血竭素酶联免疫检测方法及应用 【技术领域】
本发明涉及小分子物质抗体及其制备方法与应用，特别是涉及血竭素抗体及其制备方法与应用。
背景技术
血竭素系常用中药血竭的主要有效成分之一，血竭系由麒麟竭树的果实鳞片所分泌的一种红色树脂，经加工而成。血竭素对金黄色葡萄球菌、包皮垢分歧杆菌和白色念珠菌均有抗菌活性。中医用于跌打损伤，瘀血作痛，产后瘀阻等。由于目前市场上所售的血竭质量参差不齐，有的混入其他树脂，所以急需发展一种能够快速有效的检测血竭质量的方法。目前常用的方法为紫外分光光度测定法和薄层层析法。由于酶联免疫测定技术具有高通量、快速及灵敏度高等特点，在中药材的品质鉴定等方面已经获得了广泛的应用，但血竭素的免疫检测方法还未见报道，所以建立一种血竭素的免疫检测方法具有非常重要的意义。
【发明内容】
本发明的目的是提供血竭素抗体及其制备方法与应用。
本发明所提供的血竭素抗体，是用血竭素抗原免疫动物，然后从被免疫动物的血清中分离得到的；所述血竭素抗原按如下过程制备：先将血竭素溶解在甲醇中，然后加入适量的对氨基苯甲酰肼，TLC跟踪血竭素反应完全，生成化合物1，然后将化合物1重氮化后与载体蛋白连接，得到血竭素抗原。
制备血竭素抗体的方法，是用血竭素抗原免疫动物，然后从被免疫动物的血清中分离得到血竭素抗体，其特征在于：所述血竭素抗原按如下过程制备：所述血竭素抗原按如下过程制备：先将血竭素溶解在甲醇中，然后加入适量的对氨基苯甲酰肼，TLC跟踪血竭素反应完全，生成化合物1，然后将化合物1重氮化后与载体蛋白连接，得到血竭素抗原。
为了使效果更好，载体蛋白需先在0-10℃条件下溶解于pH9-10的碳酸盐缓冲液中，常用的载体蛋白有牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA)、兰素蛋白(KLH)、卵清白蛋白(OVA)等。
血竭素抗原制备反应结束后，通常需要经过透析或过sephadex G-25柱以除去未联结的血竭素及有机溶剂，然后冷冻干燥以浓缩制备得到血竭素抗原。
应用所制备的血竭素抗原对实验动物经过基础免疫和加强免疫后，取样测定效价，当效价达到要求时，可以开始采血，分离出抗血清，即可以得到血竭素抗体。
本发明的另一个目的是提供血竭素抗体在鉴定中药材血竭真伪上的应用。
在应用血竭素抗体进行鉴定中药材血竭真伪时，其鉴定过程包括如下步骤：
(1)血竭和待测药材经95％的甲醇提取，提取液经氮气吹干后，加适量样品稀释液成样品液；
(2)应用血竭素抗体采用ELISA方法检测样品液；
(3)通过观察孔颜色，鉴别样品的真伪，颜色浅为真品，颜色深为假品。
步骤(2)中的ELISA方法用常规的间接法和直接法，其中，间接法可以按如下步骤进行操作：
(1)用血竭素包被抗原包被酶联板；
(2)向酶联板上同时加入血竭素样品、血竭素抗体，反应过后加入酶标二抗进行反应；
(3)加入OPD-H2O2溶液底物后终止反应。也可以根据上述原理，利用本发明的血竭素抗体制备各种检测血竭真伪的试剂盒，以便于现场快速检测。
血竭素是小分子物质，不具备免疫原性，不能直接刺激动物产生抗体，要想制备血竭素的抗体，就必须把血竭素与相应大分子载体蛋白偶联构建人工抗原，并用合成的人工抗原免疫动物产生特异性抗体。利用本发明的方法可以方便快捷地获得血竭素人工抗原，成本低，效果好，利用合成的血竭素免疫抗原通过免疫动物，可以快速高效地获得血竭素抗体。利用血竭素抗体鉴定中药材血竭的真伪，具有快速、灵敏的优点。
试验材料
1、材料和试剂
血竭素购于中国药品生物制品检定所；对氨基苯甲酰肼、BSA、OVA、弗氏完全和不完全佐剂均购于Sigma公司。其他常规药品和试剂均购于北京化学试剂公司。
2、仪器设备
96孔可拆酶标板 美国Costar公司
二氧化碳培养箱 芬兰Thermo公司
自动洗板机(Wellwash 4MK2) 芬兰Thermo公司
酶联免疫检测仪(Multiskan MK3) 芬兰Thermo公司
电热恒温培养箱 天津市中环实验电炉有限公司
3、缓冲液
(1)包被缓冲液：0.05M的碳酸盐缓冲液，pH 9.6；
(2)PBS：含0.9％NaCl的0.1M磷酸盐缓冲液，pH 7.5；
(3)PBST：含有0.1％(v/v)吐温-20的PBS；
(4)样品稀释液：含有0.5％(w/v)明胶的PBST；
(5)底物缓冲液：含0.01M的柠檬酸三钠和0.03M的Na2HPO4，pH 5.5；
(6)显色液：在10mL含有2mg/mL OPD的底物缓冲液中加入4μL的30％H2O2；
(7)终止缓冲液：2M的硫酸溶液。
【具体实施方式】
实施例1、血竭素抗原的合成(图1)
1、化合物1的合成
血竭素20mg，对氨基苯甲酰肼80mg，溶于95％甲醇，充氮气50℃加热反应24小时，TLC跟踪原料反应消失(氯仿∶甲醇∶氨水＝95∶5∶2)，PTLC初步分离纯化合成的半抗原，甲醇洗脱，旋转蒸干。
2、血竭素-BSA免疫原和血竭素-OVA包被原的合成
0.02mmol合成的化合物1溶于5ml的0.1mol/L的盐酸溶液中，滴加过量的1％亚硝酸钠溶液，4℃避光持续搅拌反应，(亚硝酸钠的加入量可用淀粉碘化钾试纸进行监控，当试纸变为蓝黑色，说明亚硝酸钠过量)，溶液变成蓝黑色后，继续反应15min，用PH9.0，0.2mol/L的硼酸缓冲液溶解20mgBSA或15mgOVA，边搅拌边加入重氮化的半抗原，调节PH至9.0左右，4℃搅拌反应过夜，PBS中透析3天。
实施例2、制备血竭素抗体
(1)取8-10周龄的Balb/C小白鼠为实验动物。
(2)实验免疫剂量基础免疫为0.1mg每只，加强免疫剂量为0.15mg每只，用无菌水稀释实施例1中得到的血竭素-BSA免疫抗原，无菌过滤器过滤后加入等体积弗氏完全佐剂，充分乳化，直到滴入水中不扩散。
(3)用乳化好的免疫抗原免疫小鼠，初免腹腔注射，加强免疫采用背部皮下多点注射，注射0.2-0.3ml。
(4)基础免疫后，采用不完全弗氏佐剂乳化免疫抗原，方法同(2)，每隔2周进行加强免疫，三免后开始，每次面以后7天从小鼠眼眶采血，测效价，待效价大于1∶10000后，采血，分离出抗血清，即得抗体。
实施例3、小鼠血清效价地检测
第五免后7天小鼠眼眶采血，室温静置1小时后，放于4℃冰箱静置过夜。5000rpm离心5min，收集血清，用间接非竞争ELISA检测血清效价(表1)。
(1)包被抗原：用包被缓冲液将血竭素-OVA倍比稀释成适当的倍数，每孔加入100μl，放入湿盒，于37℃温箱中包被3小时后，甩干孔内包被液，PBST洗涤5次。
(2)加入待测血清：用样品稀释液将血清按照500，1000，2000，4000，8000倍稀释后，每孔加入100ul，放入湿盒，于37℃温育30min后，PBST洗涤5次。
(3)加酶标二抗：用样品稀释液对酶标二抗做适当稀释后，每孔加入100ul，于37℃温育30min后，PBST洗涤5次。
(4)显色：20mgOPD溶解于10ml底物缓冲液，加入4ul双氧水，混匀后每孔加入100ul。
(5)终止反应：用2M的硫酸溶液终止显色反应。
(6)判定结果：血清效价定义为OD值为1时的小鼠血清稀释倍数。
表1小鼠血清效价检测结果
实施例4、血清特异性检测
用间接竞争ELISA(图2)对小鼠血清进行特异性检测，根据竞争抑制率的大小判定血清的特异性。
(1)包被：同实施例3
(2)竞争：抑制孔加入预先配置好的标准品50ul，空白孔加入50ul样品稀释液，将血清用样品稀释液按照500，1000，2000，4000倍稀释后，每孔加入50ul，于37℃温育30min后，PBST洗涤5次。
(3-5)同实施例3
(6)判定结果：根据竞争抑制率判定小鼠血清的特异性。竞争抑制率＝(阳性对照孔OD值-抑制孔OD值)/阳性对照孔OD值×100％。如果竞争抑制率大于10％即可初步判定血清具有特异性。(表2)(见图2)
表2血竭素小鼠的血清特异性检测结果
注：I为有血竭素时的OD值，C为没有血竭素时的OD值。
实施例5、标准曲线的建立
将血竭素标样按照100ug/ml，50ug/ml，25ug/ml，12.5ug/ml，6.25ug/ml，3.125ug/ml，1.5625ug/ml稀释成不同浓度，选定包被抗原1∶800，抗体1∶2000作为建立标准曲线的抗原抗体组合。所得结果经Origin7.0软件计算并作图(图3)，根据曲线确定抑制中浓度IC50为50-60ug/ml。
实施例6、中药材血竭真伪的鉴定
(1)将血竭和甘草1g于研钵中，研磨后，95％甲醇提取过夜，经氮气吹干后，加样品稀释液稀释。
(2)取血竭素-OVA抗原，用包被液按1∶800稀释，将96孔酶联板用蒸馏水洗涤后，每孔加入所配血竭素-OVA抗原稀释液100μl，于37℃保温3h；
(3)取小鼠抗血清，用样品稀释液1∶2000稀释，得抗血清稀释液；
(4)取出酶联板，弃去孔内液体，用洗涤液洗4次后甩干，加入样品液50μl，再加入50μl抗血清稀释液，对照加入100μl水，放37℃保温箱中保温30min；
(5)弃去孔内液体，用洗涤液洗4次后甩干后，每孔加入经1∶2000稀释的HRP-山羊抗小鼠IgG100μl，放入37℃保温箱中保温30min；
(6)酶联板用洗涤液洗涤4次甩干后，每孔加入底物OPD-H2O2溶液100μl，37℃保温箱中保温10min后用50μl 2M H2SO4终止反应。
结果显示，血竭提取液的孔与甘草粉提取液的孔颜色有明显不同，含有血竭素的颜色浅，不含有的颜色深，由此可鉴定血竭的真伪。
【附图说明】
图1：血竭素全抗原合成全过程示意图
图2：血竭素间接竞争ELISA检测方法操作步骤示意图
图3：基于血清建立的50％加样量icELISA标准曲线(B0和B分别为没有血竭素和有血竭素时的OD值)。
表2血竭素小鼠的血清特异性检测结果
注：I为有血竭素时的OD值，C为没有血竭素时的OD值。
实施例5、标准曲线的建立
将血竭素标样按照100ug/ml，50ug/ml，25ug/ml，12.5ug/ml，6.25ug/ml，3.125ug/ml，1.5625ug/ml稀释成不同浓度，选定包被抗原1∶800，抗体1∶2000作为建立标准曲线的抗原抗体组合。所得结果经Origin7.0软件计算并作图(图3)，根据曲线确定抑制中浓度IC50为50-60ug/ml。
图3基于血清建立的50％加样量icELISA标准曲线(B0和B分别为没有血竭素和有血竭素时的OD值)
实施例6、中药材血竭真伪的鉴定
(1)将血竭和甘草1g于研钵中，研磨后，95％甲醇提取过夜，经氮气吹干后，加样品稀释液稀释。
(2)取血竭素-OVA抗原，用包被液按1∶800稀释，将96孔酶联板用蒸馏水洗涤后，每孔加入所配血竭素-OVA抗原稀释液100μl，于37℃保温3h；
(3)取小鼠抗血清，用样品稀释液1∶2000稀释，得抗血清稀释液；
(4)取出酶联板，弃去孔内液体，用洗涤液洗4次后甩干，加入样品液50μl，再加入50μl抗血清稀释液，对照加入100μl水，放37℃保温箱中保温30min；
(5)弃去孔内液体，用洗涤液洗4次后甩干后，每孔加入经1∶2000稀释的HRP-山羊抗小鼠IgG100μl，放入37℃保温箱中保温30min；
(6)酶联板用洗涤液洗涤4次甩干后，每孔加入底物OPD-H2O2溶液100μl，37℃保温箱中保温10min后用50μl 2M H2SO4终止反应。
结果显示，血竭提取液的孔与甘草粉提取液的孔颜色有明显不同，含有血竭素的颜色浅，不含有的颜色深，由此可鉴定血竭的真伪。