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1、(10)申请公布号 CN 102671242 A (43)申请公布日 2012.09.19 CN 102671242 A *CN102671242A* (21)申请号 201210165409.X (22)申请日 2012.05.24 A61L 27/36(2006.01) (71)申请人 东华大学 地址 201620 上海市松江区松江新城人民北 路 2999 号 (72)发明人 莫秀梅 董教明 李雨 (74)专利代理机构 上海泰能知识产权代理事务 所 31233 代理人 黄志达 谢文凯 (54) 发明名称 一种脱细胞心包材料的制备方法 (57) 摘要 本发明涉及一种脱细胞心包材料的制备方 法。
2、， 包括 ：（1） 取健康成年动物的心脏， 割取心包 膜， 然后反复冲洗所得心包膜， 在无菌条件下剥离 外周脂肪， 取无损伤、 厚度均匀的前壁部分修剪为 片状， 充分漂洗后得到处理后的包心组织 ；（2） 将 上述处理后的心包组织加入到含有烷基糖苷 APG 的溶液中， 然后通过低渗处理或高渗处理， 再经过 核酶处理， 最后清洗即可。本发明的制备方法简 单， 原料来源广泛， 成本低， 便于批量生产， 所用的 表面活性剂烷基糖苷无毒无害， 且能彻底脱除存 在于组织表面和内部的细胞及细胞碎片 ； 本发明 得到的脱细胞基质的免疫原性大幅降低且细胞毒 性低， 生物相容性好， 具有较好的力学性能和生物 学特。
3、性， 是一种良好的组织工程支架材料。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 5 页 附图 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 5 页 附图 3 页 1/1 页 2 1. 一种脱细胞心包材料的制备方法， 包括 ： （1） 取健康成年动物的心脏， 割取心包膜， 热缺血时间小于 1 小时 ； 然后在 0-37下用 无菌的生理盐水或 pH 值为 6.8-8.6 的磷酸盐缓冲液反复冲洗所得心包膜， 在无菌条件下 剥离外周脂肪， 取无损伤、 厚度均匀的前壁部分修剪为片状， 用无菌的生理盐水或 pH 值为 6.8-8.6 的磷酸盐缓冲。
4、液充分漂洗， 得到处理后的包心组织 ； （2） 将上述处理后的心包组织加入到含有烷基糖苷 APG 的溶液中， 然后通过低渗处理 或高渗处理， 再经过核酶处理， 最后清洗即可。 2.根据权利要求1所述的一种脱细胞心包材料的制备方法， 其特征在于 ： 步骤 （1） 中所 述的成年动物为猪或牛。 3.根据权利要求1所述的一种脱细胞心包材料的制备方法， 其特征在于 ： 步骤 （1） 所述 的片状的尺寸为 6cm8cm。 4.根据权利要求1所述的一种脱细胞心包材料的制备方法， 其特征在于 ： 步骤 （1） 得到 的处理后的包心组织于 4下保存在含双抗溶液的无菌的生理盐水中。 5. 根据权利要求 4 所述。
5、的一种脱细胞心包材料的制备方法， 其特征在于 ： 所述的双 抗溶液为 100 倍工作浓度的青霉素和硫酸链霉素溶液， 其中青霉素的工作浓度范围为 50-5000U/ml， 硫酸链霉素的工作浓度范围为 1-100mg/ml。 6.根据权利要求1所述的一种脱细胞心包材料的制备方法， 其特征在于 ： 步骤 （2） 中所 述的含有烷基糖苷 APG 的溶液中 APG 的体积浓度小于 50% ； 所述的烷基糖苷为 0810、 0814、 1214、 0816、 1216、 1618 中的一种或几种。 7. 根据权利要求 1 所述的一种脱细胞心包材料的制备方法， 其特征在于 ： 步骤 （2） 中 所述的低渗处。
6、理为采用浓度为 0.01M 且 pH 值为 6.8-8.6 的无菌的 Tris-HCI 缓冲液， 在 1 -25中振荡处理 1-96 小时， 振荡速率为 80-360rpm ； 所述的高渗处理为采用浓度为 0.05M 且 pH 值为 6.8-8.6 的无菌的 Tris-HCI 缓冲液， 在 1 -25中振荡处理 1-96 小时， 振荡速率为 80-360rpm。 8.根据权利要求1所述的一种脱细胞心包材料的制备方法， 其特征在于 ： 步骤 （2） 中所 述的核酶处理为在37下， 在含有100-10000u/ml的脱氧核糖核酸酶、 100-10000u/ml核糖 核酸酶、 0.15M NaCl、。
7、 1-5mM MgCl2的无菌的 pH 值 6.8-8.6 为 0.05M Tris-HCl 缓冲液中， 于 60-360rpm 转速下振荡处理 6-72 小时 ； 其中所述的双抗为青霉素和硫酸链霉素。 9.根据权利要求1所述的一种脱细胞心包材料的制备方法， 其特征在于 ： 步骤 （2） 中所 述的清洗是指用无菌的生理盐水或 pH 值为 6.8-8.6 的磷酸盐缓冲液在 1 -25条件下进 行清洗， 清洗时间为 6-48 小时。 10. 根据权利要求 9 所述的一种脱细胞心包材料的制备方法， 其特征在于 ： 所述的无菌 的生理盐水或 pH 值为 6.8-8.6 的磷酸盐缓冲液中含有抗生素。 权。
8、 利 要 求 书 CN 102671242 A 2 1/5 页 3 一种脱细胞心包材料的制备方法 技术领域 0001 本发明属于心包材料的制备领域， 特别涉及一种脱细胞心包材料的制备方法。 背景技术 0002 组织工程研究是制造人体器官和组织的科学， 由于其广阔的应用前景和逐年以几 何级数递增的产业效益， 各国政府和产业界都投入巨资进行研究和产业建设。世界每年的 研究经费都在几十亿美元以上。组织工程研究包括两个主要方面 ： 一方面是用来构建成器 官和组织形态的支架 ； 另一方面是种植在支架上可以生长并发挥生理作用的细胞。而对于 组织工程支架， 它必须具备两个特点 ：（1） 对细胞具有良好的亲和。
9、性 ；（2） 对人体无毒害、 无 免疫反应， 可在人体内降解。 0003 细胞外基质 （Extracellular matrix， ECM） 是各种组织器官的主要组成成分， 构成 了各种组织器官的三维空间结构和营养物质的储存， 其三维结构与体内细胞生长的天然环 境接近， 不仅可以起着支架材料的作用， 而且包含的多种生长因子在组织修复和重建中有 重要促进作用， 即使经过脱细胞处理仍有活性， 是细胞生长的理想环境， 这是其他人工聚合 物 （如胶原、 壳聚糖、 聚乳酸和聚羟基乙酸等） 所不能比拟的。心包是包裹心和出入心大血 管根部的纤维浆囊膜， 可分为纤维层、 浆膜层和外结缔组织层， 主要由细胞和 。
10、ECM 组成， 其 中的细胞成分作为抗原被宿主识别后会引发炎症或免疫排斥反应， 需要通过脱细胞处理来 去除抗原物质， ECM 由、 型纤维胶原蛋白构成， 含有少量的弹性纤维、 氨基聚糖和糖蛋白 等， 其组分在不同物种间通常是受保护的而且耐受性良好， 是一种理想的组织工程生物支 架材料。 0004 目前脱细胞处理方法主要包括物理法、 化学法和酶处理法。物理的处理方法有很 多， 主要是通过物理的作用如冻融、 液体高压、 超声波和电击等脱除细胞， 但物理方法对 ECM 的破坏作用较大。化学方法就是使用一些特定的化学试剂如酸、 碱和去污剂等破碎细胞达 到去除细胞的目的， 但化学试剂的残留会对机体产生毒。
11、害作用。酶处理方法主要是指用酶 试剂来裂解细胞， 例如脱细胞方法中通常会用到胰蛋白酶， 但胰蛋白酶对 ECM 有降解的作 用。且这些脱细胞方法过程繁琐， 处理时间长， 不利于批量生产。 发明内容 0005 本发明所要解决的技术问题是提供一种脱细胞心包材料的制备方法， 该方法简 单， 成本低， 彻底脱除存在于组织表面和内部的细胞及细胞碎片， 制备出具有较好的力学性 能和生物学特性的生物支架材料。 0006 本发明的一种脱细胞心包材料的制备方法， 包括 ： 0007 （1） 前置处理 ： 取健康成年动物的心脏， 割取心包膜， 热缺血时间小于 1 小时 ； 然后 在0-37下用无菌的生理盐水或pH值。
12、为6.8-8.6的磷酸盐缓冲液反复冲洗所得心包膜， 以 去除血凝块后， 在无菌条件下剥离外周脂肪， 取无损伤、 厚度均匀的前壁部分修剪为片状， 用无菌的生理盐水或 pH 值为 6.8-8.6 的磷酸盐缓冲液充分漂洗， 得到处理后的包心组织 ； 说 明 书 CN 102671242 A 3 2/5 页 4 0008 （2） 脱细胞处理及清洗 ： 将上述处理后的包心组织加入到含有烷基糖苷 APG 的溶 液中， 然后通过低渗处理或高渗处理， 破坏细胞膜结构和抽提细胞膜的脂质和膜蛋白 ； 再经 过核酶处理， 以降解细胞中各类 DNA 和 / 或 RNA 成分， 最后清洗即可。 0009 步骤 （1） 。
13、中所述的成年动物为猪或牛。 0010 步骤 （1） 所述的片状的尺寸为 6cm8cm。 0011 步骤 （1） 得到的处理后的包心组织于 4下保存在含双抗溶液的无菌的生理盐水 中。 0012 上述的双抗溶液为 100 倍工作浓度的青霉素和硫酸链霉素溶液 （配制的双抗溶 液为 100 倍的浓缩液， 实际工作浓度为稀释 100 倍后的浓度， 青霉素的工作浓度范围为 50-5000U/ml， 硫酸链霉素的工作浓度范围为 1-100mg/ml） 。 0013 步骤 （2） 中所述的含有烷基糖苷 APG 的溶液中 APG 的体积浓度小于 50%。 0014 上述的烷基糖苷 （也称为烷基葡萄糖苷、 烷基多。
14、糖甘） 通常为50%含量的水溶液， 有 0810、 0814、 1214、 0816、 1216、 1618 等型号， 可以是烷基糖苷系列中的任一种或一种以上。 0015 步骤 （2）中所述的低渗处理为采用浓度为 0.01M 且 pH 值为 6.8-8.6 的无菌的 Tris-HCI 缓冲液， 在 1 -25中振荡处理 1-96 小时， 振荡速率为 80-360rpm。 0016 步骤 （2）中所述的高渗处理为采用浓度为 0.05M 且 pH 值为 6.8-8.6 的无菌的 Tris-HCI 缓冲液， 在 1 -25中振荡处理 1-96 小时， 振荡速率为 80-360rpm。 0017 步骤。
15、 （2） 中所述的核酶处理为在 37下， 在含有 100-10000u/ml 的脱氧核糖核酸 酶 （DNase） 、 100-10000u/ml 核糖核酸酶 （RNase） 、 0.15M NaCl、 1-5mM MgCl2的无菌的 0.05M Tris-HCl缓冲液 （pH 6.8-8.6） 中， 于60-360rpm转速下振荡处理6-72小时 ； 其中所述的双 抗为青霉素和硫酸链霉素。 0018 步骤 （2） 中所述的清洗是指用无菌的生理盐水或 pH 值为 6.8-8.6 的磷酸盐缓冲 液在 1 -25条件下对所得脱细胞基质进行清洗， 清洗时间为 6-48 小时。 0019 上述的无菌的生。
16、理盐水或 pH 值为 6.8-8.6 的磷酸盐缓冲液中含有抗生素。 0020 经过一下多项实验证实， 本发明得到的脱细胞心包材料效果好， 达到了发明的目 的 ： 0021 1. 残留细胞 ： 脱细胞猪心包经常规苏木素一伊红染色， 证实无细胞结构存在。 （图 2） 0022 2. 基质纤维结构 ： 脱细胞猪心包经 Weigert 染色， 可观察到经本发明的脱细胞方 法处理后， 猪心包组织中的胶原纤维排列整齐， 无明显断裂， 仍呈波浪状平行排列， 结构紧 凑， 弹性纤维结构清晰。 （图 4） 0023 3. 脱细胞基质 DNA 含量的测定 ： 经 DNA 检测试剂盒测得未脱细胞的猪心包 DNA 含。
17、量是 607.3447.26ng/mg 干重组织， 经过本发明的脱细胞处理后的 DNA 含量为 8.241.31ng/mg 干重组织， 统计学分析有显著差异， 证实本发明的脱细胞方法能显著降低 组织核酸含量， 进一步说明该方法能完全去除细胞。 0024 4. 脱细胞基质含水量的测定 ： 新鲜猪心包组织的含水量是 77.750.57%， 经脱细 胞处理后的猪心包组织的含水量是 83.981.64%， 统计学处理无显著差异。 0025 5. 胶原蛋白含量测定 ： 由测得羟脯氨酸换算得未脱细胞的猪心包组织的胶原蛋 白含量是 48.341.01%， 经脱细胞处理的猪心包组织的胶原蛋白含量是 47.60。
18、.67%， 统 说 明 书 CN 102671242 A 4 3/5 页 5 计学处理无显著差异。 0026 6. 弹性蛋白含量测定 ： 由猪 a- 弹性蛋白试剂盒测定的未脱细胞的猪心包组织 的弹性蛋白含量是 0.2330.0128g/g， 经脱细胞处理的猪心包组织的弹性蛋白含量是 0.1290.0132g/g， 统计学处理无显著差异。 0027 7. 力学性能检测 ：（1） 拉伸强度的测定 ： 在万能材料试验机上测得基质材料的 拉伸强度， 新鲜猪心包的最大拉伸强度为 19.921.94MPa， 经脱细胞处理的猪心包的最 大拉伸强度为 15.90.81MPa， 统计学处理无显著差异。 （2） 。
19、断裂伸长率的测定 ： 在万能 材料试验机上测得基质材料的断裂伸长率， 新鲜猪心包的断裂伸长率为 65.543.96%， 经脱细胞处理的猪心包的断裂伸长率为 76.481.23%， 统计学处理有显著差异。 （3） 弹 性模量的测定 ： 在万能材料试验机上测得基质材料的弹性模量， 新鲜猪心包的弹性模量为 77.174.77MPa， 经脱细胞处理的猪心包的弹性模量为 73.563.8MPa， 统计学处理无显著 差异。由此证实本发明的脱细胞方法对基质的力学性能影响较小， 能够保持支架材料的机 械性能。 0028 8. 体外细胞毒性检测 ： 根据浸提液和 MTT 的方法测得未脱细胞的猪心包组织的 相对增。
20、值率是 97.234.5%， 细胞毒性级别为 1 级， 经培养后加入染料在倒置显微镜下观察 成纤维细胞生长状况， 如图 5 所示， 细胞生长良好， 无细胞毒性 ； 经脱细胞处理的猪心包组 织的相对增值率是 97.033.45%， 细胞毒性级别为 1 级， 统计学处理无显著差异， 经培养后 加入染料在倒置显微镜下观察成纤维细胞生长状况， 如图 6 所示， 细胞生长良好， 无细胞毒 性。由此可证实经本发明的脱细胞方法对支架材料无明显毒性。 0029 本发明选用烷基糖苷对所用组织器官进行脱细胞处理， 其优点在于， 烷基糖苷是 由可再生资源天然脂肪醇和葡萄糖合成的， 是一种性能较全面的新型非离子表面活。
21、性剂， 且易于生物降解不会造成对环境的污染， 具有无毒易降解的特点， 对人体无害。性能温和， 对细胞外基质的超微结构和功能蛋白几乎没有损伤。为进一步增强烷基糖苷脱细胞效果， 可以联合物理方法共同处理待用的组织器官。 本发明中主要采用物理法中的低渗和高渗溶 液浸泡， 振荡和调节温度的方式， 增加烷基糖苷的脱细胞效果。 0030 本发明首先对异种生物组织进行前置处理， 然后通过含有烷基糖苷的低渗和高渗 的进行脱细胞， 再以核酸酶降解细胞中的核酸， 最后用等渗溶液清洗。 0031 本发明使用的烷基糖苷 （alkyl polyglucoside， APG） 是一种新型无毒无刺激可生 物降解且降解产物无。
22、毒的试剂， 脱细胞方法简单， 成本低， 克服传统上化学毒性试剂残留等 问题， 在生物支架材料的制备中有重要的应用意义。 0032 有益效果 ： 0033 （1） 本发明的制备方法简单， 原料来源广泛， 成本低， 便于批量生产， 所用的表面活 性剂烷基糖苷无毒无害， 且能彻底脱除存在于组织表面和内部的细胞及细胞碎片 ； 0034 （2） 本发明得到的脱细胞基质的免疫原性大幅降低且细胞毒性低， 生物相容性好， 具有较好的力学性能和生物学特性， 是一种良好的组织工程支架材料。 附图说明 0035 图 1 为含有细胞的新鲜猪心包组织的显微镜照片 （HEx200） ； 0036 图 2 为经脱细胞处理后。
23、的猪心包组织的显微镜照片 （HEx200） ； 说 明 书 CN 102671242 A 5 4/5 页 6 0037 图 3 为新鲜猪心包组织的显微镜照片 （Weigert x400） ； 0038 图 4 为经脱细胞处理后的猪心包组织的显微镜照片 （Weigert x400） ； 0039 图 5 为新鲜猪心包组织的细胞毒性实验倒置显微镜照片 （200x） ； 0040 图 6 为经脱细胞处理后的猪心包组织的细胞毒性实验倒置显微镜照片 （200x） 。 具体实施方式 0041 下面结合具体实施例， 进一步阐述本发明。 应理解， 这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。 此外应。
24、理解， 在阅读了本发明讲授的内容之后， 本领域技术人 员可以对本发明作各种改动或修改， 这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定 的范围。 0042 实施例 1 0043 一种制备细胞外基质支架材料的脱细胞方法 ： 0044 （1） 前置处理 ： 猪心包取自当地屠宰厂， 健康成年猪宰杀后取出心脏， 割取心包 膜 , 热缺血时间小于 1 小时。磷酸缓冲液 (PBS)（pH 值为 7.3） 反复冲洗去除血凝块后置 于保存液中， 带回实验室， 无菌条件下剔除外周脂肪， 取无损伤、 厚度均匀的前壁部分修剪 为 6cm8cm 的片状， PBS 溶液 （pH 值为 7.3） 充分漂洗， 4保存含抗生。
25、素的无菌的 PBS 溶液 中。 0045 （2）猪心包的脱细胞处理 ： 将 4 片 6cm8cm 的心包分别放入 4 瓶 1% 烷基糖苷 （APG0810） 的含双抗的0.01M Tris-HCl缓冲溶液中进行振荡消化24h， 4， 150rpm/min。 之 后在无菌的 PBS （pH7.30） 进行清洗， 清洗完后依次将心包放在核酸消化溶液中 37振荡消 化24h。 核酸消化溶液为 ： 2.0KU/ml DNase 、 7.0KU/ml RNase、 0.15M NaCl、 5mMMgCl2 6H2O 和 1% 双抗的无菌的 0.05M Tris-HCl 缓冲液 （pH7.60） 。 00。
26、46 （3）清洗 ： 在无菌的含双抗的 PBS 缓冲液 （pH7.30）进行振荡清洗 24h， 转速为 150rpm， 清洗完后依次将心包在 4保存含双抗的无菌的 PBS 溶液中。 0047 实施例 2 0048 按上述前处理猪心包组织后， 将 4 片 6cm8cm 的心包分别放入 4 瓶 2% 烷基糖苷 （APG0810） 的含双抗的0.01M Tris-HCl缓冲溶液中进行振荡消化16h， 4， 150rpm/min。 之 后在无菌的 PBS （pH7.30） 进行清洗， 清洗完后依次将心包放在核酸消化溶液中 37振荡消 化24h。 核酸消化溶液为 ： 2.0KU/ml DNase 、 7。
27、.0KU/ml RNase、 0.15M NaCl、 5mMMgCl2 6H2O 和 1% 双抗的无菌的 0.05M Tris-HCl 缓冲液 （pH7.60） 。在无菌的含双抗的 PBS 缓冲液 （pH7.30） 进行振荡清洗 24h， 转速为 150rpm， 清洗完后依次将心包在 4保存含双抗的无菌 的 PBS 溶液中。 0049 实施例 3 0050 按实施例 1 方法制取猪心包组织后， 将 4 片 6cm8cm 的心包分别放入 4 瓶 1% （v/ v） 烷基糖苷 （APG1214） 的含双抗的 0.01M Tris-HCl 缓冲溶液中进行振荡消化 24h， 4， 150rpm/min。
28、， 之后在无菌的 PBS （pH7.30） 进行清洗， 清洗完后依次将心包放在核酸消化溶液 中37振荡消化24h。 核酸消化溶液为 ： 2.5KU/ml DNase 、 7.5KU/ml RNase、 0.15MNaCl、 2mM MgCl26H2O 和 1% 双抗的无菌的 0.02M Tris-HCl 缓冲液 （pH7.60） 。在无菌的含双抗 的 PBS 缓冲液 （pH7.30） 进行振荡清洗 24h， 转速为 150rpm， 清洗完后依次将心包在 4保存 说 明 书 CN 102671242 A 6 5/5 页 7 含双抗的无菌的 PBS 溶液中。 说 明 书 CN 102671242 A 7 1/3 页 8 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 102671242 A 8 2/3 页 9 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 102671242 A 9 3/3 页 10 图 5 图 6 说 明 书 附 图 CN 102671242 A 10 。