一种雌激素受体拮抗剂类内分泌药物耐药性的预测方法 【技术领域】
本发明属于生理生化检测领域，涉及一种基于检测乳腺癌ERα和ERβ相对表达水平的雌激素受体拮抗剂类内分泌药物耐药性的预测方法。
背景技术
乳腺癌是一种激素诱发的肿瘤，全球每年约有120万妇女发生乳腺癌，有50万的妇女死于乳腺癌，在西欧、北美等发达国家，乳腺癌的发病率占女性恶性肿瘤首位；我国乳腺癌的发病率近年来不断地上升，并出现了年轻化的趋势。根据乳腺癌激素诱发的特点，对患者进行内分泌治疗已有100多年的历史。目前，针对雌激素受体(estrogen receptor，ER)作为治疗靶点，以雌激素受体拮抗剂，作为对ER阳性乳腺癌的第一线疗法之一。
ER属于核受体超家族的成员之一，是一种配体依赖性转录因子，它与雌激素特异性结合，通过雌激素应答元件(ERE)来调节基因的转录。人类ER有两种亚型，即ERα和ERβ，分别定位于6号和14号染色体，其相对分子量分别为65和59kDa，编码ERα和ERβ的基因其NCBI Genbank ERα和ERβ的GeneID分别为2099和2100。ER是多结构域蛋白，分为6个结构域，按功能又可分为4个功能域：转录激活功能域、DNA结合域、配体结合域和受体变构过程中的铰链区。
在发现了第一个雌激素受体ERα后约10年，人们于1996年成功地克隆鉴定了第二个雌激素受体ERβ。两者具有相似的生化特征，氨基酸序列具有一定的同源性，并且两者的功能区非常相似，结构上的相似性使两种受体均可以识别并结合相似的ERE，但是这两种受体结合的配体并不完全相同。临床上使用雌激素受体拮抗剂治疗乳腺癌的原理就是利用拮抗剂与17β-雌二醇竞争性结合ERα，减低雌激素对靶器官的刺激作用。近年来发现许多存在于植物中的非甾体化合物，其结构和生物活性类似于雌激素，被称为植物雌激素。研究较多的植物雌激素包括异黄酮类、木酚素类、香豆素类、真菌雌激素类及非黄酮类多酚化合物，如白藜芦醇等。这些植物雌激素主要选择性的与ERβ结合，而与ERα亲和力较低。ERα主要分布于子宫、乳腺、胎盘、肝脏、中枢神经系统、心血管系统、骨骼等雌激素的靶组织，而ERβ的分布更为广泛。除了上述在配体结合及组织分布方面的不同外，ERα和ERβ的转录活性及其与协同因子的相互作用也往往不同，提示两者的功能和生物学效应存在很大差别。
雌激素受体拮抗剂是目前应用最多的内分泌治疗方法，广泛应用于各期乳腺癌一线内分泌治疗。它能与雌激素竞争激素受体，阻断雌激素相关基因的表达，使癌细胞维持在G1期，从而减慢细胞的分裂和生长。但约有30％的患者接受他莫昔芬(三苯氧胺)类药物内分泌治疗并没有取得明显的治疗效果，但其抗药原因目前不清，对其耐药机制的研究也成为热点。
雌激素受体(ER)作为乳腺癌病人预后因子以及治疗靶点有着重要的临床意义，肿瘤活检检测ER已经成为选择治疗方案的常规步骤。目前，临床实验室采用免疫组织化学法检测乳腺癌的ER表达水平时，使用的抗体大多只针对ERα或不能有效的区分ERα和ERβ。临床乳腺癌组织活检只根据ERα的表达情况考虑是否使用他莫昔芬类雌激素受体拮抗药物，而忽视ERβ的检测造成部分病人出现耐药反应以及子宫内膜癌等副作用。
随着医疗水平的提高，针对不同的患者的具体情况，结合相关治疗靶点的表达状态，提出乳腺癌个体化治疗方法，能够有效的避免用药的副作用，提高治疗、预后效果。
【发明内容】
本发明的解决的问题在于提供一种雌激素受体拮抗剂类内分泌药物耐药性的预测方法，该方法采用实时定量PCR法检测ERα和ERβ在乳腺癌的相对表达水平，预测雌激素受体拮抗剂类内分泌药物耐药性，为指导临床乳腺癌个体化用药提供可行性基础。
本发明是通过以下技术方案来实现：
一种雌激素受体拮抗剂类内分泌药物耐药性的预测方法，采用实时定量PCR法检测ERα和ERβ在乳腺癌的相对表达水平，以对雌激素受体拮抗剂类内分泌药物耐药性做出预测，具体包括以下步骤：
1)设计并合成ERα的PCR扩增引物对P1和ERβ的PCR扩增引物对P2：
引物对P1为：
上游引物：gcagggagag gagtttgtgt 20；
下游引物：atgtgggaga ggatgaggag 20；
引物对P2为：
上游引物：tgtctgcagc gattacgca 20；
下游引物：gcgccggttt ttatcgatt 19；
2)作为对照的正常组织ERα和ERβ基因的mRNA表达水平检测：
以乳腺癌旁5cm外的乳腺组织作为正常组织，破碎乳腺癌旁5cm外的乳腺活检组织细胞，提取细胞总RNA，反转录获得其cDNA基因组作为模板，分别以P1和P2作为引物，相对实时荧光PCR检测ERα和ERβ基因地mRNA表达水平作为正常对照；
3)待测乳腺癌ERα和ERβ基因的mRNA相对表达水平检测：
破碎待测乳腺癌活检组织的细胞，提取细胞总RNA，反转录获得其cDNA基因组作为模板，分别以P1和P2作为引物，相对实时荧光PCR检测ERα和ERβ基因的mRNA相对表达水平；
4)将待测乳腺癌活检组织的ERα和ERβ基因的相对表达水平与正常对照进行对比，分析雌激素受体拮抗剂类内分泌药物的耐药性：
当待测乳腺癌活检组织的ERα/ERβ的比值大于正常对照的ERα/ERβ的比值时，该待测乳腺癌活检组织对雌激素受体拮抗剂类内分泌药物表现为不耐药性；否则，该待测乳腺癌活检组织对雌激素受体拮抗剂类内分泌药物表现为耐药性。
所述的雌激素受体拮抗剂类内分泌药物为：雌激素衍生物、甾体类复合物或非甾体复合物。
与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
1、本发明提供的基于检测乳腺癌ERα和ERβ相对表达水平的雌激素受体拮抗剂类内分泌药物耐药性的预测方法，为指导临床乳腺癌个体化用药提供可行性基础，能够减少盲目用药导致的耐药反应和副作用。
2、本发明提供的实时荧光定量PCR分析ERα和ERβ相对表达水平，克服了目前免疫组织化学法检测乳腺癌的ER表达水平时忽视ERβ的检测；而且mRNA水平的检测准确、方便，以病人自身的乳腺活检组织作为正常对照，对其癌组织的ERα和ERβ相对表达水平检测具有特异性，而且在扩增引物统一的基础上便于标准化的实施。
3、本发明提供的检测ERα和ERβ引物的溶解曲线为单一峰，保证扩增产物的特异性，提高了检测的准确性。
4、本发明提供的预测方法还与药物使用的预后性相关，ERα/ERβ比值大于正常对照组病例的无复发生存率和总生存率均明显高于ERα/ERβ比值小于正常对照组。
【附图说明】
图1为是以ERα/ERβ双阳性表达的乳腺癌细胞T-47D的cDNA基因组为模版，实时定量PCR绝对定量检测表明引物对P1扩增的ERα溶解曲线为单一峰，其中横坐标为温度，纵坐标为实时定量PCR荧光值；
图2为是以ERα/ERβ双阳性表达的乳腺癌细胞T-47D的cDNA基因组为模版，实时定量PCR绝对定量检测表明引物对P2扩增的ERβ溶解曲线为单一峰，其中横坐标为温度，纵坐标为实时定量PCR荧光值；
图3是实时定量PCR相对定量检测ERα表达水平的直方图，以正常乳腺组织ERαmRNA表达水平作为参照，16例病理报告ER阳性乳腺癌中，6例癌标本ERα的表达高于正常对照，10例癌标本ERα的表达低于正常对照；
图4是实时定量PCR相对定量检测ERβ表达水平的直方图，以正常乳腺组织ERβmRNA表达水平作为参照，16例病理报告ER阳性乳腺癌中，11例癌标本ERβ的表达低于正常对照，5例癌标本ERβ的表达与正常对照无显著差异；
图5是基于实时定量PCR相对定量检测ERα/ERβ的直方图，以正常乳腺组织ERα与ERβmRNA比值作为参照，16例病理报告ER阳性乳腺癌中，7例癌标本ERα/ERβ比值大于正常组，9例癌标本ERα/ERβ比值小于正常组。
【具体实施方式】
下面对本发明做详细描述，所述是对本发明的解释而不是限定。
本发明对临床乳腺癌组织ER阳性，并服用雌激素受体拮抗药物的长期随访病人作为检测对象，总结得到一种雌激素受体拮抗剂类内分泌药物(雌激素衍生物、甾体类复合物或非甾体复合物)耐药性的预测方法，采用实时定量PCR法检测ERα和ERβ在乳腺癌的mRNA相对表达水平，以对雌激素受体拮抗剂类内分泌药物耐药性做出预测，具体包括以下步骤：
1)设计并合成ERα的PCR扩增引物对P1和ERβ的PCR扩增引物对P2：
引物对P1为：
上游引物：gcagggagag gagtttgtgt 20；
下游引物：atgtgggaga ggatgaggag 20；
引物对P2为：
上游引物：tgtctgcagc gattacgca 20；
下游引物：gcgccggttt ttatcgatt 19；
并以β-actin基因的扩增作为内参照，其扩增的引物对为：
上游引物：atcatgtttg agaccttcaa ca 22；
下游引物：catctcttgc tcgaatcca 19；
提取ERα/ERβ双阳性表达的乳腺癌细胞T-47D细胞总RNA，反转录其基因组cDNA，并以其cDNA为模板实时荧光PCR绝对定量扩增ERα和ERβ，检测P1和P2作为扩增引物的特异性；结果如图1、图2所示，引物对P1扩增的ERα、引物对P2扩增的ERβ其溶解曲线均为单一峰，表明引物对P1、P2能够特异性的扩增ERα、ERβ；
所述实时荧光定量PCR技术出现于1996年，该技术的核心是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累，实时监测整个PCR进程，通过最后扩增的目标片段数量(通过分析荧光强度得出)对模板包含的目标基因定量分析的方法。实时荧光定量PCR的化学原理包括探针类和非探针类两种，探针类是利用与靶序列特异杂交的探针来指示扩增产物的增加，非探针类则是利用荧光染料或者特殊设计的引物来指示扩增的增加。前者由于增加了探针的识别步骤，特异性更高，但后者则简便易行，本发明采用非探针类。实时荧光定量PCR分为绝对定量和相对定量，绝对定量用于判断引物的优劣及扩增产物的特异性；相对定量用于分析不同样品的mRNA表达量的差异。
实时荧光定量PCR采用Takara公司的Green实时荧光定量PCRMaster Mix，该Mix里含有Green I可用于未标记引物的掺入法实时荧光定量PCR，每个样本分别扩增目的基因和内参照基因，并分别设两个复孔。
实时荧光定量PCR反应体系为：
Green Realtime PCR Mix 12.5μl
Rox 0.5μl
cDNA 5μl
上游引物(10pM/μl) 1μl
下游引物(10pM/μl) 1μl
水 5μl
实时荧光定量PCR反应条件：
绝对定量：95.0℃预变性10s，95.0℃变性5s，60.0℃退火及延伸34s，40个循环；95.0℃变性15s，60.0℃退火及延伸60s，95.0℃变性15s，1个循环。
相对定量：95.0℃预变性10s，95.0℃变性5s，60.0℃退火及延伸34s，共45个循环；相对定量实时荧光定量PCR以正常对照设定为1，测出待测目标与正常对照的相对比值，分析其mRNA表达量的差异。
2)作为对照的正常组织ERα和ERβ基因的mRNA表达水平检测：
医学上判定乳腺癌旁5cm外的乳腺组织为正常组织，实时荧光PCR检测其ERα和ERβ基因的mRNA表达水平作为正常对照；
待测乳腺癌旁5cm外的乳腺活检组织中加入试剂Trizol，使用匀浆器破碎细胞，提取细胞总RNA，反转录获得其cDNA基因组作为模板，以β-actin的扩增作为内参照，分别以P1和P2作为引物，相对实时荧光PCR检测ERα和ERβ的表达量作为正常对照；
3)待测乳腺癌组织ERα和ERβ基因的mRNA相对表达水平检测：
分离待测乳腺癌活检组织中加入试剂Trizol，使用匀浆器破碎细胞，提取细胞总RNA，反转录获得其cDNA基因组作为模板，以β-actin基因的扩增作为内参照，分别以P1和P2作为引物，相对实时荧光PCR检测ERα和ERβ基因的mRNA相对表达水平；
按照上述2)、3)所述方法，对临床乳腺癌组织ER阳性，并服用他莫昔芬类雌激素受体拮抗药物的长期随访病人作为检测对象，以其自身的乳腺癌旁5cm的乳腺活检组织的ERα和ERβmRNA表达水平作为正常对照；分析其乳腺癌活检组织ERα和ERβmRNA相对表达水平：
实时定量PCR结果表明16例长期随访乳腺癌病人中，6例癌标本ERα的表达高于正常对照，10例癌标本ERα的表达低于正常对照，参见图3；11例癌标本ERβ的表达低于正常对照，5例癌标本ERβ的表达与正常对照无显著差异，参见图4；
4)将待测乳腺癌ERα和ERβ基因的相对表达水平与正常对照进行对比，分析雌激素受体拮抗剂类内分泌药物的耐药性
上述16例长期随访乳腺癌病人中，实时定量PCR结果表明：7例癌标本ERα/ERβ比值大于正常组，9例癌标本ERα/ERβ比值小于正常组；结合病人的随访资料，7例ERα/ERβ比值大于正常组的乳腺癌患者均未出现耐药，而另外9例ERα/ERβ比值小于正常组的患者有5例出现耐药，而且ERα/ERβ比值大于正常组病例的无复发生存率和总生存率均明显高于ERα/ERβ比值小于正常组病例，具体数据参见表1，根据表1绘制的直方图参见图5。
表1ERα/ERβ检测结果及对于服用药物的耐药反应对照表
其中，三苯氧胺属于雌激素衍生物，法乐通属于雌激素衍生物，氟维司群属于甾体类复合物，枢瑞属于雌激素衍生物。
总结得到ERα和ERβ基因的相对表达水平与雌激素受体拮抗剂类内分泌药物的耐药性的相关性为：
当待测乳腺癌活检组织的ERα/ERβ比值大于正常对照时，待测乳腺癌活检组织对雌激素受体拮抗剂类内分泌药物表现为不耐药性；
当待测目标ERα/ERβ比值小于正常对照组时，其雌激素受体拮抗剂类内分泌药物耐药性为耐药性；虽然上述随访结果表明ERα/ERβ比值小于正常对照组时可能为不耐药性，但由于ERα/ERβ比值大于正常组病例的无复发生存率和总生存率均明显高于ERα/ERβ比值小于正常组病例，因此，总体上将待测乳腺癌活检组织的ERα/ERβ比值小于正常对照组时，待测乳腺癌活检组织对雌激素受体拮抗剂类内分泌药物表现为归结为耐药性。
核苷酸序列表
<110>中国人民解放军第四军医大学
<120>一种雌激素受体拮抗剂类内分泌药物耐药性的预测方法
<160>6
<210>1
<211>20
<212>DNA
<213>人工合成的引物对P1的上游引物
<400>1
gcagggagag gagtttgtgt 20
<210>2
<211>20
<212>DNA
<213>人工合成的引物对P1的下游引物
<400>2
atgtgggaga ggatgaggag 20
<210>3
<211>20
<212>DNA
<213>人工合成的引物对P2的上游引物
<400>3
tgtctgcagc gattacgca 20
<210>4
<211>20
<212>DNA
<213>人工合成的引物对P2的下游引物
<400>4
gcgccggttt ttatcgatt 19
<210>5
<211>22
<212>DNA
<213>人工合成的β-actin基因扩增的上游引物
<400>5
atcatgtttg agaccttcaa ca 22
<210>6
<211>19
<212>DNA
<213>人工合成的β-actin基因扩增的下游引物
<400>6
catctcttgc tcgaatcca 19