卫星的EST序列设计EST-SSRs引物；
4)PCR扩增：利用EST-SSRs引物进行PCR扩增，得到目的片段的PCR产物；
5)EST-SSRs特异位点的鉴定：对PCR产物先进行琼脂糖凝胶电泳，得到具有清晰且稳定条带的PCR产物，再进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，进行多态性位点检测，鉴定出具有特异的EST微卫星序列的等位基因位点太平洋牡蛎种群。
所述样本采集：分别选取褶牡蛎、太平洋牡蛎、近江牡蛎各40以上个体，每个牡蛎取其闭壳肌0.1克放入1.5ml离心管中，加入95％乙醇后放入-20℃冰箱中保存备用。
所述基因组提取：参照萨姆布鲁克等经典酚-仿抽提法从牡蛎肌肉中提取牡蛎的全基因组DNA(参见萨姆布鲁克J，弗里奇EF，蔓尼阿蒂斯T，着.分子克隆实验指南[M].金冬雁，黎孟枫，侯云德，等译.第2版.科学出版社.1992，63-481.)。
所述EST-SSRs引物设计：从NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)的EST库中搜索太平洋牡蛎的EST序列，然后用在线软件SSRIT(http://www.gramene.org/db/markers/ssrtool)找出含有微卫星的EST序列，根据这些含有微卫星的EST序列利用在线引物设计软件Premier3.0(http://frodo.wi.mit.Edu/cgibin/primer3/primer3_www.cgi)设计EST-SSRs引物，引物设计主要参数为：引物长18-22bp，最适20bp；引物退火温度55-65℃，上下引物之间退火温度不超过5℃；GC含量40％-60％，最适50％；PCR预期产物长150-300bp。
所述EST-SSRs引物设计：设计适用于太平洋牡蛎的引物序列：
F--------5’GCAGAGATGGTCTGGAAAGC 3’
R---------5’CTGGCTGGAGAAGAACAAGG 3’。
所述EST-SSRs的PCR扩增：以提取的全基因组DNA样品分别为模板，对EST-SSRs引物进行PCR扩增。
所述EST-SSRs特异位点的鉴定：首先经过琼脂糖凝胶电泳，得到扩增条带稳定、条带清晰的PCR产物；再进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，扩增条带稳定、条带清晰且有多态性的EST-SSRs引物即是太平洋牡蛎群体。
为检测本发明鉴定方法的精确度，对牡蛎群体特异性微卫星位点的等位基因纯合体的基因型的序列测定，进行验证：对这个特异位点的纯合体的基因序列进行其扩增产物纯化；将纯化后的标记克隆到载体上，然后测定其DNA碱基序列加以验证。
本发明是以太平洋牡蛎的EST序列设计引物的序列。太平洋牡蛎群体在位点S5PCR扩增产物在聚丙烯酰胺凝胶凝胶电泳上有两个等位基因，表现出此位点的多态性(见图3)；而其他牡蛎群体中在聚丙烯酰胺凝胶凝胶电泳上只有一条带，即一个等位基因存在，没有的多态性(见图4)。即位点S5在太平洋牡蛎群体中有多态性，而在褶牡蛎和近江牡蛎等群体中没有。依据聚丙烯酰胺凝胶凝胶电泳图谱上的多态性，从而达到从牡蛎群体中分离太平洋牡蛎群体的目的。该方法省时有效且可靠性强，可以作为经济牡蛎遗传种质鉴定、系统进化分析、选育和杂交育种工作提供了依据。
本发明的优点是：本发明利用了EST-SSRs分子标记技术应用于不同种群牡蛎进行了遗传分析，引物设计合理，二步电泳检测，达到鉴定太平洋牡蛎种群的目的，方法简单，省时且分析准确。本发明利用EST-SSRs分子标记技术研究太平洋牡蛎的遗传结构使其区别于近江牡蛎、褶牡蛎的遗传信息，从分子水平揭示太平洋牡蛎与其他几种群之间的遗传变异，找到了区分群体遗传结构稳定的重复性好的EST-SSRs的标记位点，为牡蛎的种质资源保护提供有力的科学依据。
附图说明：
图1显示的是牡蛎基因组琼脂糖凝胶电泳图
图2显示的是太平洋牡蛎养殖群体在位点S5PCR扩增后琼脂糖凝胶电泳图。
图3显示的是太平洋牡蛎养殖群体在位点S5的EST-SSRs聚丙烯酰胺凝胶电泳。
图4褶牡蛎、近江牡蛎等群体的在位点S5EST-SSRs聚丙烯酰胺凝胶电泳图。
图5太平洋牡蛎位点S5的微卫星测序图(纯合体)。
具体实施方式：
下面结合具体实施例对本发明用进一步的详细描述，但本发明并不局限于具体实施例：
实施例1
鉴定太平洋牡蛎种群的新方法，按下述工艺过程进行鉴定。
1、样本采集：
褶牡蛎自然群体40个样本采自于大连开发区海域；太平洋牡蛎养殖群体40个样本购自天津王顶堤水产品市场；近江牡蛎40个样本购自海南省海口山高鲜活水产品批发市场。每个牡蛎取其闭壳肌放入1.5ml离心管中，加入95％乙醇后放入-20℃冰箱中保存备用。
2、基因组的提取：
按照酚-仿抽提法提取三个牡蛎群体120个个体的总DNA，经0.8％的琼脂糖电泳检测，大多数的DNA都比较完整，样品的片段大小在23kb左右，基本不含其它杂质及RNA，可以用来进行PCR的扩增。如图1显示的是部分DNA检测的结果。
3、EST-SSRs引物设计：
从NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)的EST库中搜索太平洋牡蛎的EST序列，然后用在线软件SSRIT(http://www.gramene.org/db/markers/ssrtool)找出含有微卫星的EST序列，根据这些含有微卫星的EST序列利用在线引物设计软件Premier3.0(http://frodo.wi.mit.Edu/cgibin/primer3/primer3_www.cgi)设计EST-SSRs引物，共设计了50对引物，引物设计主要参数为：引物长18-22bp，最适20bp；引物退火温度55-65℃，上下引物之间退火温度不超过5℃；GC含量40％-60％，最适50％；PCR预期产物长150-300bp。由上海生工生物工程技术有限公司合成。适用于太平洋牡蛎的引物序列：
F--------5’GCAGAGATGGTCTGGAAAGC 3’
R---------5’CTGGCTGGAGAAGAACAAGG 3’。
4、EST-SSRs的PCR扩增：
DNA片段的定性检测可以用琼脂糖凝胶电泳检测。首先对上述EST-SSRs引物进行梯度PCR扩增。
5、EST-SSRs的特异位点的鉴定：
琼脂糖凝胶电泳分辨率较低，PCR扩增DNA片段产物的长度相差在15bp以下时则难以区分，只能作初步判断，不可检测差异很小往往是几个碱基的微卫星多态性。所以，本发明先采用琼脂糖凝胶电泳检测，再采用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，分析微卫星多态性。
(一)琼脂糖凝胶电泳
PCR产物经过琼脂糖凝胶电泳检测，目的片段在范围内表现为单一条带，如图2所示。
(二)聚丙烯酰胺凝胶电泳
(1)玻璃板的清洗：用试管刷沾上洗涤剂把玻璃板擦洗干净后，用清水冲洗干净，放入烘箱备用。
(2)凝胶的灌制：玻璃板清洗干净并且烘干后，用胶条将两块板子底部封住，然后用夹子固定好。将配制好的胶液(30％丙烯酰胺溶液10ml，5倍TBE6ml，双蒸水14ml，10％过硫酸胺溶液200μl，TEMED15μl)沿着梳子插槽边缘缓慢地倒入玻璃板的空隙中(不能产生气泡)，然后立即插入梳子。如果出现气泡，可以轻轻敲玻璃板，使气泡溢出。一般聚合30min便可聚合完全。如室温较低时，聚合时间适当延长。
(3)上样与凝胶电泳：划开玻璃板下端胶带，固定在电泳槽上，电泳槽上端加满1倍TBE。用注射器冲洗加样孔(轻柔)。
(4)140V电压，预电泳15分钟，同时准备点样。
(5)扩增产物与上样缓冲液按体积比1∶5混匀后，用移液枪加入点样孔内。点样后，不可挪动电泳槽或取下玻璃板。1倍TBE，130V恒压电泳6个小时。
(三)、银染方法来观察结果
银染按照许绍斌的方法并略作改进，具体步骤如下：
(1)凝胶的固定：电泳结束后，关闭电泳仪，拿出玻璃板并用小刀小心撬开，移走上层玻璃板，轻轻用小刀把胶剥开一角，放入加有固定液的瓷盘中(固定液10％乙醇溶液，每板用量为200ml)在摇床上缓缓摇动10min。
(2)洗胶：倒掉瓷盘中的固定液，用双蒸水洗3次，共计1min；
(3)凝胶的染色：倒掉瓷盘中的水，加入染色液(0.1％AgNO₃溶液，每板200ml)，在摇床上缓缓摇动染色15min；
(4)洗胶：倒掉瓷盘中的染色液，用双蒸水洗3次，共计1min；
(5)显色：加入显色液(2g NaOH，0.1g Na₂CO₃，加双蒸水到250ml，在加入800μl甲醛)，振荡显色，一般5-15min内，带型显现。
(6)终止：待带型清晰时，将胶用清水冲洗干净，以防止污染仪器，然后放置在扫描仪上扫描。(在胶上铺一层吸水纸以防止扫描仪盖子与聚丙烯酰胺凝胶之间的气泡影响扫描效果。)
经过琼脂糖凝胶电泳检测的有清晰且稳定条带的PCR产物，再进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，最后此引物在太平洋牡蛎群体表现出特异性条带清晰并且有多态性。
太平洋牡蛎群体在位点S5PCR扩增产物在聚丙烯酰胺凝胶凝胶电泳上有两个等位基因，表现出此位点的多态性(见图3)；而其他牡蛎群体中在聚丙烯酰胺凝胶凝胶电泳上只有一条带，即一个等位基因存在，没有的多态性(见图4)。位点S5在太平洋牡蛎群体中有多态性，而在褶牡蛎和近江牡蛎等群体中没有。
实施例2：
牡蛎群体特异性微卫星位点的等位基因纯合体的基因型的序列测定，为了进一步说明上述特殊位点，本发明对这特异性位点的纯合体基因型进行了克隆，具体过程如下：
经过PCR扩增后的PCR产物100ml经过纯化后进行连接反应，提前制备LB液体培养基和LB固体培养基，连接反应进行完毕后，连接液在无菌操作台上进行涂板，然后在培养箱中培养，培养结束后在4度冰箱里进行显色反应，然后挑取白色的大小适中的单个菌落在液体培养基中摇菌，摇菌过程也是在培养箱中进行。最后以菌液为模板进行PCR检测，在琼脂糖凝胶电泳上检测PCR产物，如果胶上有目标片段，证明克隆成功，然后将菌液送至大连宝生物工程有限公司进行测序。测序结果见图5。从测序的峰图5可以看出，这些位点是的微卫星，如位点S5在太平洋牡蛎的纯合体中分别含有7个微卫星。
通过以上说明：本发明提供了一种很好的鉴别太平洋牡蛎种群的方法，在三个牡蛎群体的研究中，基因座位S5，在太平洋牡蛎群体中有2个等位基因表现多态，而在褶牡蛎自然群体和近江牡蛎养殖群体中没有扩增出特异条带。这个位点可以作为区分种群的特异性标记。