一种建立兰州百合农杆菌介导高效转化体系的方法.pdf

本发明公开了一种建立兰州百合农杆菌介导高效转化体系的方法，以切取组培苗鳞片分化培养基上暗培养2天作为受体材料；将供体菌株接种到加有卡那霉素、链霉素和利福平的LB液体培养基上培养，收集菌液，离心，倒去上清，沉淀用液体MS溶解并稀释至浓度OD600为0.4～0.6加入液体MS中，放入受体材料进行侵染，把侵染过的鳞片放到滤纸上吸干，接种到含有20mg/LAS和200mg/L头孢霉素的分化培养基上暗培养3d，而后接种到含有2mg/L代表潮霉素的分化培养基上，26℃暗培养直至长出抗性芽；将抗性芽行进一步的筛选培养，待生长至4～5片叶子时，进行生根培养，而后进行移栽。为培育优良水稻品种开辟了新的途径。

1.  一种建立兰州百合农杆菌介导高效转化体系的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)切取组培苗鳞片在分化培养基上暗培养2天作为受体材料；
2)将供体菌株接种到加有卡那霉素、链霉素和利福平的LB液体培养基上培养，收集菌液，离心，倒去上清，沉淀用液体MS溶解并稀释至浓度OD600为0.4～0.6；
3)将步骤2)制备的菌液加入液体MS中，放入受体材料进行侵染，把侵染过的鳞片放到滤纸上吸干，接种到含有20mg/L AS和200mg/L头孢霉素的分化培养基上暗培养3d，而后接种到含有2mg/L代表潮霉素的分化培养基上，26℃暗培养直至长出抗性芽；
4)将抗性芽移植到继代培养基上进行进一步的筛选培养，待生长至4～5片叶子时，进行生根培养，而后进行移栽。

2.  根据权利要求1所述的建立兰州百合农杆菌介导高效转化体系的方法，其特征在于，所述的组培苗鳞片是按照以下步骤制备的：
洗去百合鳞茎表面泥土，剥去外层有病斑或机械损伤的鳞片，取中外层无病斑健壮的鳞片，用洗洁精浸泡清洗，然后在自来水下冲洗12h左右，灭菌前再用蒸馏水清洗3次，在超净台上用70％乙醇消毒40s，投入0.1％升汞溶液中消毒15min，无菌水冲洗5次，灭菌后的鳞片切成1.0～2.0cm×1.0～2.0cm方块，倒置接种于分化培养基上，在26℃、2000lx、16h每天、光照培养30～60天得组培苗鳞片。

3.  根据权利要求1所述的建立兰州百合农杆菌介导高效转化体系的方法，其特征在于，所述的兰州百合组培苗鳞片在26℃暗培养2天。

4.  根据权利要求1所述的建立兰州百合农杆菌介导高效转化体系的方法，其特征在于，所述的供体菌株是农杆菌EHA105。

5.  根据权利要求1所述的建立兰州百合农杆菌介导高效转化体系的方法，其特征在于，所述的液体LB培养基中加入卡那霉素50～150mg/L、链霉素30～70mg/L和利福平40～800mg/L。

6.  根据权利要求1所述的建立兰州百合农杆菌介导高效转化体系的方法，其特征在于，所述的供体菌株在液体培养基上培养条件为28℃，200rpm恒温摇床上24。

7.  根据权利要求1所述的建立兰州百合农杆菌介导高效转化体系的方法，其特征在于，所述的离心条件为5000rpm常温离心10分钟。

8.  根据权利要求1所述的建立兰州百合农杆菌介导高效转化体系的方法，其特征在于，在28℃，200rpm摇床上摇动20min进行侵染。

9.  根据权利要求1～6中任一项所述的建立兰州百合农杆菌介导高效转化体系的方法，其特征在于，在进行侵染时加入20mM的乙酰丁香酮。

10.  根据权利要求1～6任一项所述的建立兰州百合农杆菌介导高效转化体系的方法，其特征在于，所述的继代培养基中含有5mg/L的潮霉素和50mg/L的头孢霉素。

一种建立兰州百合农杆菌介导高效转化体系的方法
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种建立兰州百合农杆菌介导高效转化体系的方法。
背景技术
兰州百合(Lilium davidii var.unicolor)是百合科百合属川百合的一个变种，又称大王百合、天百合和平陆百合，是一种多年生鳞茎类草本植物。兰州百合的栽种始于清代同治年间，距今约130多年，由于独特的土壤条件和多年积累的栽培技术，其鳞茎硕大，颜色洁白，鳞片丰满白嫩，质地细腻，营养丰富，口味甜美而幽香；其花单生，大而美丽，香味浓郁，有很高的食用、药用、保健和观赏价值，它不仅是中国百合中的上品，而且是中国唯一的甜百合。我国著名的植物分类学家孔宪武教授曾评价：“兰州百合味极甜美，纤维很少，又毫无苦味，不但闻名全国，亦可称世界第一。”
近年来对兰州百合的研究主要集中在种植栽培、贮存保鲜、化学成分、细胞学、分子学、保健食品开发、杂交育种、组织培养、离体快繁等方面。百合已被国家卫生部确定为“既是食品又是药品”的植物之一，兰州百合的营养成分丰富，包括各种蛋白质、脂肪和维生素等。不仅在营养方面具有重要的价值，而且兰州百合还具有重要药用价值和观赏价值。
我国是百合属植物的故乡，观赏、食用或药用百合的栽培历史十分悠久，具备良好的种质资源基础。但目前我国的百合育种工作十分落后，现有的百合种质资源不仅没有得到充分利用，而且破坏、流失现象十分严重。百合通常采用分球、鳞茎等繁殖，易造成种性退化，品质下降，甚至凝聚病毒。在传统育种手段的基础上，采用现代生物技术已经广泛应用到兰州百合的育种工作中。
农杆菌介导的植物基因转化系统目前广泛应用于植物基因工程研究。根癌农杆菌中含Ti质粒，该质粒的部分DNA片断可整合到宿主细胞中，从而整合到植物的基因组中，农杆菌介导的转染方法同其它方法相比具有以下优点：转化效率高，转化效果好，可转移大片断DNA；转移的外源基因成为单拷贝；遗传稳定，并且多数符合孟德尔遗传定律；价格廉价。
但由于兰州百合属于单子叶植物，单子叶植物不是农杆菌的天然宿主，单子叶植物不能或很少能产生激活Ti质粒Vir区基因的信号分子，无明显的创伤反应，不能形成瘤状物，至今以百合鳞片为受体的农杆菌介导法转化体系仍停留在实验室研究阶段。
发明内容
针对上述现有技术中存在的问题与缺陷，本发明的目的在于提供一种建立兰州百合农杆菌介导高效转化体系的方法。该方法有效的克服现有的农杆菌介导技术难以应用于禾本科植物遗传转化的缺陷。
实现上述发明目的技术产方案是：一种建立兰州百合农杆菌介导高效转化体系的方法，具体包括如下步骤：
1)切取组培苗鳞片在分化培养基上暗培养2天作为受体材料；
2)将供体菌株接种到加有卡那霉素、链霉素和利福平的液体培养基上培养，收集菌液，离心，倒去上清，沉淀用液体MS溶解并稀释至浓度OD600为0.4～0.6；
3)将步骤2)制备的菌液加入液体MS中，放入受体材料进行侵染，把侵染过的鳞片放到滤纸上吸干，接种到含有20mg/L AS和200mg/L头孢霉素(cef)的分化培养基上暗培养3d，而后接种到含有2mg/L代表潮霉素(hyg)的分化培养上，26℃暗培养直至长出抗性芽；
4)将抗性芽移植到继代培养基上进行进一步的筛选培养，待生长至4～5片叶子时，进行生根培养，而后进行移栽。
所述的组培苗鳞片是按照以下步骤制备的：洗去百合鳞茎表面泥土，剥去外层有病斑或机械损伤的鳞片，取中外层无病斑健壮的鳞片，用洗洁精浸泡清洗，然后在自来水下冲洗12h左右，灭菌前再用蒸馏水清洗3次，在超净台上用70％乙醇消毒40s，投入0.1％升汞溶液中消毒15min，无菌水冲洗5次，灭菌后的鳞片切成1.0～2.0cm×1.0～2.0cm方块，倒置接种于分化培养基上，在26℃、2000lx、16h每天、光照培养30～60天得组培苗鳞片。
所述的兰州百合组培苗鳞片在26℃暗培养2天。
所述的供体菌株是农杆菌EHA105。
所述的液体LB培养基加入的卡那霉素50～150mg/L、链霉素30～70mg/L和利福平40～800mg/L。
所述的供体菌株在液体培养基上培养条件为28℃，200rpm恒温摇床上24。
所述的离心条件为：5000rpm常温离心10分钟。
所述的侵染条件为：28℃，200rpm摇床上摇动20min。
所述的侵染时还加入20mM的乙酰丁香酮(AS)。
所述的分化培养基为1/2MS+2.0mg/LBA+0.2mg/LNAA+30g/L蔗糖+6g/L琼脂。
所述的继代培养基为MS+1.0mg/LBA+0.2mg/LNAA+30g/L蔗糖+6g/L琼脂。
所述的液体培养基为LB液体培养基。
本发明兰州百合高效农杆菌介导遗传转化方法，通过优化农杆菌转化时所涉及到的各项影响条件，包括菌液浓度、侵染时间、侵染条件、共培养时间、抑菌素浓度等，提供了一套适合兰州百合的农杆菌介导转化体系。克服了现有农杆菌介导技术难以应用于禾本科植物遗传转化的缺陷，建立起一鳞片为受体材料的高效农杆菌转化体系。
与现有技术相比较，本发明的方法具有以下优点：
通过本发明获得转基因植株兰州百合可以明显提高Vc含量2～5倍，植株的抗逆性明显增强。
附图说明
图1为转基因植株兰州百合的抗性筛选。
图2为转基因植株GUS染色。
图3为转基因植株的DHAR基因的PCR检测。
图4为为转基因植株的hyg基因的PCR检测。
具体实施方式
下面结合发明人给的具体实施例和试验列对本发明的方法和使用效果做进一步阐明。
实施例1组培苗鳞片制备
洗去百合鳞茎表面泥土，剥去外层有病斑或机械损伤的鳞片，取中外层无病斑健壮的鳞片，用洗洁精浸泡清洗，然后在自来水下冲洗12h左右，灭菌前再用蒸馏水清洗3次，在超净台上用70％乙醇消毒40s，投入0.1％升汞溶液中消毒15min，无菌水冲洗5次，灭菌后的鳞片切成1.0～2.0cm×1.0～2.0cm方块，倒置接种于分化培养基上，在26℃、2000lx、16h每天、光照培养30～60天得组培苗鳞片。
实施例2
1)切取组培苗鳞片在分化培养基1/2MS+2.0mg/LBA+0.2mg/LNAA+30g/L蔗糖+6g/L琼脂上暗培养2天作为受体材料，培养条件为26℃；
2)将供体菌株农杆菌EHA105接种到加有卡那霉素50mg/L、链霉素30mg/L和利福平40mg/L中，28℃，200rpm恒温摇床上过夜，将菌液收集到10ml离心管中，5000rpm常温离心10分钟，倒去上清，沉淀用液体MS溶解并稀释，浓度OD600为0.4时进行侵染转化，同时加入20mM的乙酰丁香酮(AS)；
3)将预培养两天的鳞片放入盛放菌液的液体MS中，28℃，200rpm摇床上摇动20min，将侵染过的鳞片放到滤纸上吸干，而后接种到含有20mg/L AS和200mg/L头孢霉素(cef)的分化培养基MS+2.0mg/LBA+0.2mg/LNAA+30g/L蔗糖+6g/L琼脂上暗培养3d，而后接种到含有2mg/L潮霉素的分化培养上，26℃暗培养直至长出抗性芽；
4)将抗性芽移植含有5mg/L的潮霉素和50mg/L的cef的继代培养基上进行进一步的筛选培养，待生长至4-5片叶子时，进行生根培养，而后进行移栽。
实施例3
1)切取组培苗鳞片在分化培养基上暗培养2天作为受体材料，培养条件为26℃；
2)将供体菌株农杆菌EHA105接种到加有150mg/L、链霉素70mg/L和利福平800mg/L中，28℃，200rpm恒温摇床上过夜，将菌液收集到10ml离心管中，5000rpm常温离心10分钟，倒去上清，沉淀用液体MS溶解并稀释，浓度OD600为0.6时进行侵染转化，同时加入20mM的乙酰丁香酮；
3)将预培养两天的鳞片放入盛放菌液的液体MS中，28℃，200rpm摇床上摇动20min，将侵染过的鳞片放到滤纸上吸干，而后接种到含有20mg/L AS和200mg/L头孢霉素的分化培养基上暗培养3d，而后接种到含有2mg/L hyg的分化培养上，26℃暗培养直至长出抗性芽；
4)将抗性芽移植含有5mg/L的潮霉素和50mg/L的cef的继代培养基上进行进一步的筛选培养，待生长至4-5片叶子时，进行生根培养，而后进行移栽。
试验例1转基因植株兰州百合的抗性筛选
获得再生芽后，转移至含有hyg的分化培养基上，若是转基因植株在抗生素培养基上生长良好，若为非转基因植株，在抗生素培养基上死亡，如图1所示，图中所反应的内容是再生芽的抗性筛选。
试验例2转基因植株的GUS染色
将材料浸泡于GUS染色液(50mmol/L磷酸缓冲液pH 7.0，1mmol/LEDTA，0.05％Triton～100，1mmol/L铁氰化钾，1mmol/L亚铁氰化钾，甲醇20％，0.5mg/ml X～Gluc)，37℃染色12～24h后，用70～95％乙醇脱色。每个样本重复3次，用Olympus optics显微镜观察，结果如图2所示：左为非转基因植株，右为转基因植株。
试验例3  转基因植株DHAR基因的PCR检测
用于兰州百合遗传转化的基因含有DHAR基因，采用CTAB法提取叶片的DNA进行检测，扩增片断长度为500bp，如图3所示，图中1代表mark，2代表阳性对照，3代表阴性对照，4～6代表转基因植株。
25μL的反应体系包括：2.5μL 10×PCR Bufer，1.5μL 25mmol/L MgCl₂，2μL 2.5mmol/L dN TPs，1μL 10mmol/L DHARs引物，1μL 10mmol/LDHARa引物，0.25μL 5U/μL的Taq DNA聚合酶，2μL模板DNA，用灭菌双蒸水补齐至25μL。
PCR的反应条件为：1)94℃预变性5分钟后，2)94℃变性45秒，3)55℃退火45秒，4)72℃延伸1分，步骤2至4循环38次。5)最后72℃延伸10分钟。
DHAR检测引物：上游引物5’～CTAATGGCTCTCGAGGTCGCTG～3’
下游引物5’～AGGAGCGGTCTTCACGAAGG～3’
试验例4转基因植株潮霉素基因的PCR检测
用于兰州百合遗传转化的基因含有hyg基因，采用CTAB法提取叶片的DNA进行检测，扩增片断长度约为850bp。
25μL的反应体系包括：2.5μL 10×PCR Bufer，1.5μL 25mmol/L MgCl₂，2μL 2.5mmol/L dN TPs，1μL 10mmol/L DHARs引物，1μL 10mmol/LDHARa引物，0.25μL5U/μL的Taq DNA聚合酶，2μL模板DNA，用灭菌双蒸水补齐至25μL。
PCR的反应条件为：1)94℃预变性5分钟后，2)94℃变性45秒，3)60℃退火45秒，4)72℃延伸1分，步骤2至4循环35次。5)最后72℃延伸10分钟。
HYG检测引物：上游引物5’～GTCGACCTATTTCTTTGCCCTCGGAC～3’
下游引物5’～GGATCCCCTGACCTATTGCATCTCCC～3’
如图4所示，1代表mark，2代表阳性对照，3代表阴性对照，4～6代表转基因植株。