一种黑曲霉菌种及其在厌氧发酵制备低聚果糖中的应用 【技术领域】
本发明属低聚果糖制备领域，涉及一种厌氧发酵法生产低聚果糖的方法。
背景技术
低聚果糖是指2～8个果糖基为链节，以一个葡萄糖基为链的端基，以果糖基→果糖连接键为主体骨架连结形成地功能性低聚糖。低聚果糖是一种能激活人体益生菌群增殖，促进人体微生态平衡的益生元，被公认为具有调节胃肠道功能、降低血酯、调节机体平衡、提高免疫力等健康作用，也是一种典型的水溶性膳食纤维，已被广泛用作功能性配料或者直接服用。
目前，国内外工业化生产的方法主要是先筛选出产低聚果糖酶菌种，然后破碎菌体制备固定化酶制剂，采用好氧发酵技术进行低聚果糖的生产，工艺路线较长，设备投入多。另外好氧发酵技术通风量大，无菌空气制备系统能耗高。通常制备的低聚果糖产品外观混浊、颜色黄、色泽差，产品透光率85％以下，产品应用范围受到限制，同时菌体只能利用一次。
【发明内容】
本发明的目的在于实现一种新的厌氧发酵生产低聚果糖产品方法，该方法可简化工艺路线，去除无菌空气制备系统，菌体实现回收循环利用，减少了设备投入，产品具有无色透明，透光率达到90％以上，保质期长，成本低等特点。
本发明提供了一种黑曲霉菌种(Aspergillus niger)BLB11，已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，地址为北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所，保藏时间2009年3月17日，保藏号CGMCC No.2952。
本发明同时提供了一种应用黑曲霉菌种(Aspergillus niger)BLB11厌氧发酵蔗糖溶液生产低聚果糖产品方法。包括黑曲霉BLB11生产用菌种的培养，使用生产菌种厌氧发酵蔗糖溶液和分离提纯、加工制备高纯度低聚果糖。
本发明采用的技术方案包括如下步骤：
1.菌种分离和筛选
从禹城市甜菜园土壤中分离得黑曲霉菌株BLB-09，操作方法如下：
称取10g土壤，加入90mL无菌水中，震荡摇匀，酒精擦拭后移入超净工作台。准备6支装有9mL无菌水的试管，编号1-6。用移液枪移取1000μL悬浊液置于1号试管，再移取1000μL 1号试管悬浊液置于2号试管，依次做六个试管梯度稀释。用移液枪分别取4、5、6号试管溶液各200μL(每个试管取2-4份)置于合适的培养基平板，用涂抹棒均匀涂抹，培养至平板长出成熟菌落，鉴定并分离纯化黑曲霉菌落，将单菌落接种斜面，并接种摇瓶，初筛测定产低聚果糖的转化率。根据摇瓶产低聚果糖的转化率水平筛选出斜面出发菌株-黑曲霉BLB-09。
分离斜面培养基：马铃薯30g、蔗糖3.0g、K2HPO40.1g、MgSO40.05g、1.5～2.0g琼脂，蒸馏水100mL，自然pH值，121℃灭菌1小时。培养温度28～30℃。
摇瓶种子培养基：麸皮3g、尿素0.5g、蔗糖5g、可溶性淀粉2g、K2HPO40.1g、MgSO40.05g，蒸馏水100mL，自然pH值，121℃灭菌1小时。培养温度28～30℃。
采用紫外线、微波及硫酸二乙酯复合诱变处理。通过产低聚果糖的转化率测定筛选得到优良的高产胞外酶菌株，用于厌氧发酵产低聚果糖的生产。具体操作步骤如下：
菌种诱变：
1)紫外线诱变：接种环挑取黑曲霉BLB-09斜面孢子于装有无菌水的三角瓶中，置于磁力搅拌器上振荡1h，使孢子萌发。将孢子悬液倒入含无菌大头针的无菌平皿。打开平皿盖，在事先预热好的20W的紫外灯下24cm处照射0s、20s、40s、60s、80s、100s、120s，不同照射剂量菌液稀释到10-1，黑暗处放置1h。再用生理盐水分别稀释菌液到10-3，吸取稀释好的菌液0.1mL涂布5°Be′麦芽汁琼脂培养基平板，每个稀释度涂布3个平板。将涂好的平皿用黑布包好，置生化培养箱28℃培养5d左右，至长出成熟菌落，统计致死率。
2)微波诱变：选取紫外诱变后致死率90％以上菌株进行筛选，得优良菌株UV-62继续微波处理。
采用频率为2450MHz，功率1200W的微波炉，低火，分别以0、20、40、60、80、100s辐射处理菌株UV-62，操作步骤如紫外诱变，然后菌液稀释涂布5°Be′麦芽汁琼脂培养基平板，培养5d，挑取单菌落至斜面培养。经筛选得优良菌株WB-26。
3)硫酸二乙酯诱变：对菌株WB-26进行硫酸二乙酯处理。取活化好的菌种WB-26斜面，用0.2mol/L，pH7.0的磷酸缓冲液洗下孢子，装入带玻璃珠的三角瓶中震荡2h，镜检菌悬液，调节孢子数为10-7-10-8/mL。取出制备好的孢子悬液10mL，加入1％硫酸二乙酯0.2mL，混匀后置于恒温震荡箱中，28℃，分别震荡10，20，30，40，50，60，70min，待反应完成后后，立即加入25％硫代硫酸钠溶液0.5mL终止反应。同时另取孢子悬液10mL。不加硫酸二乙酯作为对照。用0.2mol/L，pH7.0的磷酸缓冲液将对照及诱变后的孢子悬液分别稀释至10-4。分别吸取10-2、10-3、10-4的孢子悬液0.2mL加到5°Be′麦芽汁琼脂培养基平皿上涂布，然后置生化培养箱28℃培养5d左右，至长出成熟菌落，统计致死率，并从平皿中随机挑选单菌落，
筛选：选取平板菌落进行摇瓶培养，测定转化率。
转化率测定：以10％蔗糖溶液为底物，加入适量菌体细胞，总体积为20mL，置于三角瓶中，在最适反应温度，转速200r/min的恒温回旋式摇床中反应60min，取出于85℃水浴10min将菌体灭活，冷至室温，于10000r/min台式离心机上离心2min，取上层清液，作为HPLC法测定蔗果三糖含量的试液。从中筛选出高转化率菌株黑曲霉(Aspergillus niger)BLB11。
2、生产用菌种培养
产低聚果糖黑曲霉菌种BLB-11经斜面培养后，接入一级或二级种子培养基中培养，得到扩大培养的生产用菌种；定期镜检至菌丝生长到对数期末，然后即可转入发酵罐使用。
斜面培养基：5°Bé麦芽汁琼脂培养基：麦芽浸膏3克、葡萄糖10克、酵母浸膏3克、蛋白胨5克、琼脂20克水1000毫升；pH自然，温度28～30℃
种子培养基：麸皮3g、尿素0.5g、蔗糖5g、可溶性淀粉2g、K2HPO40.1g、MgSO40.05g，蒸馏水100mL，自然pH值，121℃灭菌1小时。培养温度28～30℃。
3、厌氧发酵：
将菌种以1％～40％V/V的量(菌种与蔗糖溶液体积比)转入蔗糖溶液中，在厌氧发酵罐中进行厌氧发酵转化，蔗糖浓度10～60％，pH值4～7，反应温度25～60℃，厌氧发酵反应10～36小时，得到低聚果糖含量50％以上的反应液；
优选的蔗糖溶液浓度为40～60％，菌种加入量为10～20％。
4、分离提纯、加工
发酵完成后用0.1～1微米的微滤膜行过滤回收菌体，菌体回收利用于下一批次生产，料液进行灭菌处理，加入新型生物絮凝剂，絮凝温度60～90℃，时间10～30分钟，使菌体蛋白形成大的颗粒；
料液进行过滤脱色处理，脱色温度60～90℃，脱色10～30分钟，过滤速度明显加快，糖液清亮，透光率达到90％以上；
对脱色过滤后的料液采用固定床离交净化、浓缩、干燥、包装等手段制取相应的液体或固体产品。
发明效果
本发明表明菌种在厌氧发酵罐中厌氧转化蔗糖生成低聚果糖，包括蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖、蔗果六糖等，发酵过程不需要空压设备提供无菌空气，减少设备投入，降低能源消耗。发酵结束后，反应液利用微滤膜回收菌体，料液经过灭菌、加入生物絮凝剂，使菌体形成大的颗粒，提升过滤速度。然后通过精制除去糖液中的杂质，制备的低聚果糖透光率达到90％以上，产品组分50～60％，产品质量明显提升。
如工业化生产低聚果糖50吨转化罐，原好氧发酵生产低聚果糖需要配备相应的空气压缩机、无菌空气管路系统，而且无菌空气过滤滤芯也要经常更换。50吨单罐配备无菌空气系统投资大约在40万元，每小时耗电量240kWh以上，100吨单罐配备无菌空气系统投资大约在70万元，每小时耗电量420kWh以上，能源消耗大。生产量越大，罐体越多，设备投资及相关基础投资更大。采用厌氧发酵转化技术可以去除好氧发酵所需的如上述大量的基础投资和无菌空气制备设备投资，节省占地空间，同时减少大量的能源消耗。微滤膜技术实现菌体的回收利用，进一步减少能源消耗，精制手段使产品质量明显提升。
【具体实施方式】
实施例1取4000克蔗糖加入15升厌氧发酵罐中，加水6000克，加热溶解后，调解料液pH值5，然后接入扩大培养的低聚果糖生产菌种，菌种接入量10％(V/V)，温度控制在50℃，反应时间15小时。发酵转化完毕，微滤膜过滤回收菌体，菌体回收利用于下一批次生产，然后料液升温至100℃灭菌10分钟，加入适量生物絮凝剂，絮凝温度60～90℃，絮凝完毕料液中加入0.05～0.1％活性炭脱色处理，处理30分钟，后经精制、浓缩、包装等处理，得到低聚果糖含量57.2％的成品液体，产品透光率94.6％。
实施例2取6000克蔗糖加入15升厌氧发酵罐中，加水5000克，加热溶解后，调解料液pH值5.5，然后加入扩大培养的低聚果糖生产菌种，菌种接入量20％，温度控制在30℃，反应时间20小时。发酵转化完毕，微滤膜过滤回收菌体，菌体回收利用于下一批次生产，然后料液升温至100℃灭菌10分钟，加入适量生物絮凝剂，絮凝温度60～90℃，絮凝完毕料液中加入0.05～0.1％活性炭脱色处理，处理30分钟，后经精制、浓缩、包装等处理，得到低聚果糖含量58％的成品液体，产品透光率93.2％。
实施例3取5000克蔗糖加入15升厌氧发酵罐中，加水5000克，加热溶解后，调解料液pH值6，然后加入扩大培养的低聚果糖生产菌种，菌种接入量15％，温度控制在50℃，反应时间25小时。发酵转化完毕，微滤膜过滤回收菌体，菌体回收利用于下一批次生产，然后料液升温至100℃灭菌10分钟，加入适量生物絮凝剂，絮凝温度60～90℃，絮凝完毕料液中加入0.05～0.1％活性炭脱色处理，处理30分钟，后经精制、浓缩、包装等处理，得到低聚果糖含量56.8％的成品液体，产品透光率92.6％。
实施例4取6000克蔗糖加入15升厌氧发酵罐中，加水5000克，加热溶解后，调解料液pH值7，然后加入扩大培养的低聚果糖生产菌种，菌种接入量20％，温度控制在30℃，反应时间30小时。发酵转化完毕，微滤膜过滤回收菌体，菌体回收利用于下一批次生产，然后料液升温至100℃灭菌10分钟，加入适量生物絮凝剂，絮凝温度60～90℃，絮凝完毕料液中加入0.05～0.1％活性炭脱色处理，处理30分钟，后经精制、浓缩、包装等处理，得到低聚果糖含量56.5％的成品液体，产品透光率93.2％。