测定构成肝素的特殊基团的方法.pdf

本发明涉及测定构成肝素的特殊基团的方法，其特征在于待测定样品使用肝素酶进行解聚，如果必要的话，再还原所得到的解聚产物。然后进行高效液相层析分析。

1.  下式的三糖衍生物：

测定构成肝素的特殊基团的方法
本申请为2007年2月7日提交的、发明名称为“测定构成肝素的特殊基团的方法”的申请(申请号为200710007033.9)的分案申请，申请号为200710007033.9的申请是2003年9月22日提交的、发明名称为“测定构成肝素的特殊基团的方法”的PCT申请PCT/FR2003/002782的分案申请，所述PCT申请进入中国国家阶段的日期为2005年3月22日，申请号为03822562.X。
技术领域
本发明的目的是一种分析构成肝素或低分子量肝素的特殊基团的方法。
背景技术
在使用纯肝素制备依诺肝素(US5,389,618)的方法中，在含水相中进行碱性解聚的方法步骤使低聚糖链还原末端的葡糖胺发生了部分而特征性的转化。
这种转化的第一个步骤包括葡糖胺甘露糖胺的差向异构作用(T.Toida等人，《碳水化合物化学杂志(J.Carbohydrate Chemistry)》，15(3)，351-360(1996))；第二个步骤是葡糖胺的6-O脱硫作用，其结果是生成了称之为“1，6-脱水”衍生物的产物(国际专利申请WO01/29055)。

只是其末端葡糖胺被6-O-硫酸化的那些低聚糖链才得到这类衍生物。
其末端用1，6-脱水键改性的低聚糖链的百分比是依诺肝素低聚糖混合物的结构特征，因此应该能够进行测定。
发明内容
因此，本发明涉及分析肝素、低分子量肝素、更具体地是依诺肝素的方法。
本发明的分析方法如下：
通过肝素酶的作用使待测定样品解聚，然后必要的话，将得到的解聚产物还原，再采用高效液相层析进行分析。
因此，如前面定义方法的特征在于鉴定末端用1，6-脱水键改性的低聚糖链的存在(“1，6-脱水基团”)。
具体而言，首先使用肝素酶混合物、特别是使用肝素酶1(EC4.2.2.7.)、肝素酶2(肝素裂解酶II)和肝素酶3(EC4.2.2.8.)(这些酶是GrampianEnzymes公司销售的)的混合物，使待测定样品彻底地解聚。
因此，本发明的目的是一种分析肝素或低分子量肝素的方法，其特征在于进行下述步骤：
1)通过肝素酶的作用使样品解聚，
2)如果适当，还原解聚产物，
3)采用高效液相层析法测定。
更具体地讲，本发明的目的是如前面定义的方法，其特征在于所述肝素酶呈肝素酶1(EC4.2.2.7.)、肝素酶2(肝素裂解酶II)和肝素酶3(EC4.2.2.8.)混合物形式。
优选将如此制备的解聚产物再使用NaBH₄在乙酸钠中的溶液进行处理。这后一步骤可以特异性地减少没有呈1，6-脱水形式的还原末端(在专利申请WO01/72762中描述的产物)。最后，为了能够定量测定下面描述的二糖1和2，应该通过例如NaBH₄还原剂的作用使采用肝素酶解聚的低分子量肝素样品进行还原。
所以，更具体而言，本发明的目的是如前面定义的方法，其特征在于然后还原解聚的肝素。
非常具体地讲，本发明的目的还是如前面定义的方法，其特征在于所述还原剂是NaBH₄。任选使用其它碱金属的硼氢化物，例如硼氢化锂或钾。
然后采用HPLC(高效液相层析法)、特别是采用阴离子交换层析法进行1，6-脱水端的测定。
本发明的测定方法能够很好地将依诺肝素与其它不含有1，6-脱水衍生物的低分子量肝素区分开来。相反，本发明的测定方法能够保证这些低分子量肝素不满足依诺肝素的物理-化学特性，因此具有不同的性质。
本发明的测定方法能够应用于工业生产过程，在生产过程中对样品进行监控，以保证依诺肝素生产过程的标准化，达到均一的质量。
在酶解聚作用和还原末端的还原后，依诺肝素的1，6-脱水衍生物呈四种基本形态。因此，本发明再一个目的是如前面描述的方法，其特征在于当解聚反应是如下反应时，得到如下所示的1，6-脱水残留物：

二糖1                              二糖2

二糖3                                        四糖1
在末端二糖单元有1，6-脱水末端，在所述末端二糖的糖醛酸没有2-O硫酸酯基的所有这些低聚糖或多聚糖，完全被所述肝素酶解聚，并呈二糖1和2形式。然而，当所述的末端二糖在糖醛酸有2-O硫酸酯基，并且它呈甘露糖胺形式时，这种1，6-脱水衍生物呈四糖1形式(耐肝素酶的形式)。
这种混合物中也存在三糖1(见下面)。它来自于其它的降解过程，具有下面的结构(依诺肝素化学解聚时观察到的剥离现象)。

三糖1
该混合物的其它组分不是依诺肝素的特有特征。肝素链中有8个基本二糖。Sigma公司特别销售这8个基本二糖。
采用本发明的方法可鉴定出混合物中的其它二糖：ΔIIs_gal和ΔIVs_gal二糖，它们的来源是-IdoA(2S)-GlcNS(6S)-和-IdoA(2S)-GlcNS-的碱性2-O脱硫作用，并由此生成2种半乳糖醛酸。它通常不存在于肝素的原始结构中(U.M.Desai及其同事，《Arch.Biochem.Biophys.》，306(2)461-468(1993))。

含有3-O硫酸化葡糖胺的低聚糖可抗肝素酶的裂解作用，因此可以四糖形式存在。
在大多数低分子量肝素的情况下，肝素是从猪粘液中提取的，而这些主要的四糖表示如下。它们抗酶解聚，并且反映了对抗凝血酶III的亲合顺序。它们可表征如下：ΔIIa-IIs_glu和ΔIIa-IVs_glu。(S.YAMADA，K.YOSHIDA，M.SUGIURA，K.SUGAHARA，K-H KHOO，H.R.MORRIS，A.DELL，《J.Biol.Chem.》；270(7)，4780-4787(1993)。

通过肝素酶裂解从混合物中分离的后一组分是葡糖丝氨酸(glycosérine)端基ΔGlcA-Gal-Gal-Xyl-Ser(K.SUGAHARA，H.TSUDA，K.YOSHIDA，S.YAMADA，《J.Biol.Chem.》；270(39)，22914-22923(1995)；K.SUGAHARA，S.YAMADA，K.YOSHIDA，P.de WAARD，J.F.G.VLIEGENTHART；《J.Biol.Chem.》；267(3)，1528-1533(1992))。在依诺肝素中几乎没有后者(参见实施例5的NMR)。

本发明的另一个方面是用于测定1，6-脱水基团的层析方法。首先，涉及使解聚和采用还原剂(例如NaBH₄)处理后得到的不同多糖分离。
阴离子交换层析(SAX)是一种最适合于这样复杂的混合物分离的方法。
可以使用装有Spherisorb SAX型固定相的柱进行分离，其固定相粒度为5μm，柱长度为25cm。可使用直径为1mm-4.6mm的任何柱。
使用的设备可以是能形成洗脱梯度的任何层析仪，有UV检测器，更优选地装有一组二极管，以便能够得到这些组分的UV谱并记录复杂的信号，从而得到在2个不同波长的吸收差，并能专门检测出乙酰基化低聚糖。为了能实现这类检测，最好使用直到200nm UV区都能透光的移动相。这就排除了通常使用的NaCl基移动相，这种移动相还有一个缺陷是需要进行钝化层析，以便能够耐氯化物腐蚀。这里使用的移动相优选地是高氯酸钠基的，然而也可以使用甲磺酸盐或磷酸盐基的。
分离的pH可以是2-6.5。优选采用pH约3。可以通过加盐进行控制，例如使用在pH＝3具有缓冲能力的磷酸盐优于高氯酸盐。
作为实例，在下面给出层析分离的标准条件：
溶剂A：2.5mM NaH₂PO₄，加H₃PO₄可调到pH 2.9，
溶剂B：1N NaClO₄-2.5mM NaH₂PO₄，加H₃PO₄可调到pH 3.0，
洗脱梯度如下：
T＝0min：％B＝3；T＝40min：％B＝60；T＝60min％B＝80。
因此，本发明再一个目的是如前面定义的采用阴离子交换层析进行分离的分析方法，其特征在于使用直到200nM UV都能透光的移动相。
更特别地讲，本发明还有一个目的是如前面定义的以高氯酸钠、甲磺酸盐或磷酸盐为基的移动相的分析方法。
另一个非常重要方面是检测方法。
为了提高UV检测的专一性，申请人研制了一种方法。由于未乙酰基化多糖在一定的pH有十分相似的UV谱，所以有可能取2个波长的吸收差作为信号，选择性地检测这些乙酰基化糖，使得未乙酰基化糖不产生吸收率。
在下述情况下，选择202nm和230nm进行检测并作为参比波长，优选记录202-230nm处的信号。这种选择当然取决于移动相的pH(要优化所述条件可能需要调整几个nm)。最适合于这种技术的检测器是AgilentTechnologies公司的DAD 1100检测器。在这种情况下，在234nm与在202-230nm进行双检测。下面的图说明了乙酰基化低聚糖的选择性检测原理，图中δ硫酸化二糖UV谱Is与δ硫酸化二糖UV谱Ia进行比较。

本发明还有一个目的是如前面定义的采用阴离子交换层析进行分离的分析方法，其特征在于这种检测方法能够选择性检测乙酰基化糖。
非常特别地讲，本发明还有一个目的是如前面定义的采用阴离子交换层析进行分离的分析方法，其特征在于选择2个波长的吸收差作为信号，选择性检测乙酰基化糖，对波长进行选择使未乙酰基化糖不产生吸收率。
上述4个1，6-脱水残留物的定量分析要求层析法系统对混合物中的所有其它组分具有足够的选择性。然而，与ΔIIa相比，2个二糖1和2(一般共洗脱的)的分辨率很差，尤其后一种呈2个端基异构体α和β形态时更是如此。
2个二糖1和2的同一性可以容易地得到证实，因为在室温下，在加入NaOH将ΔIIa水溶液的pH调节到13时，在几小时内它们就生成了。但是，如果采用双检测方法，这些乙酰基化低聚糖ΔIVa、ΔIIa、ΔIIIa、ΔIa、ΔIIa-IVs_glu和ΔIIa-IIs_glu是很容易鉴定的。
一方面，产生峰分裂的原因是由于存在端基异构体，并且当它们位于低聚糖链的端位时，在一定程度上产生了葡糖胺甘露糖胺差向异构作用，部分呈现ΔIIs、ΔIIIs和ΔIs。
为了能够定量分析二糖1和2，可通过NaBH₄的作用使用肝素酶解聚的低分子量肝素样品还原。

α端基异构体+β端基异构体
这种还原的好处在于通过打开末端低聚糖环可消除αβ端基异构现象。因为消除了端基异构现象，所以得到的层析图比较简单，尤其是ΔIia的还原降低了在柱中的保留时间，因此可以容易地测定二糖1和2。
下面图1和2描述的层析图实例清楚地说明了这些现象和这种方法的优点。
最后，本发明还有一个目的是通过实施解聚和还原方法所得到的新糖类衍生物，它们选自二糖1、二糖2、二糖3和三糖1。
附图说明
图1
在用NaBH₄还原前后，使用肝素酶解聚的依诺肝素的层析分离图(细黑信号：在234nmUV；粗黑信号：在202-234nmUV)
图2：
在用NaBH₄还原前后，使用肝素酶解聚的肝素的层析分离图(细黑信号：在234nmUV；粗黑信号：在202-234nmUV)。
具体实施方式
下面的实施例非限制性地说明了本发明。
实施例1：
将50μl 20mg/ml待测定的低分子量肝素溶液、含有2mM乙酸钙的200μl100mM乙酸/NaOH(pH 7.0)溶液和1mg/ml BSA与50μl3种肝素酶储存液混合，在室温下进行酶解聚反应48小时。
向临时制备的100mM乙酸钠中添加10μl 30g/1NaBH₄溶液，对60μl使用所述肝素酶的解聚产物进行还原反应。注意，肝素酶应该保存在-30℃下。所述肝素酶是在缓冲溶液中，它们的效价是0.5UI/ml(缓冲液组成：0.01摩尔/1KH₂PO₄pH 7水溶液，补充了2mg/ml胎牛血清(BSA))。
实施例2：
根据前面描述的方法所得到二糖3的NMR。
在D₂O中质子谱，400MHz，T＝298K，以ppm表示的δ：3.34(1H，dd，J＝7和2Hz，H2)，3.72(1H，t，J＝8Hz，H6)，3.90(1H，m，H3)，4.03(1H，s，H4)，4.20(1H，d，J＝8Hz，H6)，4.23(1H，t，J＝5Hz，H3′)，4.58(1H，m，H2′)，4.78(1H，m，H5)，5.50(1H，s，H1)，5.60(1H，dd，J＝6和1Hz，H1′)，6.03(1H，d，J＝5Hz，H4′)]。
实施例3
根据前面描述的方法所得到四糖1的NMR。
在D₂O中质子谱，400MHz，T＝298K，以ppm表示的δ：3.15(1H，s，H2)，3.25(1H，m，H2″)，3.60(1H，m，H3″)，3.70-4.70(14H，未拆分，H3/H4/H6，H2′/H3′/H4′/H5′，H4″/H5″/H6″，H2″′/H3″′)，4.75(1H，m，H5)，5.20-5.40(2H，m，H1′和H1″)，5.45(1H，m，H1″′)，5.56(1H，m，H1)，5.94(1H，d，J＝5Hz，H4)。
实施例4：
根据前面描述的方法所得到三糖1的NMR。
在D₂O中谱，600MHz，(以ppm表示的δ)：3.28(1H，m)，3.61(1H，t，7Hz)，3.79(1H，t，7Hz)，3.95(1H，d，6Hz)，4.00(1H，s)，4.20(1H，m)，4.28(2H，m)，4.32(1H，d，4Hz)，4.41(1H，s)，4.58(1H，s)，4.61(1H，s)，4.90(1H，宽s)，5.24(1H，s)，5.45(1H，s)，5.95(1H，s)。
实施例5：
ΔGlcA-Gal-Gal-Xyl-Ser的NMR
在D₂O中谱，500MHz(以ppm表示的δ)：3.30(1H，t，7Hz)，3.34(1H，t，8Hz)，3.55(1H，t，7Hz)，3.60(1H，t，7Hz)，3.63-3.85(10H，m)，3.91(2H，m)，3.96(1H，dd，7和2Hz)，4.02-4.10(3H，m)，4.12(1H，d，2Hz)，4.18(1H，m)，4.40(1H，d，6Hz)，4.46(1H，d，6Hz)，4.61(1H，d，6Hz)，5.29(1H，d，3Hz)，5.85(1H，d，3Hz)。
实施例6：定量分析原理
在本发明的方法中，广泛接受这样一个假设，混合物中含有的所有不饱和低聚糖都具有同样的摩尔吸收率，它等于5500摩尔^-1.1. cm^-1。
因此有可能测定低分子量肝素的解聚混合物中的所有组分的重量百分数。对于相应于峰7、8、13和19的4个1，6-脱水衍生物，得到下述重量百分数：



面积₇、面积₈、面积₁₃和面积₁₉分别相应于峰7、8、13和19的面积。这四种化合物的摩尔质量分别是443、443、545和1210。∑w_x·面积_x相应于层析图中各个峰的面积与相应产物的摩尔质量比。
如果Mw是所研究低分子量肝素的平均质量，则可以下述方式得到以1，6-脱水环为末端的低聚糖链的百分数：
所述组分的分子量如下：