一种从红树莓果实中提取超氧化物歧化酶的方法 【技术领域】
本发明属于生物技术领域，特别涉及利用生物技术从红树莓果实中提取超氧化物歧化酶(SOD)的方法。
背景技术
超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD，EC)是一种金属酶，分子量为31000-33000，由两个亚基组成。SOD酶广泛存在于生物体中，催化氧自由基的歧化反应，从而清除对生物体有强烈毒性的超氧化物自由基，对生物体起保护作用。因此SOD具有抗炎症、抗衰老、抗辐射损伤及抗肿瘤作用，并已应用于医药、化妆品和食品等领域。由于具有巨大的药用价值和广阔的应用前景，多年来对SOD的研究与应用一直受到科学界和企业界的极大关注。
目前，国内的SOD生化制品主要是从动物血液和动物肝脏的红细胞中提取的。从高等植物中提取SOD于20世纪90年代开始研究，如中国轻工业出版社出版的《功能性食品》第一卷所介绍的从小白菜叶中提取SOD。目前从植物中提取SOD的工艺流程：植物组织或器官→离心收集上清液→硫酸铵分级沉淀→收集沉淀→水或缓冲液溶解→丙酮沉淀→PH7.8磷酸盐缓冲液溶解→离心除去不溶杂蛋白→透析→Biogel P-60柱层析→收集活力组分→硫酸铵沉淀→PH7.8磷酸盐缓冲液溶解→透析→DE-32柱层析→收集活力组分→浓缩得到SOD成品。
相关资料表明，国内外有关SOD分离提取工艺中均采用乙醇、丙酮有机溶剂。若大规模生产SOD，需回收乙醇、丙酮有机溶剂，不仅浪费人力物力，而且有机溶剂易燃易爆，用于工业生产将有重大的安全隐患。
【发明内容】
本发明的目的是提供一种从红树果实中提取超氧化物歧化酶(SOD)的方法。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
从红树莓果实中提取超氧化物歧化酶的方法按下述步骤：
1)抽提：将磷酸盐缓冲液分两次加入到100g速冻红树莓中，抽提1-2小时，保留上清液待用；其中红树莓与磷酸盐缓冲液按1.0∶1.0-1.5(G∶V)混合；
2)盐析：将上述上清液内先后加入100-150ml的50％饱和度的硫酸铵和100-150ml的90％饱和度的硫酸按，每次加入后均放置在4℃冷藏静置1-2h再冷冻离心，取两次所得沉淀用磷酸盐缓冲液溶解；溶解后在4℃下透析30-50小时；而后经聚乙二醇浓缩，浓缩液以12000-15000r/min下-10℃冷冻离心10-20min收集上清液；
3)柱层析：将上述上清液用磷酸盐缓冲液洗进行柱层析，将各洗脱液经紫外检测收集230-500nm的活性峰，而后经聚乙二醇浓缩，浓缩液以12000-15000r/min下-10℃冷冻离心10-20min收集上清液，待用；
4)金属螯合亲和层析：将上述上清液上金属螯合亲和层析柱，用pH5.0柠檬酸缓冲液洗脱，将各洗脱液经紫外检测收集230-500nm的活性峰，经透析除去无机盐，即得超氧化物歧化酶。
所述步骤1中分两次加入到红树莓中的磷酸盐缓冲液用量相同；先加入的磷酸盐缓冲液中加入1-2g石英砂，而后连同红树莓在冰盐浴下充分研磨；在12000-15000r/min离心条件下高速冷冻离心30-40min，使悬浮物完全沉淀，取沉淀再加入另一部分磷酸盐缓冲液冰盐浴充分研磨，低温冰盐浴配方为碎冰用量100克，浴温-4℃，采用的盐类是CaCl2·6H2O用量为20g。高速冷冻离心，弃去沉淀合并两次上清液，待用。所述步骤1和2中磷酸盐缓冲液为pH7.8，浓度50mmol/L，其具体配方为磷酸氢二钠10.3736g/L；磷酸二氢钠1.55835g/L。所述步骤2中上清液加入100-150ml的50％饱和度的硫酸铵后冷冻离心为12000-15000r/min下冷冻离心10-20min；加入100-150ml的90％饱和度的硫酸铵后冷冻离心为12000-15000r/min下冷冻离心20-30min。所述步骤3中层析柱为SephadexG-100，流速为0.3-0.5mL/min，每管收集3-5mL；所述洗脱液为pH7.8，2.5-3.0mmol/L磷酸盐缓冲，其具体配方为磷酸氢二钠5.1868-6.22416g/L；磷酸二氢钠0.779175-0.93501g/L。所述步骤4)金属螯合亲和层析柱，采用用0.1-0.2mol/L的CuSO4作为离子载体，用pH5.0，0.1-0.2mol/L柠檬酸缓冲液洗脱，流速为0.3-0.5mL/min，每管收集3-5mL。
本发明所具有的优点：
本发明以速冻红树莓果实为原料，经抽提、盐析、柱层析和金属螯合亲和层析，提取SOD粗制品，提高粗制品的得率，制备出稳定的高活性的SOD。本发明所述红树莓果实中SOD的提取工艺，具有工艺简单、成本低、提取率高、对SOD产品活性损伤程度小、无环境污染且适合工厂化生产等特点。应用该方法提取的SOD具有活性高和稳定性好等特点，在医药、保健品及化妆品工业中具有巨大的应用潜力。同时可以解决现有方法中采用有机溶剂提取导致生产成本高，需回收乙醇、丙酮等有机溶剂，浪费人力物力，及有机溶剂易燃易爆，用于工业生产将有重大安全隐患等一系列问题。
【附图说明】
图1为本发明Sephadex G-100柱层析洗脱曲线。
【具体实施方式】
实施例1
1)抽提：取100g冷冻树莓，按1.0∶1.0(G∶V)比例加入pH7.8，50mmol/L的磷酸盐缓冲液100mL，先加人50mL磷酸盐缓冲液和1g石英砂，在冰盐浴的条件下充分研磨；在12000r/min离心条件下-10℃高速冷冻离心40min，使悬浮物完全沉淀，取沉淀再加入50mL的磷酸盐缓冲液冰盐浴充分研磨，并以上述离心条件高速冷冻离心；弃去沉淀合并两次上清液，在抽提1小时，保留上清液待用；
2)盐析：向上清液中加100ml的50％饱和度的硫酸铵，4℃冷藏静置1h，而后以12000r/min下冷冻离心10min；取上清液再加100ml的90％饱和度的硫酸按，冷藏静置1h，12000r/min下-10℃冷冻离心10min；沉淀用pH7.8，30mmol/L的磷酸盐缓冲液溶解，溶解后在4℃下透析30小时；而后经聚乙二醇浓缩，浓缩液以12000r/min下-10℃冷冻离心10min收集上清液；
3)SephadexG-100柱层析：将上述上清液上SephadexG-100层析柱(柱体为1.6×60cm)，用pH7.8，2.5mmol/L磷酸盐缓冲液洗脱，流速为0.3mL/min，每管收集3mL；将各洗脱液经紫外检测收集230nm的活性峰同时检测其酶活性，合并230nm的活性峰，而后经聚乙二醇浓缩，浓缩液以12000r/min下-10℃冷冻离心10min，收集上清液待用；
4)金属螯合亲和层析：将得到的SOD浓缩液上Metals ChelatingAffinity Chromatogram(金属螯合亲和层析柱，柱体为1.0cm×40cm)，用0.1mol/LCuSO4作为离子载体，同时采用pH5.0，0.1mol/L柠檬酸缓冲液洗脱，流速为0.3mL/min，每管收集3mL；将各洗脱液经紫外检测收集230nm的活性峰同时检测其酶活性，合并230nm的活性峰，经透析除去无机盐，即得超氧化物歧化酶。而后将其浓缩、冷冻、干燥后得到超氧化物歧化酶成品。
实施例2
与实施例1不同之处在于：1)抽提：取100g冷冻树莓，按1.5∶1(G∶V)比例加入pH7.8，50mmol/L的磷酸盐缓冲液150mL，分两次加入到红树莓中的磷酸盐缓冲液用量相同；首次加入时磷酸盐缓冲液中加入2g石英砂，在12000r/min离心条件下-10℃高速冷冻离心40min，弃去沉淀合并两次上清液；在抽提2小时，保留上清液待用；
2)盐析：向上清液中加入150ml的50％饱和度的硫酸铵，4℃冷藏静置2h，而后以12000r/min下冷冻离心20min；取上清液再加150ml的90％饱和度的硫酸按，冷藏静置1h，15000r/min下冷冻离心20min；沉淀用pH7.8，50mmol/L的磷酸盐缓冲液溶解，溶解后在4℃下透析50小时；而后经聚乙二醇浓缩，浓缩液以15000r/min下-10℃冷冻离心20min收集上清液；
3)SephadexG-100柱层析：用pH7.8，3.0mmol/L磷酸盐缓冲液洗脱，流速为0.5mL/min，每管收集5mL；将各洗脱液经紫外检测收集400nm的活性峰，合并400nm的活性峰，而后经聚乙二醇浓缩，浓缩液以15000r/min下-10℃冷冻离心20min，收集上清液；
4)金属螯合亲和层析：用0.2mol/LCuSO4作为离子载体，同时采用pH5.0，0.2mol/L柠檬酸缓冲液洗脱，流速为0.5mL/min，每管收集5mL；将各洗脱液经紫外检测收集400nm的活性峰同时检测其酶活性，合并400nm的活性峰，经透析除去无机盐，即得超氧化物歧化酶。
实施例3
与实施例1不同之处在于：1)抽提：取100g冷冻树莓，按1.0∶1.2(G∶V)比例加人pH7.8，50mmol/L的磷酸盐缓冲液120mL，分两次加入到红树莓中的磷酸盐缓冲液用量相同；首次加入时磷酸盐缓冲液中加入1.5石英砂，均在15000r/min下高速冷冻离心15min，弃去沉淀合并两次上清液；在抽提1.5小时，保留上清液待用；
2)盐析：向上清液中加120ml的50％饱和度地硫酸铵，冷藏静置1.5h，12000r/min下冷冻离心15min；取上清液加120ml的90％饱和度的硫酸按，冷藏静置1.5h，15000r/min下冷冻离心25min；沉淀用pH7.8，40mmol/L的磷酸盐缓冲液溶解；并在4℃下对该缓冲液透析40小时；聚乙二醇浓缩；15000r/min下冷冻离心15min收集上清液；
3)SephadexG-100柱层析用pH7.8，2.8mmol/L磷酸盐缓冲液洗脱，流速为0.3mL/min，每管收集3mL；将各洗脱液经紫外检测收集280nm的活性峰，合并280nm的活性峰，收集上清液，待用；
4)金属螯合亲和层析：用0.15mol/LCuSO4作为离子载体，同时采用pH5.0，0.15mol/L柠檬酸缓冲液洗脱，流速为0.5mL/min，每管收集5mL；将各洗脱液经紫外检测收集280nm的活性峰同时检测其酶活性，合并280nm的活性峰，经透析除去无机盐，即得超氧化物歧化酶。
实施例4红树莓果实中SOD提取结果
1)酶活力测定：采用NBT光还原法，酶活性单位采用抑制NBT光化学还原50％为一个酶活性单位表示。
2)蛋白质含量测定：采用Lowery法，以牛血清白蛋白作标准。(参见下表)