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生物质预处理
技术领域
本发明涉及木质纤维生物质转化成糖。更具体地，首先用离子液体预处理木质纤维生物质。
发明背景
在木质纤维生物质中，晶体纤维素纤丝包埋在组织化不太充分的半纤维素基质中，其依次由外层木质素皮围绕。将天然产生的纤维素材料接触水解酶通常导致纤维素水解产量低于20％的理论预期结果。因此，总是在尝试酶水解生物质中的多糖(纤维素和半纤维素)之前进行生物质的一些“预处理”。预处理指的是将木质纤维生物质从其天然形式转化成纤维素水解有效形式的过程，其天然形式能抵抗纤维素酶体系。与未处理的生物质相比，有效预处理的木质纤维材料的特征在于增加的接触纤维素酶的表面积(孔隙度)，和木质素的溶解或再分配。增加的孔隙度主要由纤维素结晶性的破坏、半纤维素断裂/溶解和木质素再分布和/或溶解的组合而引起。在实现这些因素中的一些(或全部)中的相对有效性在现有的不同预处理方法中非常不同。这些包括稀酸，蒸汽爆发，热液作用，涉及水介质中有机溶剂的“有机溶胶”，氨纤维爆发(AFEX)，使用如氨、NaOH或石灰这些碱的强碱作用和高浓度磷酸处理。许多这些方法没有破坏纤维素结晶性，这是对实现快速纤维素消化性所不可缺少的一个特征。再者，这些方法中的一些不适用预处理中所用的化学物质的“易回收”。
在现有的预处理技术中，最近报道了一些主要技术的协同研发(C.E.Wyman等，Bioresource Technology，(2005)96，1959)。研究者协会(Biomass Refining Consortium for Applied Fundamental andInnovation(CAFI))已经研究了充分表征的一种原料(即玉米茎叶饲料)的预处理，通过几种那时很有前景的预处理技术，使用常规的分析方法，和数据解释的一贯方法(C.E.Wyman等，BioresourceTechnology，(2005)96，2026)。特别地，研究了以下的：(1)稀酸水解(T.A.Lloyd和C.E.Wyman，Bioresource Technology，(2005)96，1967)，(2)氨纤维爆发(AFEX)技术(F.Teymouri等，BioresourceTechnology，(2005)96，2014)，(3)pH受控液体热水处理(N.Mosier等，Bioresource Technology，(2005)96，1986)，(4)氨水循环方法(ARP)(T.H.Kim和Y.Y.Lee，Bioresource Technology，(2005)96，2007)和(5)石灰预处理(S.Kim和M.T.Holzapple，Bioresource Technology，96，(2005)1994)。所有上述方法有两个步骤：形成冲洗流的预处理步骤和产生水解产物流的预处理生物质的酶水解步骤(图2)。这两个流出流中的五和六碳糖及其寡聚物的合并总量用来估计这些方法各自的总糖产量。
在以上的方法中，进行预处理步骤的pH从稀酸水解至热水预处理至基于碱试剂的方法(AFEX、ARP和石灰预处理)逐渐升高。在预处理步骤的过程中，稀酸和热水处理方法主要溶解半纤维素，而使用碱试剂的方法除去大部分木质素。因此，来自之前方法中的预处理步骤的冲洗流主要含有半纤维素基的糖，而对于高pH的方法，该流主要含有木质素。在基于碱的预处理方法中，随后残余生物质的酶水解形成混合糖(C5和C6)，而来自低和中性pH方法的水解产物中，葡萄糖是主要的产物。由于木质素的除去可以影响纤维酶与纤维素的接近性，残余生物质的酶消化性对高pH方法更好些。所有这些方法在高于水正常沸点很多的温度下在水溶液中进行，以促进半纤维素和木质素的解聚/熔化中涉及的物理-化学现象，并需要高压环境(6至20大气压)。再者，这些方法中没有一种可以有效地破坏生物质中纤维素的结晶性。此外，这些方法中的一些释放大部分低聚木糖形式的木糖，许多微生物不容易发酵这种糖，并需要其他的步骤将它们破碎成单体物质。最后，这些主要预处理技术的比较经济分析(T.Eggeman和R.T.Elander，Bioresource Technology，(2005)96，2019)表明它们与玉米干碾相比全部是资本集约的，并且对于商业化需要重要的方法改进。
文献中还提出了其中使用溶剂如乙醇和甲醇的方法(在含水介质中)和使用碱如NaOH的方法。这些方法也能够溶解木质素，但是它们不能够破坏纤维素的结晶性。此外，成本太高，使得不认为这些方法对于大体积、低价值商品的制造是有竞争性的。基于浓磷酸方法可获得的信息(Zhang等，Y-HP等，Biotechnol.Bioeng.97：214-223)，显示出是涉及几个步骤的复杂方法，使得整个方法是昂贵的。然而，由于所用的苛刻条件，通过该预处理方法获得了无定形纤维素。
早先报道了使用离子液体溶解和处理纯纤维素(Swatloski，R.P.，Rogers，R.D.Holbrey，J.D.，US专利6,824,599，2002；Holbery，J.D.，Spear，S.K.，Turner，M.B.，Swatloski，R.P.，Rogers，R.D.，美国专利6,808,557，2003)。在最近的工作中，我们报道了通过离子液体预处理来降低纤维素对酶水解抗性的有效方法(Dadi，A.，Schall，C.A.，Varanasi，S.，“Applied Biochemistry andBiotechnology，vol.136-140，p407，2007；Varanasi，S.，Schall，C.，和Dadi，A.，美国专利申请：2007年2月)。尽管该方法使用离子液体来打开纯晶体纤维素材料如Avicel的结构，使其易于接近纤维素酶，但是其没有特异性地解决木质纤维生物质的预处理，这是本发明的主题。在该文章中，记录了已经研究了最近的通过使用离子液体从生物质分离纤维素(Fort，D.A.，Remsing，R.C.，Swatloski，R.P.，Moyna，P.，Moyna，G.，Rogers，R.D.，Green Chemistry 9：63-69，2007)和生物质在离子液体中的完全分解(Vesa，M.Aksela，R.，欧洲专利WO 2005017001，2005)。之前的申请集中于生物质的纤维素部分“完整回收”，用于材料发展，而之后的目的在于鉴定将导致生物质“完全分解”的ILs和条件。然而，目前没有可以用于快速并有效糖化木质纤维生物质的多糖部分的高产量预处理方法。本发明研发了区分生物质的三种主要成分(即，木质素、半纤维素和纤维素)对IL的“亲和性”，结合一些IL在破坏纤维素部分的结晶性中的独特能力，以设计出有效糖化生物质多糖部分的方案。本发明既不需要从生物质中提取纤维素，也不需要在IL中溶解生物质。
发明概述
木质纤维生物质是具有吸引力的原料，因为其是可以转化成液体运输燃料、化学物质和聚合物的大量的、本国的、可再生资源。木质纤维素的主要成分如下：(1)半纤维素(20-30％)，五和六碳糖的无定形聚合物；(2)木质素(5-30％)，酚化合物高度交联的聚合物；和(3)纤维素(30-40％)，纤维二糖(葡萄糖二聚物)的高度结晶聚合物。纤维素和半纤维素通过公知的发酵技术，水解成它们的糖时，可以转化成乙醇燃料。这些糖还形成用于生产各种化学物质和聚合物的原料。生物质的复杂结构需要适当的预处理，使得能够有效地将纤维素和半纤维素成分糖化成它们的成分糖。目前的预处理方法经受着纤维水解的反应速率慢(使用纤维素酶)和糖产量低(C.E.Wyman等，2005，Bioresource Technology：96，1959)。
已经通过使用离子液体(IL)预处理研发了糖的产量和生产速率改善的木质纤维素的碳水化合物转化成糖的方法。这种新的预处理方案实质性地提高了木质纤维生物质的糖化效率(就产量和反应速率而言)。这种IL-预处理方法对从生物质生产糖的整体经济具有主要影响(并且与一些最主要的方法完全相反)的其他独特特征是(i)用能够破坏天然纤维素结构的IL处理各种木质纤维生物质来源的能力，(ii)在培养过程中处理大的生物质与IL比例的能力，(iii)在非常低的酶装载下完成糖化的能力，(iv)用大的生物质颗粒能充分进行的能力，(v)用于预处理生物质的IL的全部回收(通过容易的方法)和多重再利用的潜能，(vi)生产不含抑制成分糖下游处理的化合物的水解产物的能力，(如以乙醇和乳酸生产作为例子)，和(vii)糖化后可以回收生物质中的大部分木质素。

附图简述
图1是本发明的预处理方法之前和之后的生物质的图示。在图中，将木质素、半纤维素和纤维素各自表示为黑色、绿色和蓝色区域。在未处理的生物质中，高度结晶纤维素纤丝包埋在组织化不太充分的半纤维素基质中，其依次由外层木质素覆层围绕-在图中为最左边的画面。理想的生物质预处理应当能够完成以下任务：(i)替换/除去木质素覆层，(ii)打开/除去半纤维素，和(iii)降低/消除纤维素部分的结晶性。该图在两个步骤中描述了这三个任务：步骤1包括任务(i)和(ii)，而步骤2表示认为(iii)。大部分现有的预处理方法只完成任务(i)和(ii)，(即，步骤1)，而没有步骤2。然而，步骤2在减少有效完成水解需要的时间和酶装载中非常重要。
图2.用于从木质纤维生物质生产燃料和化学物质的“糖-平台”的流程图。
图3.用于生物质的离子液体预处理的主要处理步骤。通过用离子液体培养，接着用洗涤溶剂如醇或水提取IL来预处理生物质。然后可以通过离心或过滤从离子液体/水-溶剂溶液中分离出处理过的生物质，并送至水解(糖化)反应器。可以在闪蒸步骤中从非挥发性离子液体中分离出洗涤溶剂(即，甲醇、乙醇或水)，而将离子液体返回至预处理罐中，溶剂返回至生物质洗涤步骤中。可以从糖化反应器中回收酶并循环利用。糖化后的残余固体部分主要是木质素，可以将其回收用于进一步的处理。
图4：左边的小瓶在120℃培养一小时后，在白杨/IL混合物中含有33重量％白杨。右边的小瓶在室温下含有未处理的白杨和IL(以其固体状态)。以该重量份数培养后使用IL-处理的白杨观察到明显的膨胀(～100％)。
图5.基于通式咪唑鎓的离子液体结构。
图6.基于通式吡啶鎓的离子液体结构。
发明详述
本发明是通过使用离子液体(IL)促进碳水化合物的有效而快速的酶水解来预处理木质纤维生物质的新方案。
包括农业(例如，玉米茎叶饲料)和林业残余物(例如，锯屑)和草本(例如，柳枝稷)和木质(例如，白杨树)作物的木质纤维生物质足够大量来提供制备燃料和化学物质的主要来源。在木质纤维的生物质中，结晶纤维素纤丝包埋在组织化不太充分的半纤维素基质中，其依次由外层木质素层围绕。多糖、纤维素和半纤维素的化学/生化水解成它们的单体糖提供了用于从生物质生产燃料和化学物质的基础前体物质(称为“糖平台”)。此外，纤维素生物质必须预处理，以在水解过程中实现糖的高产量。图1是预处理之前和之后的生物质图示。
图2是用于从生物质生产糖的典型方法的图示。预处理，是其中成本最高的步骤，对糖生产中的前序(例如，减小大小)和随后(例如，酶水解)操作的成本具有主要的影响。
离子液体具有非常低的挥发性，并且用作溶剂时，没有引起挥发性成分的散发。就这点而言，它们是环保溶剂。设计了IL来溶解纤维素和半纤维素。溶解后，可以通过使用抗溶剂将纤维素再生。然而，木质纤维材料(特别是木材)在IL中的完全分解更难，即使是部分分解，需要生物质在升高温度下的IL中培养非常长时间。尽管那样，通常在再生后不能获得高产量的纤维素(Fort，D.A.等，2007，Green.Chem.：9，63)。
我们的发明不同于上述传统方法对离子液体的使用，因为我们的目的不在于溶解木质纤维素，而是将其与IL接触非常短的时间，该时间足以主要破坏木质素覆盖物并使剩余的生物质结构明显膨胀(至少30％)。这种预处理能够使随后的酶水解过程在相对短的时间段内进行以及产生定量的葡萄糖产量和高产量的戊糖。在预处理方案中可以使用任何能够破坏氢键结构来降低生物质中纤维素结晶性的离子液体，在此由包括咪唑鎓、吡咯烷鎓、吡啶鎓、鏻或铵及其所有功能性类似物的阳离子结构来表示。例如，如图5中所示的结构，其中R1、R2、R3、R4和R5各自是氢，具有1至15个碳原子的烷基或具有2至10个碳原子的烯烃基团，其中烷基可以由砜、亚砜、硫醚、醚、酰胺、羟基或胺来取代，并且其中A是卤化物、氢氧化物、甲酸盐、醋酸盐、丙酸盐、丁酸盐、任何具有最高可达总共10个碳原子的功能化单-或二-羧酸、琥珀酸盐、乳酸盐、天冬氨酸盐、草酸盐、三氯醋酸盐、三氟醋酸盐、二氰胺或羧酸盐。IL结构的另一个实例显示于图6中，其中R1、R2、R3、R4、R5和R6各自是氢，具有1至15个碳原子的烷基或具有2至10个碳原子的烯烃基团，其中烷基可以由砜、亚砜、硫醚、醚、酰胺、羟基或胺来取代，并且其中A是卤化物、氢氧化物、甲酸盐、醋酸盐、丙酸盐、丁酸盐、任何具有最高可达总共10个碳原子的功能化单-或二-羧酸、琥珀酸盐、乳酸盐、天冬氨酸盐、草酸盐、三氯醋酸盐、三氟醋酸盐、二氰胺或羧酸盐。卤化物可以是氯化物、氟化物、溴化物或碘化物。
此外，可以使用含有等式1所述组合物的离子液体混合物。
Σn=120[C+]n[A-]n]]>
等式1中的C⁺表示IL的阳离子，而A^-表示IL的阴离子成分。加入混合物中的每种附加IL可以具有与之前的成分相同的阳离子或与之前的成分相同的阴离子，与第一组分的不同仅仅在于阳离子和阴离子的独特组合。例如，考虑以下ILs的五成分混合物，其中使用了共有的阳离子和阴离子，但是每种单独的IL成分是不同的：
[BMIM⁺][Cl^-]+[BMIM⁺][PF₆-]+[EMIM⁺][Cl^-]+[EMIM⁺][PF₆-]+[EMIM⁺][BF₄^-]
离子液体的最终混合物在绝对组成上将是不同的，如可以通过各种功能化阳离子和阴离子的摩尔百分比来限定。因此，混合物应当由不同重量比的各个所用成分组成，如通过等式1限定的。
我们证明了在本发明中使用几种这样代表性的溶剂用于预处理生物质，包括“新IL”，由我们合成的1-乙基-3-甲基咪唑丙酸盐(EMIM-Pr)。(参见，实施例IV)。
IL预处理过程的目的不是获得木质纤维素的任何溶解，而是将其接触IL足够的时间，以重新分布木质素并使剩余的生物质结构膨胀(图4中所示的)，以提高纤维素和半纤维素的水解率和转化成其组分糖。用合适的酶混合物糖化后，这些酶能够将预处理过的生物质中的所有碳水化合物转化成糖，留在糖化反应器中的大部分固体是生物质的木质素部分。这提供了从生物质回收木质素的方法。此外，水解产物的液体部分的超滤提供了从糖溶液回收水解酶用于再利用的一种方法，糖溶液是用于生产各种燃料和化学物质的前体物质(图3)。
将玉米茎叶饲料(农业残余物)和白杨(硬材)用作所示预处理实施例中的代表性木质纤维材料。表1a和表1b中给出了所有实验中所用的玉米茎叶饲料和白杨原料的组成分析。葡萄糖是从纤维素产生的唯一糖，而所有其他己糖和戊糖源自半纤维素。
表1a.通过LAPS分析的USDA玉米茎叶饲料组成分析

  成分  重量％(基于干重)  葡聚糖  34  木聚糖  20  阿拉伯聚糖  2.9  甘露聚糖  1.4  半乳聚糖  1  木质素  18.8  灰分  7
表1b.通过LAPS分析的白杨组成分析
  成分重量％ (基于干重)  葡聚糖     43.1  木聚糖     14  阿拉伯聚   4  甘露聚糖   1.8  半乳聚糖   1.7  木质素     29  灰分       0.8
将以下一种代表性的离子液体1-正-丁基-3-甲基咪唑鎓氯化物(BMIMCl)/1-正-乙基-3-甲基咪唑鎓醋酸盐(EMIMAc)/1-乙基-3-甲基咪唑鎓丙酸盐(EMIMPr)/1-烯丙基-3-甲基咪唑氯化物/3-甲基-N-丁基吡啶鎓氯化物接触小颗粒的干玉米茎叶饲料或白杨(-20+80目大小的颗粒)，在～50℃至200℃下持续不同的时间(～5分钟至8小时)。可以使用常规加热或微波辐射来进行生物质培养，只要离子液体在培养过程中处于熔化状态中。然后将IL-培养的生物质接触一种代表性的洗涤溶剂，即，甲醇/乙醇/水/乙腈/丁醇/丙醇。将洗涤溶剂与IL混合(以所有比例)，并因此能够从培养过的生物质中提取出来。然后可以通过离心从离子液体/洗涤溶剂中分离出处理过的生物质。然后用商业纤维素酶体系水解除去IL的生物质。通过合适的分离方法从洗涤溶剂和来自洗涤步骤的任何溶解的生物质成分中回收IL，合适的分离方法包括以下的一种或多种：活性碳处理，蒸馏，膜分离，电-化学分离技术，固相提取和液-液提取。然后可以将离子液体返回至预处理罐。洗涤溶剂也可以返回，再次用于洗涤IL-培养过的生物质中。随着多糖高转化成它们的单体糖，可以从糖化反应器中回收酶并循环。在IL循环之前，完全除去洗涤溶剂(水)不是必需的(参见实施例VIII)。许多其他预处理方法不易于方法中所用化学物质的回收。图3是这种预处理方法的流程图。
以下的实施例I至IV和相关的表2至8说明了我们的IL-预处理方法的代表性结果。在用IL的生物质(玉米茎叶饲料和白杨)预处理中，通过只使用补充纤维二糖酶的纤维素酶来糖化两种多糖，在约16小时内获得了～90％的葡聚糖(纤维素)转化成葡萄糖，此外，木聚糖(来自半纤维素)高转化成木糖(～50至70％)。葡聚糖(纤维素)转化成葡萄糖随着温度的增加而单调增加。木聚糖(半纤维素)转化成木糖通常随着提高IL温度而提高，但在非常高的温度下可能降低。显示出预处理条件的优化在糖化步骤中产生葡聚糖和木聚糖高转化成它们的单体糖。
未处理的玉米茎叶饲料生物质在36小时中只产生27％葡聚糖转化，而大部分确定的预处理方法需要72至170个小时来完成水解。实施例中提供了关于使用BMIMCl/EMIMAc/EMIMPr来预处理玉米茎叶饲料和白杨的细节的更多详细内容。
对于其他的预处理方法，包括在CAFI研究中[Wyman，C.E.等，Bioresource Tech.，2005.96：p.2026-2032]，可以在15FPU/g葡聚糖的酶装载下(在我们的糖化数据中使用了相同的装载)，从报道的水解72小时后的产量计算葡聚糖(纤维素)至葡萄糖和木聚糖(半纤维素)至木糖的转化(图2，步骤2)。葡聚糖至葡萄糖的转化为85至96％。木聚糖至木糖的转化为5至91％。除了在AFEX的情况中，这种转化成木糖大部分专门发生在预处理步骤的过程中(图2，洗涤流)。在AFEX中，木聚糖转化发生在水解步骤中，78％转化成木糖，和91％转化成木糖和可溶性木糖寡聚物。用我们的IL预处理在少于24小时内获得葡聚糖高转化成葡萄糖，并顺利地与CAFI报道的备选预处理技术相比较。用LI预处理的木糖转化也顺利地与CAFI报道的结果相比较。许多备选的预处理(除了AFEX)导致在酶添加前的木聚糖水解。从我们的结果可以看出在IL预处理过程中很少发生木聚糖水解或半纤维素衍生。然后通过我们预备性研究中所用的纤维素混合物，使木聚糖接受酶催化的水解。在我们的酶混合物中使用其他的木聚糖酶和阿拉伯聚糖酶具有进一步提高木糖产量的潜能。
此外，与大部分水基预处理方法不同，IL-预处理在培养步骤的过程中没有产生糖或其降解产物，因为这些通常是需要水存在的水解产物。只在添加酶时才产生糖。可以证明对随后的糖处理(如发酵成乙醇和乳酸)抑制作用的糖降解产物的不存在消除了对其他水解产物的“调节”步骤的需要-其中除去了这些抑制产物。(参见实施例XI和XII)。
可以与报道的玉米茎叶饲料AFEX预处理方法进行更直接的24小时水解比较。对于AFEX方法，使用15FPU/g葡聚糖纤维素酶装载，葡聚糖转化为约62％，而木聚糖转化为约45％[Teymouri，F.等，Bioresource Tech.，2005，96(18)：p.2014-2018]。在相同的纤维素酶装载下使用IL预处理，玉米茎叶饲料葡聚糖的24小时转化超过80％，而木聚糖转化为～45％。使用IL预处理，白杨葡聚糖转化超过90％，而木聚糖转化成单体糖超过65％。
文献中提出的大部分预处理方法，除了磷酸处理外[Zhang，Y.-H.P.等，Biomacromolecules，2006.7(2)：p.644-648]，没有破坏纤维素结晶性，这是实现快速纤维素消化(水解)的重要特征。可以通过X-射线粉末衍生(XRD)数据的分析来获得生物质结晶性的测量。使用XRD测量IL预处理后白杨的结晶性，并且使用为纤维素研发的标准技术来计算结晶性指数CrI[Segal，L.等，Text.Res.J.，1959.29：p.786-94]。天然白杨具有40至50的测量CrI。约10的CrI表示纤维素部分的几乎完全的解晶作用。如表18中看到的，糖化动力学和CrI之间的强烈相关性。该数据解释了为什么IL-预处理与大部分其他预处理方法相比，能够实现足够快速的糖化。
这些观察到的使用IL-预处理的快水解率还开辟了使用比大部分其他预处理方法通常所用的那些更“低酶装载”来实现糖化的可能性。实际上，如实施例V中所示的，我们能够将酶装载削减至大部分CAFI研究中所用的2/3或1/3(即，15FPU纤维素酶和60CBUβ-葡聚糖酶/g葡聚糖)，并且还获得了相等的葡萄糖和木糖产量(参见表9)。这是非常重要的结果，因为酶的成本明显影响从生物质生产糖的整体成本。
因为IL-预处理只需要足够的IL来膨胀生物质结构，我们能够在培养步骤的过程中使用最小量的IL用量来处理非常大量的生物质。实施例III说明了这，其中在培养步骤中使用了高如1∶2的白杨与IL的重量比。在这些高白杨装载下，培养的混合物基本上是如图4中所示的湿膨胀粉末。这种湿粉末，在洗去IL后的酶水解时，产生了非常高的葡萄糖和木糖转化，如可以从表6中看到的。
我们不仅能够显著地降低预处理溶剂(即，IL)的用量，而且还能够通过用洗涤溶剂将培养过的生物质洗涤几次来完全回收(～100％)，如实施例VIII中所示的(表13至17)。该实施例证明了IL没有不可逆地吸收在任何生物质成分上，即使是在高生物质/IL比例下，其中生物质的可利用表面积非常高。
我们通过从挥发性非常低的IL中蒸发洗涤溶剂(乙醇和/或水)，从IL/洗涤溶剂混合物中回收IL。然后可以使用回收的IL，而在随后相同预处理条件下的生物质预处理循环中不需要其他清洗步骤。我们已经重复使用了回收的IL，并且注意到在预处理生物质中没有任何效率损耗，即使是在15次循环后，如实施例IX中所示的(参见，表19，20和21)。这种使用最小量清洗而重复再利用IL的能力将对IL-预处理的经济学具有深远的影响。
回收的IL中的残余水可能降低IL切断影响纤维素结晶性的链间和链内氢键的能力。为了作用于生物质的膨胀，必须破坏几种纤维素氢键。因此，我们预期溶解的水作为生物质预处理溶剂来影响IL的性能。IL中可容许的含水量可以在两个方面影响预处理方法的经济学。首先，其决定了在再利用之前IL必须有多干。其次，其决定了用IL培养的过程中，生物质必须有多干。在实施例VII中，我们研究了IL的含水量对其效率的影响，并且观察到IL的效率没有削弱至任何可知的程度，直至溶解水含量超过约15％重量。(参见表12)。
对大生物质颗粒能有效工作的预处理方法是特别有价值的，因为与原料预处理(减小大小)相关的能量需求(和因此的成本)随着用于预处理的可接受“平均粒径”的增大而按指数降低。因此，在实施例VI中，我们研究了生物质粒径在我们的预处理技术中对糖化速率和糖产量的影响。我们显示出我们的预处理技术在850μm至180μm的粒径范围中能同样工作(参见，表10)。
我们的IL-预处理和糖化技术使得可以回收生物质中以糖化后固体残余物形式的木质素(实施例X)。
最后，白杨IL预处理后获得的水解产物中的糖可以转化成燃料乙醇(实施例XI)或其他生物产品，如乳酸(实施例XII)，没有进一步的调节以及来自水解产物中任何残余的微量IL的不利影响。这种残余物进一步的化学/生化处理将形成能用于生产燃料、化学物质、聚合物和其他材料的化合物。
实施例I：用BMIMCl预处理玉茎叶饲料秆不用的温度/时间
系统地改变培养时间和温度来是实现葡聚糖和木聚糖最佳地转化成它们的单体糖。将玉米茎叶饲料在BMIMCl中在130或150℃下培养10分钟，1或3个小时。
预处理：将玉米茎叶饲料与IL混合来形成混合物中5％重量比生物质(5％w/w)。使用混合在130或150℃下将混合物培养10分钟，1小时和3小时。通过加入水、离心并取出上清液，以生物质中提取离子液体。将固体残余物清洗直至完全提取出IL。
酶水解：将洗涤过的固体加入反应缓冲液中(0.05M柠檬酸钠缓冲液，pH4.8)，来形成缓冲液中百分之一重量的生物质固体混合物。使用20FPU/g玉米茎叶饲料(60FPU/g葡聚糖)浓度的商业纤维素酶，Spezyme CP，其中FPU表示滤纸单位。通过添加40CBU/g玉米茎叶饲料(120CBU/g葡聚糖)的Novozyme 188来补充β-葡糖苷酶，其中CBU表示纤维素酶单位。转化成葡萄糖和木糖的百分比是基于加入预处理步骤中的玉米茎叶饲料的质量以及玉米茎叶饲料的葡聚糖和木聚糖含量。(表1a)。通过使用高性能液体色谱来分析糖浓度，使用折射率检测。
结果：玉米茎叶饲料葡聚糖和木聚糖各自转化成葡萄糖和木糖，作为酶水解过程时间的函数，显示于表2和3中。与未处理的玉米茎叶饲料样品相比，用IL的预处理导致葡聚糖至葡萄糖的水解速率明显提高(表2)。与未处理玉米茎叶饲料相比时，使用IL预处理也提高了木聚糖至木糖的转化(表3)。糖化时(酶水解)，在150℃下预处理生物质1小时，在水解的36小时内，产生纤维素糖100％转化成葡萄糖，并且61％木聚糖转化成木糖。该结果是具有重要意义的，因为大部分现有的预处理方法需要72至170小时的水解来实现高于90％的纤维素转化。
在150℃下在IL中将生物质培养超过1小时没有明显提高木糖产量，尽管仍然获得了100％的葡萄糖产量。实际上，在150℃下培养3小时与在150℃下培养1小时相比，似乎降低了木糖产量(表3)。
表2.使用不同的培养时间和温度作为水解(Hyd)时间的函数时玉米茎叶饲料葡聚糖转化成葡萄糖的百分比

^**在24小时水解时的葡萄糖转化
表3.使用不同的培养时间和温度作为水解时间的函数时玉米茎叶饲料木聚糖转化成木糖的百分比

实施例II：使用EMIM醋酸盐的玉米茎叶饲料和白杨
1-乙基-3-甲基咪唑醋酸盐(EMIM醋酸盐)，除了具有破坏结晶纤维素的氢键结构的高能力以外，在室温下为液体，并且具有低于BMIMCl的熔点。这些特征使其从方法的立场与BMIMCl相比成为更方便的代表性IL。该实施例描述了使用EMIM醋酸盐的预处理实验。
将玉米茎叶饲料和白杨粉碎并分离至相同的筛网大小。将样品与EMIMAc混合，以形成5重量％生物质的生物质/IL混合物，并且边搅拌边在不同的温度和时间下培养，接着用水洗涤。
酶水解：用于酶水解的程序与实施例I中所述的相同(糖化缓冲液中1重量％生物质)，除了以下所述的酶载荷的改变。所报道的转化成葡萄糖和木糖的百分比是基于预处理步骤中添加的生物质(玉米茎叶饲料/白杨)量和该含量的糖含量。以15FPU纤维素酶(Spezyme CP)/g葡聚糖和60CBU β-葡糖苷酶(Novozyme 188)/g葡聚糖的固定酶载荷来水解样品。
结果：如表4和5中所看到的，葡聚糖(纤维素)转化成葡萄糖随着温度的升高而单调增加。木聚糖(半纤维素)转化成木糖通常随着升高IL温度而增加，但在高预处理温度下可能下降。
表4.对于在不同预处理温度和时间(第一栏)下在EMIMAc中培养的白杨，给出了10和24小时酶水解后葡聚糖和木聚糖至葡萄糖和木糖的转化。IL-生物质混合物中生物质部分的重量为5％。

表5.对于在不同预处理温度和时间下在EMIMAc中培养的玉米茎叶饲料，给出了10和24小时酶水解后葡聚糖和木聚糖至葡萄糖和木糖的转化。IL-生物质混合物中生物质部分的重量为5％。

实施例III：在高生物质比例下的白杨和EMIM醋酸盐
将白杨粉碎并分离至相同的筛网大小，在EMIM醋酸盐中培养，然后用水洗涤。将样品与IL混合，以形成不同重量％生物质的生物质/IL混合物，并没有搅拌在120℃下培养1小时。如图4中所看到的，在高重量分数的生物质比IL下，生物质在吸收IL后明显膨胀。
酶水解：用于酶水解的程序与实施例II中所述的相同。
结果：如表6中所看到的，在预处理中所用的所有生物质分数下在酶糖化24小时后，葡聚糖(纤维素)转化成葡萄糖是高的。
表6.对于在不同生物质重量百分比下在EMIMAc中培养的白杨，给出了葡聚糖和木聚糖各自至葡萄糖和木糖的转化。IL-生物质混合物中的生物质的重量分数是不同的。对于33％重量的生物质，在48小时时葡聚糖转化成葡萄糖为89％。对于其他重量分数，在24和48小时时葡聚糖转化几乎未改变。

实施例IV：在预处理和糖化步骤中用高生物质重量分数的白杨和EMIM丙酸盐或醋酸盐
可以处理高重量分数生物质的室温IL(RTIL)对于本发明中提出的IL-预处理技术的商业化实施特别有价值。RTIL，在室温或接近室温下是液体，具有可以容易并经济地进行预处理技术的不同步骤(流动，混合等)的物理特性。此外，如果RTIL还具有破坏纤维素结晶性的高能力，将是理想的预处理溶剂。“新IL”EMIM-丙酸盐(由我们合成)和EMIM醋酸盐是符合这些要求的代表性IL。该实施例证明了这两种IL在高生物质载荷下在预处理(33％)和糖化步骤(10％)中的性能。
将白杨在1-乙基-3-甲基咪唑丙酸盐、EMIM Pr或EMIMAc中培养，然后用水洗涤。将样品与IL混合来形成33％重量生物质的生物质/IL混合物，并没有搅拌而在120℃下培养1小时。
酶水解：用于酶水解的程序与实施例II中所述的相同，除了酶载荷是10FPU纤维素酶/g葡聚糖和60CBUβ-葡糖苷酶/g葡聚糖酶，在糖化缓冲液中使用10重量％生物质。
结果：如表7和8中所看到的，使用两种IL，在预处理和糖化步骤中所用的高生物质分数下，葡聚糖(纤维素)转化成葡萄糖是高的。
表7：对于在33％重量生物质下在EMIM醋酸盐中培养的白杨，给出了葡聚糖和木聚糖至葡萄糖和木糖的转化。
  时间(小时)  葡聚糖转化(％)  木聚糖转化(％)  12  79  64  24  75  67
表8：对于在33％重量生物质下在EMIM丙酸盐中培养的白杨，给出了葡聚糖和木聚糖至葡萄糖和木糖的转化。
  时间(小时)  葡聚糖转化(％)  木聚糖转化(％)  12  76  66  24  83  73
实施例V：用低酶载荷的预处理白杨糖化
将白杨在EMIMAc中培养，然后用水洗涤。将样品与IL混合，形成在IL中5％重量生物质的生物质/IL混合物，并边搅拌边在120℃下培养30分钟。
酶水解：用于酶水解的程序与实施例II中所述的相同，除了改变了每克葡聚糖的纤维素酶和β-葡糖苷酶载荷。白杨的质量以及转化成葡萄糖和木糖的百分比是基于预处理步骤中添加的质量和该质量的糖含量。
结果：如表9中所看到的，在低酶载荷下在24小时酶糖化后，发现了葡聚糖(纤维素)至葡萄糖和木聚糖(从半纤维素)至木糖的高转化。
表9：对于在EMIM醋酸盐中培养的5重量％的白杨，给出了葡聚糖和木聚糖至葡萄糖和木糖的转化。酶载荷是不同的，并且各自列出了FPU纤维素酶或CBUβ-葡糖苷酶/g葡聚糖。

实施例VI：大颗粒的预处理生物质
将白杨或玉米茎叶饲料生物质粉碎并分离成不同筛网大小的级分，这些级分包括：
筛网大小+20的大颗粒(850μm)；
筛网大小-20+80的宽范围大小颗粒(粒径小于850μm而大于180μm)；和
筛网大小-40+60的颗粒(粒径小于425μm而大于250μm)。
将生物质样品与EMIM醋酸盐混合来形成5重量％生物质的生物质/IL混合物，并边搅拌边在120℃下培养30分钟。在酶水解之前，用水洗涤培养过的样品。
酶水解：用于酶水解的程序与实施例II中所述的相同。
结果：如表10中所看到的，IL预处理在大范围的粒径中都是有效的。大颗粒的使用导致水解速率与研磨更细的颗粒那些相似。
表10：在糖化9和24小时后，对于不同粒径的白杨和玉米茎叶饲料样品酶水解的葡聚糖至葡萄糖和木聚糖至木糖的转化

实施例VII：水分对生物质的IL预处理的影响
所有将纤维素链连接其邻近链的氢键的完全断裂是从(半结晶)固体纤维素基质分解纤维素必需的第一个步骤。公知IL中合适含量的溶解水的存在影响其溶解纤维素的能力。水降低了IL断裂给予纤维素结晶性的链间和链内氢键的能力。而我们的预处理方法不需要IL中生物质的纤维素部分的分解，为了使其膨胀，一些纤维素氢键必需被断裂。因此，我们预期溶解水作为生物质预处理溶剂来影响IL的性能。
IL中可容许的水含量可以在两个方面影响预处理方法的经济学。首先，其决定在再利用之前IL必需有多干。其次，其决定在用IL培养的过程中生物质必需有多干。因此，测定了IL的含水量对我们预处理技术的有效性的影响，在该实施例中，我们故意在生物质的培养之前，将不同比例的水加入IL中(表11)，并从所得到的预处理过的生物质测量水解速率和糖产量。
预处理：将白杨与IL和水混合来形成20％重量生物质和不同重量％水的生物质/IL/水混合物(表11)。没有搅拌在120℃下在密闭容器种将混合物培养1小时，然后用水洗涤。
表11：用含有不同wt％水的EMIM醋酸盐培养白杨。在这些实验中调节IL和水的重量来获得20wt％白杨和0至20％的水。
  实验  白杨  (mg)  EMIMAc  (mg)  水(mg)  水分％  预处理时间  (分钟)  预处理温  度  1  200  800  0  0  60  120℃  2  200  750  50  5  60  120℃  3  200  700  100  10  60  120℃  4  200  600  200  20  60  120℃
酶水解：用于生物质酶水解的程序与实施例II中所述的相同，除了酶载荷为15FPU纤维素酶/g葡聚糖和60CBUβ-葡糖苷酶/g葡聚糖，并使用糖化缓冲液中5重量％生物质。
结果：如表12中所看到的，在水解24小时结束时，葡聚糖(纤维素)转化成葡萄糖和木聚糖转化成木糖仍然基本上未受影响，直至培养混合物中水分超出10％很多。然而，使用含有20％和更高水平水分的培养混合物，水解速率明显下降，并且糖产量下降。
表12：加水IL中培养的白杨的酶水解

实施例VIII：IL的回收
离子液体没有不可逆地吸收至生物质中并可以在培养步骤中所用的所有(低至高)生物质载荷(生物质与离子液体的重量分数)下在洗涤溶剂中完全回收。该实施例描述了采取实验来确定生物质预处理后洗涤溶剂中回收的IL量。
表13：用于确定进入洗涤溶剂中IL回收率的预处理实验(不同生物质载荷下)的详细内容
  生物质  载荷  白杨  (mg)  EMIMAc  (mg)  白杨％  预处理时  间(分钟)  预处理  温度  预处理中的  其他条件  低  250  4750  5  30  120℃  伴有混合  中  200  1800  10  30  120℃  无混合  高  300  700  30  60  120℃  无混合
在表13显示的所有情况中，将生物质在培养后在室温下接触洗涤溶剂(水或乙醇)30分钟，伴随搅拌(除了30％生物质的情况，其中将温度维持在40℃)。然后将样品离心，并取出上清液，使用带有光电二极管阵列检测仪的高性能液相色谱分析离子液体(IL)浓度。上清液指的是洗涤溶液，并测量洗涤体积。用洗涤溶剂将生物质洗涤几次。通过色谱的浓度测量精确性大约为2％。
对于预处理步骤中的5％和10％白杨，用乙醇洗涤的结果，各自在表14和15中给出。如从这些表中可看到的，在预处理步骤中5％(低)和10％(中)生物质载荷下都获得了洗涤溶液中IL非常高的回收(接近100％)。
表14.以下对于预处理步骤中5％白杨给出了使用乙醇作为置换溶剂的回收离子液体的洗涤体积，组成和总重。
  洗涤  浓度(mg/ml)  体积(ml)  重量(mg)  1  2  3  113.9  8.86  0.433  38.25  37.50  38.25  4357.3  332.9  16.5
洗涤溶液中回收的总IL，4706.7mg，表示99％的回收。
表15.以下对于预处理步骤中10％白杨给出了使用乙醇作为置换溶剂的回收离子液体的洗涤体积，组成和总重。
  洗涤  浓度(mg/ml)  体积(ml)  重量(mg)  1  2  3  4  38.6  3.47  0.208  0.026  42.5  42.5  39.5  40  1640.5  147.5  8.2  1.0
洗涤溶液中回收的总IL，1797.2mg，表示99.8％的回收。
对于预处理步骤中30％的白杨，用两种溶剂(水和乙醇)洗涤的结果各自在表16和17中给出。如从这些表中所看到的，使用这些洗涤溶剂中的任何一种，在培养步骤中所用的700mgIL得到完全回收。
表16.以下对于预处理步骤中30％白杨给出了使用水作为置换溶剂的回收离子液体的洗涤体积，组成和总重。
  洗涤  浓度(mg/ml)  体积(ml)  重量(mg)  1  2  3  4  25.55  9.626  0.841  0.093  23  11.5  11.5  11.5  587.7  110.7  9.7  1.1  总计709.2
洗涤溶液中回收的总IL，709.2mg，表示浓度测量精确性内的100％回收。
表17.以下对于预处理步骤中30％白杨给出了使用乙醇作为置换溶剂的回收离子液体的洗涤体积，组成和总重。
  洗涤  浓度(mg/ml)  体积(ml)  重量(mg)  1  2  3  4  24.9  7.00  0.752  0.119  24.5  11.5  12.0  11.5  609.5  80.5  9.0  1.4  总计700.2
洗涤溶液中回收的总IL，700.2mg，表示浓度测量精确性内的100％回收。
实施例IX：IL的循环利用
将白杨与EMIMAc混合来形成IL中5重量％生物质的生物质/IL混合物。将其边搅拌边在120℃下培养30分钟，然后用乙醇洗涤三次，接着用水洗涤两次。通过从非常低挥发性的IL中蒸发乙醇和水，从乙醇和水洗涤物中回收IL。然后将回收的IL用于随后的相同条件下的生物质预处理循环中。通过从回收的IL中取出的样品的Karl Fischer滴定来监控IL的含水量，以确保含水量低于可接受的水平(参见，实施例VIII)。在每次循环后加入补充的IL(总IL的5-10％)以补偿由于水分析取样的损耗。(这种与取样相关的IL损耗是由于我们的实验中所用的总IL量小而产生的，并且在大规模循环中将不是问题)。将循环的IL在预处理生物质中的性能与新鲜IL的相比，以确定直至IL保持其有效性并可以不需要其他清洗步骤而再次利用的最小循环次数。可以通过以下两种程序之一来定量IL的性能：(1)预处理生物质的酶水解(按照之前实施例中的来进行)或(2)预处理生物质的X-射线粉末衍射(XRD)。之后较简单并可以快速进行的程序使得可以计算生物质的结晶度指数CrI(Segal，L.等，Text.Res.J.，1959，29：p.786-94)。我们观察到预处理后生物质结晶度的损耗与预处理生物质的酶消化性(糖化动力学)相关。
酶水解：用于酶水解的程序与实施例II中所述的相同。
XRD：将光滑的薄膜在室温下盖在铝样本盘上的预处理过的生物质上。在25℃下用带有Xcelerator’检测仪的XPERT’PRO粉末衍射计PANalytical，使用Nickel滤过CuKα辐射，产生这些薄膜的X-射线粉末衍射(XRD)数据。在6.0-45.0°，2θ的角度范围内扫描样品。从这些扫描可以计算CrI。
天然白杨具有约40至50的测量CrI。如从表18中所看到的，在生物质碳水化合物的酶消化性和其CrI之间存在强烈的相关性。
表18.对于从高温至低温用新鲜IL预处理过的白杨，通过酶糖化24小时后的CrI以及葡聚糖和木聚糖至单体糖的百分比转化。结晶度的损耗与提高的葡聚糖和木糖转化明显相关。

结果：循环的IL产生与新鲜IL相似的结晶度降低(表18和19)。对于不同次数的IL循环，记录了36小时酶糖化后用循环的IL培养后的葡聚糖(纤维素)转化成葡萄糖(表20)。超过100％的转化反映出与高性能液相色谱技术的折射率检测仪方法相关的糖分析(5至10％)中的不确定性。
表19：未处理的(天然)白杨和用循环的IL(循环次数)预处理的样品的CrI表明循环的IL在重复循环后在降低生物质样品结晶度中是有效的。未处理的天然白杨具有43的CrI。
  循环次数  CrI  0  9  7  15
表20：用新鲜或循环的IL(循环次数)来IL预处理白杨表明循环的IL在重复循环步骤后在提高生物质样品的糖化中是有效的。
  循环次数  葡萄糖转化％  木糖转化％  0  100  70  6  99  59  9  104  77
对于较高生物质与IL比例(20％)的相似结果显示于表21中。在此，即使在15次循环后，我们看到IL的有效性没有损耗，如通过预处理白杨酶水解24小时结束时的高葡萄糖产量(～90％)所示。表21最后一栏中所示的水解产物发酵结果将在下一个实施例中讨论。
表21：用循环的IL预处理的白杨和预处理步骤中20％生物质的酶水解4，12和24小时后的葡萄糖转化。给出了4小时发酵的乙醇产量。使用循环的IL维持了高葡萄糖转化。

实施例X：木质素的回收
我们进行了NREL推荐的生物质(白杨)固体部分的LAPS分析，来鉴定其在我们预处理过程中的三个阶段的纤维素、半纤维素和木质素比例：(1)培养前的新鲜生物质，(2)用洗涤溶剂提取IL后的预处理过的生物质和(3)预处理过的生物质糖化(酶水解)后生物与的固体残余物。通过比较这些阶段的固体的木质素含量，我们推断在白杨的IL预处理中，木质素主要在生物质的表面得到了重新分布，并没有在IL中溶解至任何可知的程度。这种重新分布使得IL可以接近生物质的半纤维素和纤维素部分并使其膨胀。糖化后，残余的固体主要是木质素，并且因此水解产物的过滤提供了回收木质素的简易方法，木质素形成了用于各种生物产品的前体物质(参见，图3)。
实施例XI：使用啤酒酵母将预处理过的白杨发酵成乙醇
在该实施例中，我们研究了IL-预处理过的白杨酶水解后获得的水解产物的发酵。我们没有尝试将水解产物在发酵前接受任何“调节”来除去潜在的发酵抑制化合物。我们认为我们的生物质IL预处理，其涉及用IL在几乎无水的环境中培养生物质，将不会产生在其他水基预处理方法中常见的化合物，如羟甲基糠醛(HMF)和糠醛，其抑制随后的糖发酵成乙醇。此外，这些发酵运行证实了水解产物中存在的任何痕量IL对发酵过程没有不利影响。我们尝试对使用新鲜IL以及循环的IL产生的水解产物进行发酵。原则上，在每次循环步骤之间除了除去水以外没有另外的清洗步骤时，来自生物质的一些非挥发性提取物可以在几次循环的IL中累积。目的是为了证实这些累积的化合物是否以任何方式影响了发酵。
用新鲜IL预处理后没有“调节”而获得的水解产物的发酵：将白杨在EMIM醋酸盐中培养。将样品与IL混合来形成IL中10wt％生物质的生物质/IL混合物，并边搅拌边在120℃下培养一小时。用水洗涤预处理过的生物质，以除去全部IL。
酶水解：通过酶水解将预处理过的生物质糖化。用于酶水解的程序与实施例II中所述的相同，除了在缓冲液中2、5和10％的不同生物质重量比下进行水解。
发酵：使用酿酒酵母形式的干发面酵母(10g/l)(II型，Sigma Aldrich)。在白杨酶水解24小时后加入酵母。基于生物质中最初的糖来计算乙醇的终产量。在培养摇床中在34℃的温度和130rpm下进行发酵。发酵后获得的乙醇产量显示于表22中。对于2和5％的白杨载荷在9小时后，对于10％的白杨载荷在24小时后，乙醇的产量保持恒定。来自酶水解的产量接近于理论(参见表22的第二栏)。
表22：酶糖化24小时接着发酵后测量的葡萄糖转化。来自EMIMAc预处理的白杨依次水解和发酵的乙醇产量，在九小时发酵(2和5％白杨)或24小时发酵(10％白杨)后。
  糖化中的百分比生物质  葡萄糖转化(％)  乙醇转化(％)  2  100  92  5  102  76  10  84  73
用回收的IL预处理后没有“调节”而获得的水解产物的发酵：通过将10mg/ml发面酵母加入水解产物中来评价水解产物的发酵并在30℃下发酵四小时后取样。基于从白杨样品中的葡聚糖壳获得的葡萄糖来计算乙醇产量。所得到的产量显示于表21的最后一栏中(之前的实施例)。如从表21中所看到的，即使在13次IL再利用的循环后，乙醇产量几乎与使用新鲜IL的运行所看到的那些相同(表22)。表21和22中的数据还证实了IL中残留的任何痕量IL对发酵没有不利影响。
实施例XII：使用干酪乳杆菌将IL-预处理过的白杨水解产物发酵成乳酸
将白杨在EMIM醋酸盐中培养。将样品与IL混合来形成IL中30wt％生物质的生物质/IL混合物，并且没有搅拌在120℃下培养一小时。用水洗涤预处理过的生物质，以除去全部IL。
酶水解：通过酶水解来糖化预处理过的生物质。用于酶水解的程序与实施例II中所述的相同，除了在缓冲液中10％下进行水解。糖化溶液中的葡萄糖含量(通过HPLC测定)为20mg/ml。
细菌菌株和培养基：干酪乳杆菌购自ATCC并按照所提供的实验方案来生长。使细胞生长于MRS培养液(Becton Dickinson)以及MRS琼脂平板上，生长强壮。将菌株维持在4℃下的琼脂平板上。
培养基制备：还在pH4.8的50mM柠檬酸盐缓冲液中制备对照培养基溶液。培养基中的成分为蛋白胨10g/l，牛肉提取物10g/l，酵母提取物5g/l，葡萄糖20g/l，聚山梨酸酯801g/l，醋酸钠5g/l，硫酸镁0.1g/l，硫酸锰0.05g/l和磷酸氢二钾2g/l。用氢氧化铵将pH调节至6.5。将溶液过滤灭菌或在121℃下高压灭菌30分钟。以完全相同的方式制备生物质培养基溶液，除了没有将葡萄糖加入溶液中。
发酵条件：所有实验在在摇床上在37℃和150rpm下在摇瓶中进行。通过将细菌菌株从琼脂平板转移至摇瓶中并使其培养20小时来制备接种物。发酵摇瓶接受20％接种物体积。
分析方法：通过装备有RI检测仪和UV检测仪的HPLC在210nm处测定乳酸浓度和葡萄糖浓度。使用了有机酸柱(Biorad HPX-87H)，使用流速为0.4ml/分钟的5mmol H2SO4作为移动相，并将柱维持在65℃。通过使用UV-Vis分光光度计在600nm测量吸光值来测定细胞密度。
结果：

对于对照溶液，乳酸产量为35％。在摇瓶中没有强壮的生长。然而，在种子烧瓶中，通常观察到强壮的生长，具有最大的OD4.0，和50％的乳酸产量。
对于生物质溶液，乳酸产量为100％。在摇瓶以及种子烧瓶中都看到了强壮的生长。在种子烧瓶中，观察到9.5的OD，乳酸产量为100％。这样高的转化表明细菌菌株能够使用其他从生物质水解的糖(除了葡萄糖以外)。监控木糖，在发酵过程中没有消耗。
改进
所讨论的特定的组合物、方法或实施方案只是对本说明书公开的本发明的说明。基于本说明书的教导，对这些组合物、方法或实施方案的改变是本领域技术人员显而易见的，因此这些改变旨在作为在此公开的本发明的一部分。
在另一个实施方案中，在离子液体(IL)中培养生物质的步骤在合适的温度下持续足够的时间来除去或重新分布实质性部分的木质素，使得IL能够渗透半纤维素以及包埋在半纤维素中的结晶纤维素并使这些结构明显膨胀。明显膨胀广义地为至少20％膨胀，并优选至少30％。然后，膨胀可以是非常宽范围的。膨胀可以是20至300％膨胀；30至200％膨胀或30至100％膨胀。通常，膨胀范围为30至50％。
给出以上本发明的详述是为了解释的目的。本领域技术人员将清楚可以进行各种变化和改进，而不脱离本发明的范围。因此，之前的整个描述应被解释为说明性的而不是限制性的，本发明的范围仅由所附的权利要求来限定。
给出以上本发明的详述是为了解释的目的。本领域技术人员将清楚可以进行各种变化和改进，而不脱离本发明的范围。因此，之前的整个描述解释为说明性的而不是限制性的，本发明的范围仅由所附的权利要求来限定。