一种负载细胞因子的纳米纤维膜及其制备方法.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 103071188 A (43)申请公布日 2013.05.01 CN 103071188 A *CN103071188A* (21)申请号 201310030024.7 (22)申请日 2013.01.25 A61L 31/04(2006.01) A61L 31/14(2006.01) A61L 31/16(2006.01) A61L 31/06(2006.01) (71)申请人 上海市第六人民医院 地址 200233 上海市徐汇区宜山路 600 号 (72)发明人 范存义 刘珅 崔文国 金拓 吴飞 (74)专利代理机构 上海申新律师事务所 31272 代理人 竺路。

2、玲 (54) 发明名称 一种负载细胞因子的纳米纤维膜及其制备方 法 (57) 摘要 本发明提供了一种负载细胞因子的纳米纤维 膜， 组成材料包括负载细胞因子、 葡聚糖和可降解 高分子材料， 其中细胞因子负载在葡聚糖玻璃体 纳米颗粒中， 负载细胞因子的葡聚糖玻璃体纳米 颗粒封装在可降解高分子材料的纤维中。该负载 细胞因子的纳米纤维膜能有效地控制细胞因子的 缓慢释放， 保护了细胞因子在制备及释放过程中 的长期活性， 而生物可降解高分子材料则自行降 解， 本制剂无毒、 无免疫原性， 生物相容性好， 提高 疗效， 减少副作用， 在临床上具有重要意义。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 。

3、6 页 附图 7 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书6页 附图7页 (10)申请公布号 CN 103071188 A CN 103071188 A *CN103071188A* 1/1 页 2 1. 一种负载细胞因子的纳米纤维膜， 其特征在于， 组成材料包括细胞因子、 葡聚糖和可 降解高分子材料， 其中细胞因子负载在所述葡聚糖玻璃体的纳米颗粒中， 负载细胞因子的 葡聚糖玻璃体纳米颗粒封装在所述可降解高分子材料的纤维中。 2. 根据权利要求 1 所述负载细胞因子的纳米纤维膜， 其特征在于， 所述负载细胞因子 的葡聚糖玻璃体纳米颗粒中细胞因子和葡。

4、聚糖的质量比为 （0.5-0.8） （10-10000） 。 3. 根据权利要求 1 所述负载细胞因子的纳米纤维膜， 其特征在于， 所述可降解高分子 材料的质量为细胞因子和葡聚糖总质量的 1-200 倍。 4. 根据权利要求 1 所述负载细胞因子的纳米纤维膜， 其特征在于， 所述细胞因子选自 碱性成纤维细胞生长因子、 胰岛素样生长因子 -1、 表皮生长因子、 转化生长因子 -13、 血小 板源性生长因子中的一种或多种。 5. 根据权利要求 1 所述负载细胞因子的纳米纤维膜， 其特征在于， 所述可降解高分子 材料选自聚羟基羧酸、 聚乳酸 - 乙醇酸共聚物、 聚乳酸 - 聚乙二醇共聚物、 聚乳酸 。

5、- 聚己内 酯共聚物、 聚己内酯、 聚磷酸酯、 聚碳酸酯或聚酸酐中的一种或几种。 6.根据权利要求1或5所述负载细胞因子的纳米纤维膜， 其特征在于， 所述可降解高分 子材料分子量为 20KDa-200KDa。 7. 根据权利要求 1 所述负载细胞因子的纳米纤维膜， 其特征在于， 所述负载细胞因子 的纳米纤维膜的纤维直径为 0.1-30m。 8. 一种如权利要求 1 所述负载细胞因子的纳米纤维膜的制备方法， 其特征在于， 包括 以下步骤 ： 步骤 1， 将细胞因子、 葡聚糖溶液和聚多元醇溶液混合， 控制细胞因子、 葡聚糖和聚多元 醇的质量比为 1 （10-1000） （100-10000） ， 。

6、然后干燥得到固体， 固体用有机溶剂洗涤除 去聚多元醇， 得到负载细胞因子的葡聚糖玻璃体纳米颗粒， ； 步骤 2， 将步骤 1 得到的负载细 胞因子的葡聚糖玻璃体纳米颗粒和可降解高分子材料分散或溶解在有机溶剂中， 通过静电 纺丝技术制得负载细胞因子的纳米纤维膜， 控制可降解高分子材料的质量为步骤 1 中得到 的负载细胞因子的葡聚糖玻璃体纳米颗粒总质量的 1-200 倍。 9. 根据权利要求 8 所述制备方法， 其特征在于， 步骤 1 中葡聚糖溶液的浓度为 0.2-20wt， 聚多元醇的浓度为 0.2-20wt。 10. 根据权利要求 8 或 9 所述制备方法， 其特征在于， 步骤 1 中聚多元醇。

7、为聚乙二醇。 权 利 要 求 书 CN 103071188 A 2 1/6 页 3 一种负载细胞因子的纳米纤维膜及其制备方法 技术领域 0001 本发明涉及一种纳米纤维膜， 尤其涉及一种负载细胞因子的纳米纤维膜及其制备 方法。 背景技术 0002 肌腱粘连是临床常见疾患， 由于缺乏有效的粘连防治措施， 常常使治疗陷入 “粘 连 - 松解 - 再粘连” 的恶性循环， 严重影响了患者的肢体功能。在肌腱和周围组织之间放置 防粘连膜具有一定减少肌腱粘连的作用， 但是它们不具有促进肌腱愈合和滑动的功能。此 外， 由于材料或结构的原因， 包裹肌腱后只能起到物理阻隔作用， 可能出现的排异以及干扰 肌腱愈合等。

8、现象严重影响肌腱功能的恢复。 因此， 寻找合适的防粘连膜材料和结构， 负载防 粘连药物， 通过药物的不断释放促进肌腱愈合， 达到防止肌腱粘连的目的， 具有重要意义。 0003 早期应用的防粘连膜多采用非生物材料 （如硅橡胶） 制成， 但存在组织反应大、 排 异明显、 无通透性、 影响肌腱的内源性愈合与需二期手术取出等不足， 严重时可因为阻隔 了肌腱的营养而使其发生变性。因此， 目前这种材料构成的防粘连膜已基本不用。近年 来， 由可降解高分子材料制成的防粘连膜已经问世， 在这一类物质中， 既有天然的高分子材 料， 如纤维素衍生物、 透明质酸、 几丁质及其衍生物等， 也有合成的高分子聚合物， 如聚。

9、乳酸 （polylactic acid， PLA） 、 聚己内酯 （polycaprolactone， PCL） 、 聚羟基乙酸及它们的共聚物 等。 0004 肌腱的愈合与粘连形成过程比较复杂， 碱性成纤维细胞生长因子 (basic fibroblast growth factor， bFGF)、 胰岛素样生长因子 -1、 表皮生长因子、 转化生长因 子 -13、 血小板源性生长因子等细胞因子都参与了这一过程。Chan 等证实了正常肌腱细胞 和腱鞘细胞均能产生 bFGF 等细胞因子， 进一步研究证实 bFGF 等细胞因子是通过细胞增殖 反应来促进肌腱愈合， 并在鼠髌腱模型中发现 bFGF 等细。

10、胞因子可促进肌腱细胞增殖和 III 型胶原的合成。沙德峰等在大鼠肌腱损伤缝接处放置 bFGF 复合缓释降解膜， 实验结果显示 bFGF 复合缓释降解膜有增加肌腱内部愈合能力的作用， 并能使腱内部愈合快于腱周结缔组 织增生， 不仅加快了愈合过程， 而且达到减轻或防止粘连形成的作用。 细胞因子虽然具有高 生物活性、 促进肌腱愈合和减少粘连形成的优势， 但也存在半衰期短、 不耐酸碱及水溶液中 易失活等不足。因此， 理想的治疗模式是提供一个载体， 使其可以在局部缓慢稳定的释放， 并保证细胞因子活性。 发明内容 0005 本发明的目的在于克服上述不足， 提供一种负载细胞因子的纳米纤维膜， 能缓慢 稳定的。

11、释放细胞因子， 保证了细胞因子的连续释放和长期活性。 0006 本发明提供了一种负载细胞因子的纳米纤维膜， 组成材料包括细胞因子、 葡聚糖 和可降解高分子材料， 其中细胞因子负载在所述葡聚糖玻璃体的纳米颗粒中， 负载细胞因 子的葡聚糖玻璃体纳米颗粒封装在所述可降解高分子材料的纤维中。 说 明 书 CN 103071188 A 3 2/6 页 4 0007 优选地， 所述负载细胞因子的葡聚糖玻璃体纳米颗粒中细胞因子和葡聚糖的质量 比为 （0.5-0.8） （10-10000） 。 0008 优选地， 所述可降解高分子材料的质量为细胞因子和葡聚糖总质量的 1-200 倍。 0009 优选地， 所述。

12、负载细胞因子的葡聚糖玻璃体纳米颗粒的粒径为 0.05-10um。 0010 优选地， 所述细胞因子选自碱性成纤维细胞生长因子、 胰岛素样生长因子 -1、 表皮 生长因子、 转化生长因子 -13、 血小板源性生长因子等中的一种或多种。 0011 优选地， 所述所述细胞因子为碱性成纤维细胞生长因子。 0012 优选地， 所述可降解高分子材料选为聚羟基羧酸、 几种羟基羧酸单体的共聚物、 羟 基羧酸与多元醇共聚物、 聚磷酸酯、 聚碳酸酯或聚酸酐中的一种或几种。 0013 优选地， 所述可降解高分子材料为聚羟基羧酸。其中， 羟基羧酸优选为 - 羟基羧 酸， 所述 - 羟基羧酸指的是所述羧酸中， 至少有一。

13、个羟基位于与羧基相邻的碳原子上， 分 子结构为 R1-C(R2)(OH)-COOH， 其中 R1选自 H 或 C-C10 的烷基， 更优选为 H 或 C1-C5 的烷基， 更优选为 H 或 C1-C3 的烷基， 如甲基、 乙基、 丙基、 异丙基等， R1最优选为甲基 （即 - 羟基羧 酸为乳酸） 。本领域技术人员能够理解的是， 本发明所述羟基羧酸也可以用内酯替代， 如己 内酯替代羟基己酸， 由于本发明中， 内酯与羟基羧酸所起作用相同， 因此， 内酯也包括在本 发明羟基所述的范围内。 0014 优选地， 所述多元醇优选为二元醇， 最优选为 - 二元醇， 如丙二醇、 乙二醇， 最优 选为乙二醇。 。

14、0015 本发明所述可降解高分子材料最优选为乳酸均聚物、 或乳酸与其它 - 羟基羧酸 共聚物、 或乳酸与-二元醇共聚物、 或其混合物 ； 更优选为乳酸与-二元醇共聚物， 更优 选为乳酸与乙二醇共聚物、 乳酸与 - 丙二醇共聚物、 或其混合物， 最优选为乳酸与乙二醇 共聚物。 本领域技术人员能够理解的是， 本发明所述二元醇也可以用环氧化合物替代， 如环 氧乙烷替代乙二醇、 环氧丙醇替代丙二醇， 由于本发明中， 环氧烷化合物与多元醇所起作用 相同， 因此， 环氧烷化合物也包括在本发明羟基所述的范围内。 0016 优选地， 所述可降解高分子材料选聚羟基羧酸、 聚乳酸 - 乙醇酸共聚物、 聚乳 酸-聚。

15、乙二醇共聚物、 聚乳酸-聚己内酯共聚物、 聚己内酯、 聚磷酸酯、 聚碳酸酯或聚酸酐或 者其他生物医用类可降解高分子材料等中的一种或几种， 。 0017 优选地， 所述可降解高分子材料分子量为 20KDa-200KDa。 0018 优选地， 所述可降解高分子材料为聚乳酸， 分子量为 30-70KDa。 0019 优选地， 所述负载细胞因子的纳米纤维膜的纤维直径为 0.1-30m。 0020 本发明还提供了一种上述负载细胞因子的纳米纤维膜的制备方法， 包括以下步 骤 ： 0021 步骤 1， 将细胞因子、 葡聚糖溶液和聚多元醇溶液混合， 控制细胞因子、 葡聚糖和聚 多元醇的质量比为 1 （10-1。

16、000） （100-10000） ， 然后干燥得到固体， 固体用有机溶剂洗 涤除去聚多元醇， 得到负载细胞因子的葡聚糖玻璃体纳米颗粒 ； 0022 步骤 2， 将步骤 1 得到的负载细胞因子的葡聚糖玻璃体纳米颗粒和可降解高分子 材料分散或溶解在有机溶剂中， 通过静电纺丝技术制得负载细胞因子的纳米纤维膜， 控制 可降解高分子材料的质量为步骤 1 中得到的负载细胞因子的葡聚糖玻璃体纳米颗粒总质 量的 1-200 倍。 说 明 书 CN 103071188 A 4 3/6 页 5 0023 优选地， 步骤 1 中葡聚糖溶液的浓度为 0.2-20wt， 聚多元醇的浓度为 0.2-20wt。 0024 。

17、其中， 所述聚多元醇优选为聚二元醇， 更优选为聚 - 二元醇 ； - 二元醇指 的是至少有两个相邻的碳原子上分别连接有一个羟基， 分子结构为 R3-C(R4)(OH)-C(R5) (OH)-R6， 其中， R3、 R4、 R5、 R6分别独立地选自 H 或 C1-C10 的烷基， 更优选为 H 或 C1-C5 的烷 基， 更优选为 H 或 C1-C3 的烷基， 如甲基、 乙基、 丙基、 异丙基 ； R3、 R4、 R5、 R6分别独立地最优 选为 H（即多元醇或 - 二元醇为乙二醇） 。 0025 应当注意的是， 上述二元醇也可以用环氧化合物替代， 如环氧乙烷替代乙二醇、 环 氧丙烷替代 - 。

18、丙二醇， 所制备的聚合物具有相同的结构。 0026 优选地， 所述聚多元醇为聚乙二醇。 0027 优选地， 所述聚乙二醇为 PEG6000 或 PEG4000 等。 0028 所述有机溶剂优选为脂肪烃、 芳香烃、 氯代烃、 醇、 酮、 醛、 酯、 腈、 羧酸、 亚砜、 酰胺 类溶剂。 0029 所述脂肪烃的例子包括 ： 戊烷、 己烷、 辛烷、 环己烷等。 0030 所述芳香烃的例子包括 ： 苯乙烯、 苯、 甲苯、 二甲苯等。 0031 所述氯代烃的例子包括 ： 二氯甲烷、 氯仿、 四氯化碳、 溴仿、 氯苯、 二氯苯 （对二氯 苯、 邻二氯苯） 、 四氯乙烷等。 0032 所述醇的例子包括 ： 。

19、甲醇、 乙醇、 乙二醇、 丙醇、 异丙醇、 丙二醇、 叔丁醇、 甘油、 丁二 醇、 戊二醇、 乙二醇单甲醚、 乙二醇单乙醚、 乙二醇单丁醚等。 0033 所述酮的例子包括 ： 丙酮、 丁酮、 甲基丁基酮、 环己酮等。 0034 所述醛的例子包括 ： 乙醛、 丙醛、 戊二醛、 乙二醛等。 0035 所述酯的例子包括 ： 乙酸甲酯、 乙酸乙酯、 乙酸丙酯、 乙酸丁酯、 乙酸戊酯、 甲酸甲 酯、 甲酸乙酯、 甲酸丁酯、 甲酸戊酯等。 0036 所述腈的例子如 ： 乙腈等。 0037 所述羧酸的例子包括 ： 甲酸、 乙酸等。 0038 所述亚砜的例子包括 ： 二甲基亚砜、 氯化亚砜、 二苯基亚砜等。 。

20、0039 所述酰胺的例子包括 ： N， N- 二甲基甲酰胺、 N， N- 二乙基甲酰胺等。 0040 优选地， 步骤 1 中所述有机溶剂为正己烷、 二氯甲烷、 三氯甲烷、 丙酮、 四氢呋喃、 乙酸乙酯、 二甲基甲酰胺等中的一种或几种。 0041 优选地， 步骤 2 中所述有机溶剂为能溶解可降解高分子材料的溶剂。 0042 优选地， 步骤 2 中所述有机溶剂为为甲醇、 乙醇、 正丁醇、 正己烷、 二氯甲烷、 三氯 甲烷、 丙酮、 四氢呋喃、 乙酸乙酯、 N， N- 二甲基甲酰胺 （DMF） 、 异丙醇、 三氟乙醇或六氟异丙 醇或其它能溶解可降解高分子材料等中的一种或几种。 0043 优选地， 步。

21、骤 2 中可降解高分子材料溶解在有机溶剂中， 得到可降解高分子材料 溶液， 然后将负载细胞因子的葡聚糖玻璃体纳米颗粒分散或溶解在生物降解高分子的溶液 中。 0044 优选地， 步骤 2 中所述可降解高分子材料为聚乳酸， 分子量为 30-70KDa。 0045 优选地， 步骤 2 中通过共混静电纺丝技术制得负载细胞因子的纳米纤维膜。 0046 优选地， 步骤 2 中静电纺工艺参数条件为 ： 电压 8-25kV， 流速 0.01-0.1mL/min， 接 说 明 书 CN 103071188 A 5 4/6 页 6 受台离喷丝头的距离 10-20cm。 0047 本发明提供的负载细胞因子的纳米纤维。

22、膜将细胞因子包裹在葡聚糖玻璃体纳米 颗粒中后， 负载细胞因子的葡聚糖玻璃体纳米颗粒再进一步被封装在可降解高分子材料纤 维中。 将细胞因子包裹在葡聚糖玻璃体纳米颗粒中可有效地克服细胞因子不耐酸碱及水溶 液中易失活等缺陷， 保证了细胞因子的长期活性， 而且细胞因子释放时通过两个包层相继 扩散， 可以使细胞因子有效释放时间长。 实验证明， 本发明提供的负载细胞因子的纳米纤维 膜没有突释， 有效释放时间可达30天， 而现有负载细胞因子的PLLA纤维的有效释放时间仅 为 10 天。 0048 本发明提供的负载细胞因子的纳米纤维膜有效地控制细胞因子的缓慢释放， 保证 了细胞因子的长期活性， 而生物可降解高。

23、分子材料则自行降解， 本制剂无毒、 无免疫原性， 生物相容性好， 提高疗效， 减少副作用， 在临床上具有重要意义。 附图说明 0049 图 1 为实施例 1 所得负载 bFGF 的葡聚糖玻璃体纳米颗粒的扫描电镜图 ； 0050 图 2 为实施例 1 所得负载 bFGF 的纳米纤维膜的扫描电镜图 ； 0051 图 3 为实施例 1 所得负载 bFGF 的纳米纤维膜的体外药物释放实验结果图 ； 0052 图 4 为实施例 1 所得负载 bFGF 的纳米纤维膜的体外细胞实验增生结果图 ； 0053 图 5 为实施例 1 所得负载 bFGF 的纳米纤维膜的体外细胞实验细胞活性图 ； 0054 图 6 。

24、为实施例 1 所得负载 bFGF 的纳米纤维膜的动物实验整体观察结果图 ； 0055 图 7 为实施例 1 所得负载 bFGF 的纳米纤维膜的动物实验的组织切片图。 0056 图 8 为实施例 1 所得负载 bFGF 的纳米纤维膜的动物实验的 I 胶原蛋白染色检测 图 ； 0057 图 9 为实施例 1 所得负载 bFGF 的纳米纤维膜的动物实验的蛋白表达检测图。 具体实施方式 0058 下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明， 以更好地理解本发明。 0059 实施例 1 0060 将 0.1gbFGF 加入 100mL5葡聚糖水溶液中溶解均匀， 然后与 1000mL5 PEG 溶液 使。

25、用漩涡混合器混合， -80预冻 24h 后冷冻干燥。冻干粉分散在二氯甲烷中， 涡流， 获得均 一的悬浊液， 离心除去上清液， 重新加入二氯甲烷 （DCM） ， 重复上述操作3次。 除去残余二氯 甲烷后得到负载 bFGF 的葡聚糖玻璃体纳米颗粒 （bFGF/DGNs） 。 0061 取 100mg 所得 bFGF/DGNs 通过冰浴超声波处理分散在 2gDCM 中， 0.5g 聚左乳酸 （PLLA） 和 1g DMF 通过冰浴搅拌加入到 bFGF/DGNs， 通过静电纺丝技术制得负载 bFGF 的纳 米纤维膜 （bFGF/DGNs-PLLA） 。其中， 静电纺工艺参数条件为 ： 电压 20kV，。

26、 流速 0.04mL/min， 接受台离喷丝头的距离 15cm。 0062 采用同样的制备工艺制备 bFGF-PLLA 纤维膜和 PLLA 纤维膜。 0063 扫描电镜 （SEM）观察本实施例所得负载 bFGF 的葡聚糖玻璃体纳米颗粒 （bFGF/ DGNs） ， 结果如图 1 所示， 纳米颗粒平均粒径约为 200 500nm。扫描电镜 （SEM） 观察本实施 例所得负载 bFGF 的纳米纤维膜， 结果如图 2 所示， bFGF/DGNs 成功地封装到 PLLA 中， bFGF/ 说 明 书 CN 103071188 A 6 5/6 页 7 DGNs-PLLA 纤维直径均一， 约为 0.770。

27、.21m。 0064 使用 bFGF 酶联免疫检测试剂盒测量计算本实施例所得 bFGF/DGNs-PLLA 纤维膜 中 bFGF 包封率达到 48.7113.53， 而 bFGF-PLLA 纤维膜中仅为 24.6416.43， bFGF/ DGNs-PLLA纤维膜的bFGF包封率远远高于bFGF-PLLA纤维膜， 表明bFGF/DGNs-PLLA纤维膜 中 DGNs 能很好地保护 bFGF 的活性， 保证了 bFGFs 的长期活性。 0065 建立体外药物释放模型， 观察本实施例所得 bFGF/DGNs-PLLA 纤维膜的药物释放 情况， 结果如图 3 所示， 葡聚糖保护 bFGF 的 bFG。

28、F/DGNs-PLLA 纤维膜没有初期突释， 控制释 放bFGF近30天， bFGF的累计释放量为6100pg。 然而， bFGF-PLLA纤维膜控制释放bFGF近20 天， bFGF的累计释放量为2900pg。 bFGF/DGNs-PLLA纤维膜中释放累计的bFGF是bFGF-PLLA 纤维膜中的两倍多。 0066 进行体外细胞增生实验， 结果如图 4 所示， 比起 PLLA 纤维膜和 bFGF-PLLA 纤维膜， bFGF/DGNs-PLLA纤维膜上细胞生长更好。 测试细胞活性， 结果如图5所示， 比起PLLA纤维膜 和 bFGF-PLLA 纤维膜， bFGF/DGNs-PLLA 纤维膜上。

29、死 / 活细胞率越低， 表明 bFGF/DGNs-PLLA 纤维膜更利于细胞粘连与增生。 0067 进行动物实验， 将本实施例所得 bFGF/DGNs-PLLA 纤维膜作为物理屏障， 用于肌腱 损伤， 防治肌腱周围组织粘连， 实验结果如图 6 8 所示。图 6 中， 空白组 （control） 出现严 重腱周粘连， 需要锐器剥离来分离 ； PLLA组、 bFGF-PLLA组和bFGF/DGNs-PLLA组仅观察到少 量粘连区域， 且可以通过钝器剥离来分离， bFGF-PLLA 组和 bFGF/DGNs-PLLA 组中肌腱厚度 显著增加， 尤其是 bFGF/DGNs-PLLA 组， 表明 bFG。

30、F 促进肌腱愈合。图 7 中， 空白组 （control） 腱周组织和肌腱之间布满了纤维组织束 ； 对照例组 （PCL） 在腱周组织和肌腱边界处观察到 疏松纤维组织束 ； PLLA 组、 bFGF-PLLA 组和 bFGF/DGNs-PLLA 组中几乎没有松纤维组织束， bFGF/DGNs-PLLA 组中观察到明显的腱内胶原束， 表明 bFGF/DGNs-PLLA 组肌腱愈合更好、 血 管密度更高。图 8 中， bFGF/DGNs-PLLA 组中 I 胶原蛋白阳性表达最多， 排列最密集， 也表明 了 bFGF/DGNs-PLLA 组肌腱愈合更好。图 9 也表明 bFGF/DGNs-PLLA 组。

31、中 I 胶原蛋白表达最 高。 0068 实施例 2 0069 将 0.1gbFGF 加入 100mL5葡聚糖水溶液中溶解均匀， 然后与 1000mL5 PEG 溶液 使用漩涡混合器混合， -80预冻 24h 后冷冻干燥。冻干粉分散在二氯甲烷中， 涡流， 获得均 一的悬浊液， 离心除去上清液， 重新加入二氯甲烷 （DCM） ， 重复上述操作3次。 除去残余二氯 甲烷后得到负载 bFGF 的葡聚糖玻璃体纳米颗粒 （bFGF/DGNs） 。 0070 取 120mg 所得 bFGF/DGNs 通过冰浴超声波处理分散在 2gDCM 中， 0.5g 聚左乳酸 （PLLA） 和 1g DMF 通过冰浴搅拌。

32、加入到 bFGF/DGNs， 通过共混静电纺丝技术制得负载 bFGF 的纳米纤维膜 （bFGF/DGNs-PLLA） 。 其中， 静电纺工艺参数条件为 ： 电压20kV， 流速0.04m L/ min， 接受台离喷丝头的距离 15cm。实施例 3 0071 将 0.1gbFGF 加入 100mL5葡聚糖水溶液中溶解均匀， 然后与 1000mL5 PEG 溶液 使用漩涡混合器混合， -80预冻 24h 后冷冻干燥。冻干粉分散在二氯甲烷中， 涡流， 获得均 一的悬浊液， 离心除去上清液， 重新加入二氯甲烷 （DCM） ， 重复上述操作3次。 除去残余二氯 甲烷后得到负载 bFGF 的葡聚糖玻璃体纳。

33、米颗粒 （bFGF/DGNs） 。 0072 取 110mg 所得 bFGF/DGNs 通过冰浴超声波处理分散在 2gDCM 中， 0.5g 聚左乳酸 说 明 书 CN 103071188 A 7 6/6 页 8 （PLLA） 和 1g DMF 通过冰浴搅拌加入到 bFGF/DGNs， 通过共混静电纺丝技术制得负载 bFGF 的纳米纤维膜 （bFGF/DGNs-PLLA） 。其中， 静电纺工艺参数条件为 ： 电压 20kV， 流速 0.04mL/ min， 接受台离喷丝头的距离 15cm。 实施例 4 0073 将 0.1gbFGF 加入 100mL5葡聚糖水溶液中溶解均匀， 然后与 1000。

34、mL5 PEG 溶液 使用漩涡混合器混合， -80预冻 24h 后冷冻干燥。冻干粉分散在二氯甲烷中， 涡流， 获得均 一的悬浊液， 离心除去上清液， 重新加入二氯甲烷 （DCM） ， 重复上述操作3次。 除去残余二氯 甲烷后得到负载 bFGF 的葡聚糖玻璃体纳米颗粒 （bFGF/DGNs） 。 0074 取 100mg 所得 bFGF/DGNs 通过冰浴超声波处理分散在 2gDCM 中， 0.6g 聚左乳酸 （PLLA） 和 1g DMF 通过冰浴搅拌加入到 bFGF/DGNs， 通过共混静电纺丝技术制得负载 bFGF 的纳米纤维膜 （bFGF/DGNs-PLLA） 。 其中， 静电纺工艺参数。

35、条件为 ： 电压20kV， 流速0.04m L/ min， 接受台离喷丝头的距离 15cm。 实施例 5 0075 将 0.1gbFGF 加入 100mL5葡聚糖水溶液中溶解均匀， 然后与 1000mL5 PEG 溶液 使用漩涡混合器混合， -80预冻 24h 后冷冻干燥。冻干粉分散在二氯甲烷中， 涡流， 获得均 一的悬浊液， 离心除去上清液， 重新加入二氯甲烷 （DCM） ， 重复上述操作3次。 除去残余二氯 甲烷后得到负载 bFGF 的葡聚糖玻璃体纳米颗粒 （bFGF/DGNs） 。 0076 取 100mg 所得 bFGF/DGNs 通过冰浴超声波处理分散在 2gDCM 中， 0.7g 。

36、聚左乳酸 （PLLA） 和 1g DMF 通过冰浴搅拌加入到 bFGF/DGNs， 通过共混静电纺丝技术制得负载 bFGF 的纳米纤维膜 （bFGF/DGNs-PLLA） 。 其中， 静电纺工艺参数条件为 ： 电压20kV， 流速0.04m L/ min， 接受台离喷丝头的距离 15cm。 0077 体外药物释放实验、 体外细胞增生实验和动物实验表明， 实施例 2-5 所得负载 bFGF 的纳米纤维膜同实施例 1 所得负载 bFGF 的纳米纤维膜， 没有初期突释， 药物有效释放 时间约为 30 天， 能有效改善组织粘连、 促进肌腱愈合。 0078 综上所述， 本发明提供的负载 bFGF 的纳米。

37、纤维膜将 bFGF 包裹在葡聚糖玻璃体纳 米颗粒中后， 负载 bFGF 的葡聚糖玻璃体纳米颗粒再进一步被封装在可降解高分子材料纤 维中。将 bFGF 包裹在葡聚糖玻璃体纳米颗粒中可有效地克服 bFGF 不耐酸碱及水溶液中易 失活等缺陷， 保证了bFGFs的长期活性， 没有初期突释， 而且bFGF释放时通过两个包层相继 扩散， 可以使 bFGF 有效释放时间长。 0079 以上对本发明的具体实施例进行了详细描述， 但其只是作为范例， 本发明并不限 制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言， 任何对本发明进行的等同修改和 替代也都在本发明的范畴之中。因此， 在不脱离本发明的精神和范围下所作。

38、的均等变换和 修改， 都应涵盖在本发明的范围内。 说 明 书 CN 103071188 A 8 1/7 页 9 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 103071188 A 9 2/7 页 10 图 3 说 明 书 附 图 CN 103071188 A 10 3/7 页 11 图 4 说 明 书 附 图 CN 103071188 A 11 4/7 页 12 图 5 说 明 书 附 图 CN 103071188 A 12 5/7 页 13 图 6 说 明 书 附 图 CN 103071188 A 13 6/7 页 14 图 7 说 明 书 附 图 CN 103071188 A 14 7/7 页 15 图 8 图 9 说 明 书 附 图 CN 103071188 A 15 。