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靶向结核分枝杆菌Ag85B的寡核苷酸适配子及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及靶向结核分枝杆菌Ag85B寡核苷酸适配子及其制备方法和应用，属于结核病医学免疫学和检测技术领域。
背景技术
我国的结核病疫情和耐药情况都相当严重，结核病人数位居世界第二，仅次于印度。现有肺结核病人451万，其中传染性肺结核病人196万，每年新增结核病例140万，每年死亡人数约13万，在传染病中居第一位。目前临床上常规应用的诊断方法中，临床标本涂片检测的灵敏度低，阳性率只有20-30％；传统的罗氏培养阳性率低，只有30％左右，而且需4-8周时间。结核病血清学诊断主要是结核抗体和抗原的检测，抗结核抗体检测只是一种辅助诊断手段；尽管应用免疫学技术检测结核病抗原已有20多年的历史，在检测技术和研究思路都有较大的进展，但体液标本中结核抗原的检测灵敏度仍较低，主要存在以下问题：①缺乏高效价的特异性抗体，目前国外虽在近几年已有应用特异性结核抗原免疫动物，并纯化出高效抗体的研究报道，但基本上均属小样本量研究，缺少大标本量的临床评估；②对于结核分枝杆菌抗原特性及与疾病的进展的关系缺乏全面、深入的了解，使结核抗原检测中靶特异性抗原选择存在一定的局限性；③血清中结核分枝杆菌抗原量较低，一方面是由结核分枝杆菌进入结核病患者体内的特异性结核循环抗原量较低，另一方面是结核抗原与相应的抗体在体内结合形成循环免疫复合物(CIC)，使血清中抗原检测的敏感性受到限制。目前全国451万活动性肺结核病人中，菌阳肺结核病人检出率低，菌阴肺结核病人占55.6％，漏诊率高，延误诊断。此外，肺外结核、小儿结核诊断也十分困难。因此，从不同的体液标本中检测结核病特异的抗原，建立快速、敏感、高效的结核病诊断、鉴别诊断方法对于结核病疫情的控制具有极其重要的意义。
SELEX(systematic evolution of ligands by exponential enrichment)技术即指数级富集配体的系统进化技术，是1990年Tuerk和Gold建立的一种新型组合化学技术，是研究小分子核酸与靶物质相结合的部位、序列及空间构象与功能的有效方法。其基本原理是体外化学合成一个单链寡核苷酸文库(RNA或ssDNA文库)，其两端为固定序列，中间含20～40个寡核苷酸的随机序列，利用大容量的随机寡核苷酸库与靶分子相互作用，从中分离到与靶分子特异结合的寡核苷酸，并结合体外扩增技术，使其得到指数级富集，如此经过多轮筛选，最终得到与靶物质亲和力高、特异性强的寡核苷酸，称之为“适配子(aptamer)”。适配子分子中除G-C、A-U碱基配对外，还有G-U等变偶碱基对的存在，可以形成发夹(hairpin)、假结(pseudoknot)、凸环(bulge)、G-四分体(G-quartet)等多种空间结构，可形成具有相当稳定的刚性结构，它们通过氢键、范德华力等与靶分子相互作用，或嵌合或包被，形成稳定的复合物。SELEX技术具有库容量大、靶分子广泛、亲和力高、特异性强等优点，理论上来说几乎任何一个靶分子都可以利用SELEX技术筛选出与之相匹配的寡核苷酸适配子，如金属离子、有机染料、氨基酸、细胞因子、辅因子、氨基糖苷、抗生素、碱基类似物、核苷酸和多肽等，其中蛋白类靶分子最多，完整的病毒颗粒和细菌病原体，甚至完整的细胞也可以通过SELEX技术筛选出高亲和力的寡核苷酸适配子。寡核苷酸适配子与靶分子具有极高的亲和力和特异性，结合的解离常数(Kd)可以达nM，甚至pM水平，与抗体相比，具有分子量小、能更快地渗入细胞、更迅速在血液中清除、能够稳定合成、便于修饰等特点，可应用于临床诊断、疾病治疗和基础研究等方面。
结核分枝杆菌侵入人体后的致病机制及其引起的病理学改变均以蛋白质表达及蛋白质间的相互作用为基础，宿主主要通过免疫反应及炎症反应完成其对病原体的防御。因此，结核菌感染或结核病可通过以下途径产生相关蛋白质并出现在血液循环中：(1)结核分枝杆菌在病灶环境中产生分泌蛋白；(2)在机体免疫力作用下结核菌菌体崩解产生菌体蛋白；(3)细菌刺激机体产生相关的反应性蛋白(包括抗体)；(4)在细菌作用下机体细胞崩解释放组织蛋白、组织漏出蛋白。结核抗原的检测可以作为结核分枝杆菌存在的直接证据，可以避免结核病患者由于免疫应答水平低下导致的体液免疫检测或细胞免疫检测的“假阴性”。因此，在结核病患者血清中可发现结核病相关蛋白作为诊疗标志物。目前在结核适配子研究方面，可见利用SELEX技术发现cAMP受体蛋白(CRP_Mt)与基因组DNA结合位点及其在基因表达调控中的作用的报道；也已应用SELEX技术筛选出能抑制结核分枝杆菌感染的结核分枝杆菌H37Rv DNA适配子(专利申请号200610019671.8)，及其分泌性抗原CFP10、ESAT-6和MPT64的适配子。而应用寡核苷酸适配子检测抗原是一种新型的检测技术，单独或与抗体组合应用于多种诊断模式已显示出其独特的优越性，特别是可以弥补抗体在诊断领域中应用的不足，寡核苷酸适配子可能更适合用于单克隆抗体难以区分的结构类似物或交叉抗原的鉴别诊断。但是迄今为止尚未见国内外关于结核分枝杆菌分泌性抗原Ag85B适配子及应用寡核苷酸适配子检测结核抗原的报道。
Ag85B蛋白是结核分枝杆菌分泌蛋白质，具有良好的抗原性，无论是Ag85B抗原还是其抗体，它们在结核患者血循环中的水平都要明显高于健康对照组(包括卡介苗接种者)，活动性结核患者血清中的Ag85B蛋白水平比其它分枝杆菌疾病患者和健康对照组高50～150倍。检测Ag85B抗原水平可以区别活动期的结核病与卡介苗的免疫接种或是既往感染，也可将结核病与非结核分枝杆菌病区别开来。因此，通过筛选并获得靶向结核分枝杆菌Ag85B蛋白的寡核苷酸适配子，应用于检测人血清中结核分枝杆菌Ag85B抗原水平，可提高结核抗原检测的灵敏度和特异性，从而提高结核病诊断的准确率。
发明内容
本发明的目的之一是为了克服已有技术的不足，提供靶向结核分枝杆菌Ag85B的寡核苷酸适配子。
本发明的上述目的是通过以下技术方案达到的：
一种靶向结核分枝杆菌Ag85B的寡核苷酸适配子，其特征在于：所述寡核苷酸适配子的核苷酸序列如下表所示(见序列表中的序列1-13)。

  寡核苷  酸适配  子名称  适配子的核苷酸序列  AP-1  GCAATGGTACGGTACTTCCAACCTCAGGTGATCTGCCTGCCTCGGCCT  CAAAAGTGCACGCTACTTTGCTAA  AP-2  GCAATGGTACGGTACTTCCAACCTCAGGTGATCTGCCTGCCTCGGCCG  CAAAAGTGCACGCTACTTTGCTAA  AP-3  GCAATGGTACGGTACTTCCAACCTCAGGTGATCTGCCTGCCTCGGCCC  CAAAAGTGCACGCTACTTTGCTAA  AP-4  GCAATGGTACGGTACTTCCTTTTTTTTTGTGTTGTCGTGATATTGTAACCTGT  CAAAAGTGCACGCTACTTTGCTAA  AP-5  GCAATGGTACGGTACTTCCTTAACTTTTTTTGATGTTTATGTCGGTTTGCTATG  CAAAAGTGCACGCTACTTTGCTAA
  AP-6  GCAATGGTACGGTACTTCCTTTTCTGTCTAGTTGTATTTACTCTTGGTATTATG  CAAAAGTGCACGCTACTTTGCTAA  AP-7  GCAATGGTACGGTACTTCCTTTTGGAAATTCTTTTTGTACTAGAATAATACCAC  CAAAAGTGCACGCTACTTTGCTAA  AP-8  GCAATGGTACGGTACTTCCTTTTTATATCAGTCTTAATATTGTGTTCTGTTGAC  CAAAAGTGCACGCTACTTTGCTAA  AP-9  GCAATGGTACGGTACTTCCTTTTTCCTGTAATATTCGTCTTTTGATGTTGTCTA  CAAAAGTGCACGCTACTTTGCTAA  AP-10  GCAATGGTACGGTACTTCCTATCTTCATCGGCAGGATGCCTATGCGCAGGTTTG  CAAAAGTGCACGCTACTTTGCTAA  AP-11  GCAATGGTACGGTACTTCCATTGGCGTTTGTTAGGACTGATGTTCGAGAAACCG  CAAAAGTGCACGCTACTTTGCTAA  AP-12  GCAATGGTACGGTACTTCCGGTTATTCTGTATTGTTGAATTGTTCTAGTGGTTT  CAAAAGTGCACGCTACTTTGCTAA  AP-13  GCAATGGTACGGTACTTCCGTTATTCAATTAAGTCGGGTTTATTGTGTGCGTTG  CAAAAGTGCACGCTACTTTGCTAA
本发明的另一目的是提供一种上述靶向结核分枝杆菌Ag85B的寡核苷酸适配子的制备方法。
本发明的上述目的是通过以下技术方案达到的：
一种靶向结核分枝杆菌Ag85B的寡核苷酸适配子的制备方法，其步骤如下：
(1)随机单链DNA(ssDNA)文库的构建和引物；
(2)PCR扩增制备随机ssDNA文库；
(3)SELEX筛选；
(4)亲和力测定：
(5)DNA克隆和测序；
(6)适配子的合成和鉴定。
本发明的再一目的是提供上述靶向结核分枝杆菌Ag85B的寡核苷酸适配子在制备结核分枝杆菌检测试剂方面的应用。
一种优选技术方案，其特征在于：所述应用包括下列步骤：
(1)以1ng/ml兔抗结核分枝杆菌Ag85B多克隆抗体IgG为捕获抗体包被微孔板，置4℃过夜；次日用PBST洗板3次，每次3分钟；
(2)BSA封闭：每孔加PBST-1％BSA 200μl，至37℃孵育1小时，用PBST洗板3次，每次3分钟；
(3)加入未稀释的待测体液标本，37℃孵育40min-1h；用SELEX洗涤液洗涤3-5次；
(4)加入1.25μg 5’端生物素化的报告适配子，37℃孵育40min-1h；用SELEX洗涤液洗涤3-5次；
(5)加入200μl 1∶1000稀释的链霉亲和素标记辣根过氧化物酶37℃孵育30min；用SELEX洗涤液洗涤3-5次；
(6)加入邻苯二胺(O-Phenylenediamine，OPD)，显色15min；
(7)用2mol/L浓硫酸终止反应，通过酶标仪测定波长492nm的吸光度。
有益效果
本发明通过筛选并获得靶向结核分枝杆菌Ag85B蛋白的寡核苷酸适配子AP-1、AP-2、AP-3、AP-4、AP-5、AP-6、AP-7、AP-8、AP-9、AP-10、AP-11、AP-12、AP-13，应用于检测人血清中结核分枝杆菌Ag85B抗原水平，可代替抗体，提高体液标本(包括血清、胸水、脑脊液、腹水等)中结核抗原检测的灵敏度和特异性，从而提高结核病诊断的准确率。
本发明建立的一种制备靶向结核分枝杆菌特异性抗原的高亲和性DNA适配子的方法，可制备多种靶分子的适配子，用于结核病的诊断和治疗。
建立的AP-1适配子ELONA方法可半定量地检测结核病人体液标本(包括血清、胸水、脑脊液、腹水等)中的抗原水平，只需半天时间，可用于结核病的快速诊断。
本发明人研究证明应用AP-1适配子ELONA方法检测结核病人血清的灵敏度为30.1％，其中菌阴患者的灵敏度为12％，而菌阳患者检测的灵敏度为57.6％，特异性为98.1％，阳性预测值89.3％，阴性预测值72.9％，总准确率为74.8％。在PPD皮试阳性的结核感染者和卡介苗接种者中未出现假阳性。应用AP-1适配子ELONA方法也可从结核性胸水、脑脊液、腹水中检测出结核分枝杆菌抗原，其阳性率分别为18.2％、3.6％、33.3％。
本发明的关键试剂-----靶向结核分枝杆菌Ag85B的寡核苷酸适配子可大规模地合成或PCR扩增制备，且成本相对较低。
下面通过具体实施方式对本发明做进一步说明，但并不意味着对本发明保护范围的限制。
具体实施方式
实施例1
一种靶向结核分枝杆菌Ag85B的寡核苷酸适配子的制备方法，其步骤如下：
(1)随机单链DNA(ssDNA)文库的构建和引物：随机单链DNA(ssDNA)文库的构建和引物：随机单链DNA(ssDNA)文库：5′-GCAATGGTACGGTACTTCC(N35)CAAAAGTGCACGCTACTTTGCTAA-3′；上游引物：5′-GCAATGGTACGGTACTTCC-3′；下游引物：5′-GCTAAGCGGGTGGGACTTCCTAGTCCCACCCGCTTAGCAAAGTAGCGTGCACTT TTG-3′；生物素标记的上游引物：5′-biotin-GCAATGGTACGGTACTTCC-3′；所述随机单链DNA(ssDNA)文库和引物通过引物公司合成；
(2)随机单链DNA(ssDNA)文库的PCR扩增制备：
将ssDNA文库扩增成dsDNA文库，保存，并以dsDNA文库为模板扩增出下一轮筛选的ssDNA文库：
第一轮扩增条件：随机单链DNA文库0.25μg、生物素标记的上游引物37.5pmol、下游引物37.5pmol、0.2mmol/L dNTP、10μl 10倍DNA聚合酶反应缓冲液和DNA聚合酶2个活性单位，加入双蒸水使总体积为100μl；然后放入PCR扩增仪中，反应程序设定为：95℃，1min，94℃，30sec，37℃，1min，58℃，40sec，27个循环，最后58℃延伸2min，得PCR扩增产物；
第二、三轮扩增条件：取10μl上一轮筛选产物作为模板，上游引物37.5pmol、下游引物37.5pmol、0.2mmol/L dNTP、10倍DNA聚合酶反应缓冲液和DNA聚合酶2个活性单位，加入双蒸水使总体积为100μl；然后放入PCR扩增仪中，反应程序为：95℃，1min；94℃，30sec；37℃，1min；58℃，40sec；扩增3个循环；取3个循环的扩增产物为模板，生物素标记的上游引物37.5pmol、下游引物37.5pmol、0.2mmol/L dNTP、10倍DNA聚合酶反应缓冲液和DNA聚合酶2个活性单位，加入双蒸水使总体积为100μl；然后放入PCR扩增仪中，反应程序为：95℃ 1min，94℃ 30sec，37℃ 1min，58℃ 40sec，第二轮扩增进行24个循环，第三轮扩增进行27个循环，最后58℃延伸2min；
第四轮扩增条件：取10μl上一轮筛选产物作为模板，上游引物37.5pmol、下游引物37.5pmol、0.2mmol/L dNTP、10倍DNA聚合酶反应缓冲液和DNA聚合酶2个活性单位，加入双蒸水使总体积为100μl；然后放入PCR扩增仪中，反应程序为：95℃ 1min，94℃ 30sec，37℃ 30sec，60℃ 40sec，扩增3个循环；取3个循环的扩增产物为模板，生物素标记的上游引物37.5pmol、下游引物37.5pmol、0.2mmol/L dNTP、10倍DNA聚合酶反应缓冲液和DNA聚合酶2个活性单位，加入双蒸水使总体积为100μl；然后放入PCR扩增仪中，反应程序为：95℃ 1min，94℃ 30sec，37℃ 30sec，60℃ 40sec，30个循环，最后60℃延伸2min；
第五至八轮扩增条件：取10μl上一轮筛选产物作为模板，上游引物37.5pmol、下游引物37.5pmol、0.2mmol/L dNTP、10倍DNA聚合酶反应缓冲液和DNA聚合酶2个活性单位，加入双蒸水使总体积为100μl；然后放入PCR扩增仪中，反应程序为：95℃ 1min，94℃ 30sec，55℃ 30sec，60℃ 40sec，扩增3个循环；取3个循环的扩增产物为模板，生物素标记的上游引物37.5pmol、下游引物37.5pmol、0.2mmol/L dNTP、10倍DNA聚合酶反应缓冲液和DNA聚合酶2个活性单位，加入双蒸水使总体积为100μl；然后放入PCR扩增仪中，反应程序为：95℃ 1min，94℃ 30sec，55℃ 30sec，60℃ 40sec，第五轮扩增24个循环，第六轮扩增30个循环，第七轮扩增27个循环，第八轮扩增24个循环，最后60℃延伸2min；
(3)SELEX筛选：
A.PCR扩增产物纯化回收：将步骤(2)中每一轮的PCR扩增产物用7M尿素8％变性PAGE进行电泳，置0.5μg/ml溴化乙锭溶液中染色后，将其放在铺好保鲜膜的长波紫外灯上，打开紫外灯，在防护罩防护下，用锐利刀片切取呈橘红色条带的PCR扩增产物切下，将胶条切碎，移入1.5ml离心管中；加入3倍体积的凝胶洗脱缓冲液(0.5M NH4Ac，0.2％SDS，1mM EDTA，pH 8.0)，于37℃震荡洗脱7小时以上；将洗脱液吸到新的1.5ml离心管中，不要将凝胶吸出；重复洗脱一次；在洗脱液中加入2.5倍体积的无水乙醇，1/10体积的3M NaAc，pH5.2，-70℃放置3hr；在4℃下放置，在14,000rpm下离心30min；弃上清液，沉淀，用4℃预冷的70％乙醇洗一次，在4℃下放置，在14,000rpm下离心30min；弃上清液，沉淀于室温干燥；将干燥好的DNA溶于适量SHMCK缓冲液(SELEX结合缓冲液：20mmol/L HepespH 7.35，120mmol/L NaCl，5mmol/L KCl，1mmol/L CaCl2，1mmol/L MgCl2，1％BSA)中；将每一轮获得的ssDNA贮存于4℃保存；
B.微孔板为介质的SELEX筛选过程：用包被缓冲液(0.05mol/L NaHCO3，pH9.6)稀释Ag85B蛋白，然后包被于96孔酶联板孔中，在4℃下放置，过夜，同时设空白对照孔(只加包被液)；弃去包被液，用PBS-T洗涤液洗板3次，1min/次；Ag85B蛋白包被孔和空白对照孔均以3％BSA-PBS溶液100μl封闭，37℃孵育2h；弃去封闭液，加入每一轮获得的ssDNA和SELEX结合缓冲液(SHMCK缓冲液)共200μl到Ag85B蛋白包被孔，与Ag85B蛋白于37℃结合40min；弃结合缓冲液，用SELEX洗涤液(SELEX结合缓冲液加0.05％吐温20)洗6次，每次洗1min；弃洗涤液，加SELEX洗脱液于80℃作用10min(第三轮及以后的筛选作用15min)，洗脱下与Ag85B蛋白结合的ssDNA；将洗脱下的ssDNA收集到1.5ml离心管中；重复洗脱1次；经等体积的酚∶氯仿抽提、无水乙醇和70％乙醇沉淀后，将ssDNA溶解于20μl TE缓冲液中，作为下一轮筛选的ssDNA模板；如此反复，再进行第9-14轮；
(4)亲和力测定：应用酶联寡聚核苷酸试验(Enzyme-linked oligonucleotideassay，ELONA)法测定适配子的亲和力：
A.用包被缓冲液将Ag85B蛋白稀释至112pmol/孔，加入酶标板，封口后置4℃包被过夜；次日用PBST洗板3次，每次3分钟；
B.BSA封闭：每孔加PBST-1％BSA 200μl，至37℃孵育1小时，用PBST洗板3次，每次3分钟；
C.将第一轮至第八轮筛选的PCR扩增产物，用酚、氯仿抽提，用乙醇沉淀纯化，测定DNA含量；
D.按每孔250pmol ssDNA与112pmol Ag85蛋白包被孔在200μl SELEX结合缓冲液中37℃孵育40min，用SELEX洗涤液洗涤6次；
E.加入200μl 1∶1000稀释的链霉亲和素标记辣根过氧化物酶37℃孵育30min；
F.PBST洗涤6次，然后加入邻苯二胺(O-Phenylenediamine，OPD)；
G.37℃显色15min；用2mol/L浓硫酸终止反应，用酶标仪测定波长492nm的吸光度；
H.第一轮至第八轮筛选的适配子的吸光度OD值依次如下：0、0、0.347、0.440、2.964、3.175、3.178、3.23，表明第八轮适配子库与结核分枝杆菌Ag85B的亲合力最大；
(5)适配子的克隆和测序：
经第八轮筛选得到的ssDNA，用上游引物和下游引物PCR扩增成dsDNA，PAGE胶纯化回收产物，进行DNA克隆和测序；克隆转化子经PCR鉴定为阳性的克隆，挑取100个克隆培养、保存，从中随机挑取57个克隆的单个生长菌落进行DNA测序；获得的随机区序列如下：
  克隆序号No.  PCR产物克隆的随机区序列5’→3’  1  AACCTCAGGTGATCTGCCTGCCTCGGCCT  2  AACCTCAGGTGATCTGCCTGCCTCGGCCT  3  AACCTCAGGTGATCTGCCTGCCTCGGCCT  4  AACCTCAGGTGATCTGCCTGCCTCGGCCT  5  AACCTCAGGTGATCTGCCTGCCTCGGCCT  6  AACCTCAGGTGATCTGCCTGCCTCGGCCT  7  AACCTCAGGTGATCTGCCTGCCTCGGCCT  8  AACCTCAGGTGATCTGCCTGCCTCGGCCT  9  AACCTCAGGTGATCTGCCTGCCTCGGCCT  10  AACCTCAGGTGATCTGCCTGCCTCGGCCT  11  AACCTCAGGTGATCTGCCTGCCTCGGCCT  12  AACCTCAGGTGATCTGCCTGCCTCGGCCT  13  AACCTCAGGTGATCTGCCTGCCTCGGCCT  14  AACCTCAGGTGATCTGCCTGCCTCGGCCT  15  AACCTCAGGTGATCTGCCTGCCTCGGCCT  16  AACCTCAGGTGATCTGCCTGCCTCGGCCT  17  AACCTCAGGTGATCTGCCTGCCTCGGCCT  18  AACCTCAGGTGATCTGCCTGCCTCGGCCT  19  AACCTCAGGTGATCTGCCTGCCTCGGCCT  20  AACCTCAGGTGATCTGCCTGCCTCGGCCT  21  AACCTCAGGTGATCTGCCTGCCTCGGCCT  22  AACCTCAGGTGATCTGCCTGCCTCGGCCT  23  AACCTCAGGTGATCTGCCTGCCTCGGCCT  24  AACCTCAGGTGATCTGCCTGCCTCGGCCT  25  AACCTCAGGTGATCTGCCTGCCTCGGCCT
  26  AACCTCAGGTGATCTGCCTGCCTCGGCCT  27  AACCTCAGGTGATCTGCCTGCCTCGGCCT  28  AACCTCAGGTGATCTGCCTGCCTCGGCCT  29  AACCTCAGGTGATCTGCCTGCCTCGGCCT  30  AACCTCAGGTGATCTGCCTGCCTCGGCCT  31  AACCTCAGGTGATCTGCCTGCCTCGGCCT  32  AACCTCAGGTGATCTGCCTGCCTCGGCCT  33  AACCTCAGGTGATCTGCCTGCCTCGGCCT  34  AACCTCAGGTGATCTGCCTGCCTCGGCCT  35  AACCTCAGGTGATCTGCCTGCCTCGGCCT  36  AACCTCAGGTGATCTGCCTGCCTCGGCCT  37  AACCTCAGGTGATCTGCCTGCCTCGGCCG  38  AACCTCAGGTGATCTGCCTGCCTCGGCCG  39  AACCTCAGGTGATCTGCCTGCCTCGGCCG  40  AACCTCAGGTGATCTGCCTGCCTCGGCCG  41  AACCTCAGGTGATCTGCCTGCCTCGGCCG  42  AACCTCAGGTGATCTGCCTGCCTCGGCCG  43  AACCTCAGGTGATCTGCCTGCCTCGGCCG  44  AACCTCAGGTGATCTGCCTGCCTCGGCCG  45  AACCTCAGGTGATCTGCCTGCCTCGGCCG  46  AACCTCAGGTGATCTGCCTGCCTCGGCCG  47  AACCTCAGGTGATCTGCCTGCCTCGGCCC  48  TTTTTTTTTGTGTTGTCGTGATATTGTAACCTGT  49  TTAACTTTTTTTGATGTTTATGTCGGTTTGCTATG  50  TTTTCTGTCTAGTTGTATTTACTCTTGGTATTATG  51  TTTTGGAAATTCTTTTTGTACTAGAATAATACCAC  52  TTTTTATATCAGTCTTAATATTGTGTTCTGTTGAC  53  TTTTTCCTGTAATATTCGTCTTTTGATGTTGTCTA  54  TATCTTCATCGGCAGGATGCCTATGCGCAGGTTTG  55  ATTGGCGTTTGTTAGGACTGATGTTCGAGAAACCG
  56  GGTTATTCTGTATTGTTGAATTGTTCTAGTGGTTT  57  GTTATTCAATTAAGTCGGGTTTATTGTGTGCGTTG
(6)适配子的合成、鉴定：
A.Ag85B适配子的合成：综合考虑各条序列的同源性信息和二级结构，选取了No.1、No.37、No.47、No.48、No.49、No.50、No.51、No.52、No.53、No.54、No.55、No.56、No.57适配子克隆的DNA序列分别命名为：AP-1、AP-2、AP-3、AP-4、AP-5、AP-6、AP-7、AP-8、AP-9、AP-10、AP-11、AP-12、AP-13，按常规方法合成这13个适配子；
B.适配子亲和力测定：应用生物素标记的引物扩增合成文库Gp35、第八轮筛选的PCR产物及上述合成的AP-1至AP-11适配子，通过ELONA方法检测适配子与Ag85B蛋白亲和力，结果显示AP-1适配子的亲和力最高。
11个适配子的亲和力测定
  寡核苷  酸适配  子名称  Aptamer  适配子的核苷酸序列  DNA sequence of the aptamers(5′-3′)  亲和力  (吸光  度  OD₄₉₂)  AP-1  GCAATGGTACGGTACTTCCAACCTCAGGTGATCTGCCTGCCTCGGCCT  CAAAAGTGCACGCTACTTTGCTAA  1.347  AP-2  GCAATGGTACGGTACTTCCAACCTCAGGTGATCTGCCTGCCTCGGCCG  CAAAAGTGCACGCTACTTTGCTAA  1.259  AP-3  GCAATGGTACGGTACTTCCAACCTCAGGTGATCTGCCTGCCTCGGCCC  CAAAAGTGCACGCTACTTTGCTAA  1.208  AP-4  GCAATGGTACGGTACTTCCTTTTTTTTTGTGTTGTCGTGATATTGTAACCTGT  CAAAAGTGCACGCTACTTTGCTAA  1.046  AP-5  GCAATGGTACGGTACTTCCTTAACTTTTTTTGATGTTTATGTCGGTTTGCTATG  CAAAAGTGCACGCTACTTTGCTAA  1.143  AP-6  GCAATGGTACGGTACTTCCTTTTCTGTCTAGTTGTATTTACTCTTGGTATTATG  CAAAAGTGCACGCTACTTTGCTAA  1.056  AP-7  GCAATGGTACGGTACTTCCTTTTGGAAATTCTTTTTGTACTAGAATAATACCAC  CAAAAGTGCACGCTACTTTGCTAA  1.078
  AP-8  GCAATGGTACGGTACTTCCTTTTTATATCAGTCTTAATATTGTGTTCTGTTGAC  CAAAAGTGCACGCTACTTTGCTAA  1.141  AP-9  GCAATGGTACGGTACTTCCTTTTTCCTGTAATATTCGTCTTTTGATGTTGTCTA  CAAAAGTGCACGCTACTTTGCTAA  1.205  AP-10  GCAATGGTACGGTACTTCCTATCTTCATCGGCAGGATGCCTATGCGCAGGTTTG  CAAAAGTGCACGCTACTTTGCTAA  1.079  AP-11  GCAATGGTACGGTACTTCCATTGGCGTTTGTTAGGACTGATGTTCGAGAAACCG  CAAAAGTGCACGCTACTTTGCTAA  1.102  合成文  库Gp35  GCAATGGTACGGTACTTCC-CAAAAGTGCACGCTACTTTGCTAA  0.021  第8轮  筛选产  物  1.354
C.Ap-1适配子的解离常数Kd值：应用ELONA方法检测不同浓度AP-1与Ag85B蛋白结合的吸光度OD492，然后利用Origin Pro 7.5软件计算AP-1与Ag85B蛋白的解离常数Kd值为119.57±52.95nM。
不同浓度AP-1与Ag85B蛋白结合的吸光度
  Ap-1适配子浓度(nM)  吸光度OD₄₉₂  0  0  0.5  0.02  5  0.034  10  0.428  100  0.793  360  1.516  720  1.695
所述各轮的筛选条件如下：


一种靶向结核分枝杆菌Ag85B的寡核苷酸适配子在制备结核分枝杆菌检测试剂方面的应用，其步骤如下：
A.通过基因工程技术克隆、表达、纯化结核分枝杆菌Ag85B：Ag85B重组质粒在大肠杆菌中经IPTG诱导4小时后，通过SDS-PAGE分析可见特异的表达产物带(图1所示，是结核分枝杆菌Ag85B蛋白SDS-PAGE的纯化分析。)，分子量约为31.0kDa左右，光密度扫描分析表明占菌体总蛋白30％左右；在变性条件下纯化Ag85B蛋白，纯化后的样品经SDS-PAGE分析显示只见一条回收的蛋白带，未见其它杂带，经光密度扫描分析表明其纯度为95％以上；如图1所示，为结核分枝杆菌Ag85B蛋白SDS-PAGE的纯化分析图。其中，M：蛋白分子量标准；1，3：Ag85B基因工程菌IPTG诱导后样品；2：纯化的重组Ag85B蛋白；4：Ag85B基因工程菌IPTG诱导前样品。
B.通过常规的动物免疫方法制备兔抗结核分枝杆菌Ag85B多克隆抗体，通过酶联免疫试验(ELISA)鉴定抗体的滴度，如图2所示，是通过ELISA检测兔抗结核分枝杆菌Ag85B多克隆抗体的滴度，其中，A1、A2(空白对照)OD492分别为0、0.007；A3、A4(正常兔血清，阴性对照)OD492分别为0.018、0.021；B1、B2(1号免疫兔血清)OD492分别为1.473、1.652；B3、B4(2号免疫兔血清)OD492分别为1.785、1.778；B5、B6(3号免疫兔血清)OD492分别为1.219、1.186；B7、B8(4号免疫兔血清)OD492分别为1.433、1.433。结果显示4只免疫兔血清均含有较高水平的抗结核分枝杆菌Ag85B多克隆抗体。
C.建立应用AP-1适配子ELONA法检测体液标本中结核分枝杆菌Ag85B的方法：选择出现频率最多克隆的单个生长菌落所对应的DNA适配子AP-1建立AP-1适配子ELONA检测方法；
a.以1ng/ml兔抗结核分枝杆菌Ag85B多克隆抗体IgG为捕获抗体包被微孔板，置4℃过夜；次日用PBST洗板3次，每次3分钟；
b.BSA封闭：每孔加PBST-1％BSA 200μl，至37℃孵育1小时，用PBST洗板3次，每次3分钟；
c.加入未稀释的待测体液标本，37℃孵育40min-1h；用SELEX洗涤液洗涤3-5次；
d.加入1.25μg 5’端生物素化的报告适配子，37℃孵育40min-1h；用SELEX洗涤液洗涤3-5次；
e.加入200μl 1∶1000稀释的链霉亲和素标记辣根过氧化物酶37℃孵育30min；用SELEX洗涤液洗涤3-5次；
f.加入邻苯二胺(O-Phenylenediamine，OPD)，显色15min；
g.用2mol/L浓硫酸终止反应，通过酶标仪测定波长492nm的吸光度；
D.应用AP-1适配子ELONA法检测结核分枝杆菌Ag85B的敏感性和特异性：
a.应用AP-1适配子ELONA法检测100、80、50、40、20、10、1ng/ml的结核分枝杆菌Ag85B蛋白，其OD492nm分别为0.89、0.678、0.494、0、0、0、0，表明应用AP-1适配子ELONA法检测结核分枝杆菌Ag85B的敏感性为50ng/ml；
b.应用AP-1适配子ELONA法检测50ng/ml的结核分枝杆菌MPT64蛋白，其OD492nm为0，表明应用AP-1适配子ELONA法检测结核分枝杆菌Ag85B具有较高的特异性；
E.应用AP-1适配子ELONA法检测体液标本中结核分枝杆菌Ag85B：
a.应用AP-1适配子ELONA法检测100例健康人(包括41例PPD皮试阴性和59例PPD皮试阳性者)、59例非结核呼吸疾病患者和83例结核病患者血清中结核分枝杆菌Ag85B，其OD492nm分别为0.034±0.14、0.056±0.17、0.250±0.41。以健康对照组和非结核呼吸疾病对照组的光密度平均值+2倍标准差(Mean±2SD)为正常界限值，应用AP-1适配子ELONA法检测结核病患者血清中结核分枝杆菌Ag85B的灵敏度为30.1％，其中菌阴患者的灵敏度为12％，而菌阳患者检测的灵敏度为57.6％，特异性为98.1％，阳性预测值89.3％，阴性预测值72.9％，总准确率为74.8％。
应用AP-1适配子ELONA法检测242例人血清中结核分枝杆菌Ag85B的结果


如图3所示，是应用AP-1适配子ELONA法检测人血清中结核分枝杆菌Ag85B的结果。其中：A1：空白对照；B1-H1：100、80、60、50、20、10、1ng/ml的结核分枝杆菌Ag85B蛋白；A2-H2：No.1-8肺结核病患者血清；A3-H3：No.1-8非结核呼吸疾病患者血清；A4-H4：No.1-8PPD皮肤试验阴性的健康人血清；A5-H5：No.1-8PPD皮肤试验阳性的健康人血清。
b.应用AP-1适配子ELONA法检测2例非结核性胸膜炎患者和22例结核性胸膜炎患者胸水中结核分枝杆菌Ag85B，其OD492nm分别为0.04±0.03、0.120±0.18，22例结核性胸水中4例OD492nm明显增高，阳性率为18.2％，结果所图4所示，是应用AP-1适配子ELONA法检测人胸水中结核分枝杆菌Ag85B的结果，其中，A1、A2：空白对照；B1、B2：阳性对照；C1、C2：阴性对照；A3、A4、B3、B4、C3、C4：结核性胸水；A5、A6、B5、B6、C5、C6：非结核性胸水。结果表明该方法也可从胸水中检测出结核分枝杆菌抗原。
c.应用AP-1适配子ELONA法检测4例非结核性脑膜炎患者和28例结核性脑膜炎患者脑脊液中结核分枝杆菌Ag85B，结果如图5所示，应用AP-1适配子ELONA法检测人脑脊液中结核分枝杆菌Ag85B的结果。其中，A1、A2：空白对照；B1、B2：阳性对照；C1、C2：阴性对照；A3、A4、B3、B4、C3、C4、D3、D4：结核性脑脊液；A5、A6、B5、B6、C5、C6、D5、D6：非结核性脑脊液。
结果表明：仅1例结核性脑脊液OD492nm明显增高，阳性率为3.6％，结果表明该方法也可从脑脊液中检测出结核分枝杆菌抗原。
d.应用AP-1适配子ELONA法检测6例非结核性腹膜炎患者和28例结核性腹膜炎患者腹水中结核分枝杆菌Ag85B，图6为应用AP-1适配子ELONA法检测人腹水中结核分枝杆菌Ag85B的结果。A1、A2：空白对照；B1、B2：阳性对照；C1、C2：阴性对照；A3、A4、B3、B4、C3、C4：非结核性腹水；A5、A6、B5、B6、C5、C6：结核性腹水。
结果表明：2例结核性腹水OD492nm明显增高，阳性率为33.3％，结果表明该方法也可从腹水中检测出结核分枝杆菌抗原。
序列表
<110>中国人民解放军第三0九医院，北京市结核病胸部肿瘤研究所
<120>靶向结核分枝杆菌Ag85B的寡核苷酸适配子及其制备方法和应用
<130>
<160>13
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>72
<212>DNA
<213>AP-1
<400>1
gcaatggtac ggtacttcca acctcaggtg atctgcctgc ctcggcctca aaagtgcacg    60
ctactttgct aa                                                        72
<210>2
<211>72
<212>DNA
<213>AP-2
<400>2
gcaatggtac ggtacttcca acctcaggtg atctgcctgc ctcggccgca aaagtgcacg    60
ctactttgct aa                                                        72
<210>3
<211>72
<212>DNA
<213>AP-3
<400>3
gcaatggtac ggtacttcca acctcaggtg atctgcctgc ctcggcccca aaagtgcacg    60
ctactttgct aa                                                        72
<210>4
<211>77
<212>DNA
<213>AP-4
<400>4
gcaatggtac ggtacttcct ttttttttgt gttgtcgtga tattgtaacc tgtcaaaagt    60
gcacgctact ttgctaa                                                   77
<210>5
<211>78
<212>DNA
<213>AP-5
<400>5
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tgcacgctac tttgctaa                                                  78
<210>6
<211>78
<212>DNA
<213>AP-6
<400>6
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tgcacgctac tttgctaa                                                  78
<210>7
<211>78
<212>DNA
<213>AP-7
<400>7
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<210>8
<211>78
<212>DNA
<213>AP-8
<400>8
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<210>9
<211>78
<212>DNA
<213>AP-9
<400>9
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tgcacgctac tttgctaa                                                  78
<210>10
<211>78
<212>DNA
<213>AP-10
<400>10
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tgcacgctac tttgctaa                                                  78
<210>11
<211>78
<212>DNA
<213>AP-11
<400>11
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tgcacgctac tttgctaa                                                  78
<210>12
<211>78
<212>DNA
<213>AP-12
<400>12
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tgcacgctac tttgctaa                                                  78
<210>13
<211>78
<212>DNA
<213>AP-13
<400>13
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