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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201811115344.1 (22)申请日 2018.09.25 (71)申请人 深圳市宝迪生物工程有限公司 地址 518100 广东省深圳市宝安区西乡街 道桃花源科技创新园7号研发中心 (72)发明人 王亚力 沈珎宇 (74)专利代理机构 深圳灼华创睿专利代理事务 所(普通合伙) 44524 代理人 张良子 (51)Int.Cl. A61L 27/36(2006.01) A61L 27/38(2006.01) A61L 27/58(2006.01) C12N 5/071(20。
2、10.01) (54)发明名称 一种经血干细胞膜片的制备方法 (57)摘要 本发明提供一种经血干细胞膜片的制备方 法， 包括以下步骤： 制备适合干细胞的培养基； 进 行经血干细胞膜片制备工作， 与现有技术相比， 本发明具有如下的有益效果： 整体操作方法简 单， 可以提高局部经血干细胞浓度， 延长经血干 细胞作用时间。 权利要求书1页 说明书3页 CN 109276758 A 2019.01.29 CN 109276758 A 1.一种经血干细胞膜片的制备方法， 其特征在于： 包括以下步骤： 制备适合干细胞的培养基； 进行经血干细胞膜片制备工作。 2.根据权利要求1所述的一种经血干细胞膜片的制备。
3、方法， 其特征在于： 制备适合干细 胞的培养基的具体步骤为： 首先将培养皿放置在电热烤箱内物品然后加热到160以上， 并 保持90120分钟， 然后在一个容器中加入比预期培养基总体积少5的双蒸水， 在室温的 水中加入干粉培养基， 轻轻搅拌， 加NaHCO3到培养基中， 用双蒸水稀释到合适的体积， 搅拌 溶解， 通过缓慢搅拌加入NaOH 或HCL调节pH值， 由于pH值在过滤时会上升0.1到0.3， 因而调 节pH值使它比最终想要的pH值低0.2到0.3， 然后在培养基中加入血清， 所述血清为小牛血 清、 新牛血清或胎牛血清， 胎牛血清取自剖腹产的胎牛， 新牛血清取自出生24小时之内的新 生牛，。
4、 小牛血清取自出生1030天的小牛， 通过血清向培养基内的细胞提供氨基酸、 维生 素、 无机物、 脂类物质、 核酸衍生物。 3.根据权利要求1所述的一种经血干细胞膜片的制备方法， 其特征在于： 进行经血干细 胞膜片制备工作的具体步骤为： 取经过稳定的经血， 作离心分离1530分钟， 每分钟转速为 25003 000转， 取得固形物， 去除血浆， 用水使固形物沉渣溶解， 取白膜层， 分别置于50ml 离心管内， 加生理盐水混匀， 将白细胞悬液离心， 弃上清液， 沉淀用生理盐水清洗三遍， 取培 养基将细胞沉淀， 然后将最终制备的培养基放置在消毒后的培养皿中， 放置于培养箱中培 养， 待细胞生长旺盛。
5、以后， 再换成无血清培养液， 细胞转入无血清培养基培养要有一个适应 过程， 要逐步降低血清浓度， 从10%减少到5%， 3%， 1%， 直至无血清培养， 在降低过程中要观察 细胞形态是否发生变化， 是否有部分细胞死亡， 存活细胞是否还保持原有的功能和生物学 特性， 细胞转入无血清培养之前， 要留有种子细胞， 种子细胞按常规培养于含血清的培养基 中， 以保证细胞的特性不发生变化， 待细胞融合度达到要求后， 在新的培养皿中进行传代培 养， 培养至3-6代时， 进行经血干细胞膜片制备。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 109276758 A 2 一种经血干细胞膜片的制备方法 技术领域 00。
6、01 本发明是一种经血干细胞膜片的制备方法， 属于生物技术领域。 背景技术 0002 经血干细胞是来源于女性经血中的干细胞， 具有活性高、 分泌因子能力强等特点。 经血干细胞膜片利用自身经血干细胞分泌的细胞外基质， 完整的保留细胞外基质和细胞间 连接， 生物相容性好， 而且干细胞活性和增殖能力增强， 经血干细胞作为治疗严重子宫内膜 损伤的活性成分， 具有获取方便的优点， 其可以补充局部干细胞数量， 并分泌生长因子改善 局部微环境及免疫调节等作用。 经血干细胞分泌因子能力更强， 而且分泌的因子更符合子 宫内膜修复的需要。 经血干细胞自身分泌的细胞外基质支架具有良好的生物相容性、 可降 解性及安全。
7、性。 为经血干细胞提供支持位点， 提高局部经血干细胞浓度， 延长经血干细胞作 用时间。 0003 中国专利CN 108261566 A提出了一种经血干细胞膜片的制备方法， 但是其操作繁 琐， 不易推广。 发明内容 0004 针对现有技术存在的不足， 本发明目的是提供一种经血干细胞膜片的制备方法， 以解决上述背景技术中提出的问题。 0005 为了实现上述目的， 本发明是通过如下的技术方案来实现： 一种经血干细胞膜片 的制备方法， 包括以下步骤： 制备适合干细胞的培养基； 进行经血干细胞膜片制备工作。 0006 进一步地， 制备适合干细胞的培养基的具体步骤为： 首先将培养皿放置在电热烤 箱内物品然。
8、后加热到160以上， 并保持90120分钟， 然后在一个容器中加入比预期培养 基总体积少5的双蒸水， 在室温的水中加入干粉培养基， 轻轻搅拌， 加NaHCO3到培养基中， 用双蒸水稀释到合适的体积， 搅拌溶解， 通过缓慢搅拌加入NaOH 或HCL调节pH值， 由于pH值 在过滤时会上升0.1到0.3， 因而调节pH值使它比最终想要的pH值低0.2到0.3， 然后在培养 基中加入血清， 所述血清为小牛血清、 新牛血清或胎牛血清， 胎牛血清取自剖腹产的胎牛， 新牛血清取自出生24小时之内的新生牛， 小牛血清取自出生1030天的小牛， 通过血清向 培养基内的细胞提供氨基酸、 维生素、 无机物、 脂类。
9、物质、 核酸衍生物。 0007 进一步地， 进行经血干细胞膜片制备工作的具体步骤为： 取经过稳定的经血， 作离 心分离1530分钟， 每分钟转速为25003 000转， 取得固形物， 去除血浆， 用水使固形物沉 渣溶解， 取白膜层， 分别置于50ml离心管内， 加生理盐水混匀， 将白细胞悬液离心， 弃上清 液， 沉淀用生理盐水清洗三遍， 取培养基将细胞沉淀， 然后将最终制备的培养基放置在消毒 后的培养皿中， 放置于培养箱中培养， 待细胞生长旺盛以后， 再换成无血清培养液， 细胞转 入无血清培养基培养要有一个适应过程， 要逐步降低血清浓度， 从10%减少到5%， 3%， 1%， 直 说 明 书 。
10、1/3 页 3 CN 109276758 A 3 至无血清培养， 在降低过程中要观察细胞形态是否发生变化， 是否有部分细胞死亡， 存活细 胞是否还保持原有的功能和生物学特性， 细胞转入无血清培养之前， 要留有种子细胞， 种子 细胞按常规培养于含血清的培养基中， 以保证细胞的特性不发生变化， 待细胞融合度达到 要求后， 在新的培养皿中进行传代培养， 培养至3-6代时， 进行经血干细胞膜片制备。 0008 本发明的有益效果： 本发明的一种经血干细胞膜片的制备方法， 整体操作方法简 单， 可以提高局部经血干细胞浓度， 延长经血干细胞作用时间。 具体实施方式 0009 为使本发明实现的技术手段、 创作。
11、特征、 达成目的与功效易于明白了解， 下面结合 具体实施方式， 进一步阐述本发明。 0010 本发明提供一种技术方案： 一种经血干细胞膜片的制备方法， 包括以下步骤： 制备适合干细胞的培养基， 现代生物技术均通过细胞作为载体来进行， 无论是基因治 疗、 干细胞、 克隆技术都在细胞内进行的。 细胞的生长需要一定的营养环境， 用于维持细胞 生长的营养基质称为培养基， 即指所有用于各种目的的体外培养、 保存细胞用的物质， 就其 本意上讲为人工模拟体内生长的营养环境， 使细胞在此环境中有生长和繁殖的能力。 它是 提供细胞营养和促进细胞生长增殖的物质基础。 细胞培养基其组成成分主要有： 水、 氨基 酸、。
12、 维生素、 碳水化合物、 无机离子及其他一些入核酸降解物、 激素等， 制备适合干细胞的培 养基是实验的关键； 进行经血干细胞膜片制备工作。 0011 制备适合干细胞的培养基的具体步骤为： 首先将培养皿放置在电热烤箱内物品然 后加热到160以上， 并保持90120分钟， 然后在一个容器中加入比预期培养基总体积少 5的双蒸水， 在室温的水中加入干粉培养基， 轻轻搅拌， 加NaHCO3到培养基中， 用双蒸水稀 释到合适的体积， 搅拌溶解， 通过缓慢搅拌加入NaOH 或HCL调节pH值， 由于pH值在过滤时会 上升0.1到0.3， 因而调节pH值使它比最终想要的pH值低0.2到0.3， 然后在培养基中。
13、加入血 清， 所述血清为小牛血清、 新牛血清或胎牛血清， 胎牛血清取自剖腹产的胎牛， 新牛血清取 自出生24小时之内的新生牛， 小牛血清取自出生1030天的小牛， 通过血清向培养基内的 细胞提供氨基酸、 维生素、 无机物、 脂类物质、 核酸衍生物。 0012 进行经血干细胞膜片制备工作的具体步骤为： 取经过稳定的经血， 作离心分离15 30分钟， 每分钟转速为25003 000转， 取得固形物， 去除血浆， 用水使固形物沉渣溶解， 取白膜层， 分别置于50ml离心管内， 加生理盐水混匀， 将白细胞悬液离心， 弃上清液， 沉淀用 生理盐水清洗三遍， 取培养基将细胞沉淀， 然后将最终制备的培养基放。
14、置在消毒后的培养 皿中， 放置于培养箱中培养， 待细胞生长旺盛以后， 再换成无血清培养液， 细胞转入无血清 培养基培养要有一个适应过程， 要逐步降低血清浓度， 从10%减少到5%， 3%， 1%， 直至无血清 培养， 在降低过程中要观察细胞形态是否发生变化， 是否有部分细胞死亡， 存活细胞是否还 保持原有的功能和生物学特性， 细胞转入无血清培养之前， 要留有种子细胞， 种子细胞按常 规培养于含血清的培养基中， 以保证细胞的特性不发生变化， 待细胞融合度达到要求后， 在 新的培养皿中进行传代培养， 培养至3-6代时， 进行经血干细胞膜片制备。 0013 以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征。
15、和本发明的优点,对于本领域技 术人员而言， 显然本发明不限于上述示范性实施例的细节， 而且在不背离本发明的精神或 说 明 书 2/3 页 4 CN 109276758 A 4 基本特征的情况下， 能够以其他的具体形式实现本发明。 因此， 无论从哪一点来看， 均应将 实施例看作是示范性的， 而且是非限制性的， 本发明的范围由所附权利要求而不是上述说 明限定， 因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明 内。 0014 此外， 应当理解， 虽然本说明书按照实施方式加以描述， 但并非每个实施方式仅包 含一个独立的技术方案， 说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见， 本领域技术人员应当 将说明书作为一个整体， 各实施例中的技术方案也可以经适当组合， 形成本领域技术人员 可以理解的其他实施方式。 说 明 书 3/3 页 5 CN 109276758 A 5 。