蓬松型皮胶原止血材料及其制备方法.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201510222863.8 (22)申请日 2015.05.05 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 104874012 A (43)申请公布日 2015.09.02 (73)专利权人 四川大学 地址 610065 四川省成都市武侯区一环路 南一段24号 (72)发明人 但卫华 刘科 但年华 刘新华 (51)Int.Cl. A61L 15/32(2006.01) (56)对比文件 CN 102121133 A,2011.07.13,说明书第 0006-0023段. 。

2、CN 102121133 A,2011.07.13,说明书第 0006-0023段. CN 101314058 A,2008.12.03,说明书第3-4 页. 审查员 赵莉 (54)发明名称 蓬松型皮胶原止血材料及其制备方法 (57)摘要 本发明公开了一种蓬松型皮胶原止血材料 的制备方法， 其特点是以医用纯化猪真皮为原 料， 在维持猪皮胶原纤维三维结构不变的前提 下， 将其经反复碱膨胀、 酸膨胀， 使猪皮胶原纤维 得到适度的分离和松散， 再经碳化二亚胺改性、 冻干、 回湿、 机械蓬松、 灭菌等工艺， 最终制备得 到了一种棉絮状的蓬松型皮胶原止血材料。 该材 料完整地保留了天然猪皮胶原的三维立体。

3、网状 结构， 与普通胶原材料相比， 本发明所制备的蓬 松型皮胶原的结构稳定性、 力学性能、 生物降解 性能更优， 既具有良好的生物相容性、 低免疫原 性等生物学性能， 又具备促进创面愈合和修复的 功能， 可用于创伤修复中的快速有效止血。 权利要求书1页 说明书5页 CN 104874012 B 2017.05.31 CN 104874012 B 1.一种蓬松型皮胶原棉絮状止血材料的制备方法， 包括如下步骤： (1)医用纯化猪真皮前处理： 取医用纯化猪真皮， 将其剪成520mm520mm的规则小 块， 接着用生理盐水反复清洗35次， 再用pH为7.5的Tris-NaCl缓冲溶液浸泡24h； 倾去。

4、 缓冲液， 用超纯水继续反复漂洗皮片35次， 沥水备用； (2)碱膨胀： 向不锈钢转鼓中投入按皮片重2.07.0的氢氧化钠， 超纯水调节液比 至3.05.0， 待氢氧化钠充分溶解后， 加入皮片， 碱膨胀作用24h， 检测医用纯化猪真皮的 膨胀情况， 倾去碱液； 之后， 按上述碱膨胀工艺重复36次， 便得到碱膨胀纯化猪真皮； (3)水洗： 加超纯水调节液比为3.05.0， 常温下水洗1030min， 反复水洗35次， 倾 去废液， 沥水； (4)酸膨胀： 将液比为3.05.0、 pH值为2.04.0的醋酸溶液投入不锈钢转鼓对皮片进 行酸膨胀处理810h， 检测纯化猪真皮的膨胀情况， 倾去酸液； 。

5、之后， 按上述工艺反复酸膨 胀36次， 得到酸膨胀纯化猪真皮； (5)碳化二亚胺改性： 室温下将80120mM 2-吗啉乙磺酸溶解在体积分数为5080 的乙醇溶液中， 将经过反复碱、 酸膨胀处理后的医用纯化猪真皮浸泡在上述乙醇溶液中60 120min， 接着加入3060mM N-羟基琥珀酰亚胺和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺 盐酸盐， 室温下搅拌反应1248h， 待反应结束后倾去废液， 接着用体积分数为95的乙醇 清洗1030min， 反复清洗25次， 最后用PBS缓冲液清洗1012h， 反复清洗25次， 冷冻干 燥备用； (6)机械蓬松： 用喷枪将4045热水均匀喷施于冻干医用纯化。

6、猪真皮皮片表面， 再用 塑料薄膜包裹密封静置120150min， 接着用轧花机对皮片进行反复蓬松操作， 反复蓬松次 数为36次， 检查蓬松情况； 最后剂量为630KGy/h60Co所产生的射线消毒灭菌， 成型包 装， 即为成品； 所述止血材料的主要性能指标如下： 性状： 白色或淡黄色絮状物， 棉花状， 无肉眼可见的杂物和变色； 重金属含量： 10 g/g； 脂质体所占质量分数： 1(m/m)； 羟脯氨酸所占质量分数： 不小于总蛋白含量的9(m/m)； 细胞毒性： 细胞毒性反应不大于1级； 止血时间： 2060s。 2.如权利要求1所述的蓬松型皮胶原棉絮状止血材料的制备方法， 其特征在于所述的 。

7、医用纯化猪真皮经组织学观察显示猪皮中的细胞及纤维间质都已除尽， 细胞毒性反应不大 于I级。 3.如权利要求1所述的蓬松型皮胶原棉絮状止血材料的制备方法， 其特征在于所述的 pH为7.5的Tris-NaCl缓冲液的配制方法为0.05mol/L Tris和1mol/L NaCl， 使用HCl进行pH 的调节。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 104874012 B 2 蓬松型皮胶原止血材料及其制备方法 技术领域 0001 本发明涉及了一种具有良好的生物相容性、 生物可降解性、 低免疫原性等优良生 物学性能的蓬松型皮胶原的止血材料的制备， 属于生物医用材料领域。 背景技术 0002 在大部。

8、分的外科和创伤手术中， 会伴随着创面的大量出血， 从而使患者面临极大 的生命危险， 因此制备得到快速有效的止血材料一直是医用领域的研究热点。 目前， 在手术 及创伤修复应用过程中还是以四头带、 止血带和绷带等传统止血材料为主， 此类传统型的 材料止血效果差， 消耗大， 且不便于保存。 近年来， 随着对新型快速可吸收止血材料研究的 增加， 皮胶原由于其良好的生物相容性、 低免疫原性及可降解性等优良生物学性能受到研 究者的广泛关注。 0003 皮胶原作为一种生物学性能良好的医用材料， 与人体具有良好的组织相容性， 可 降解性且无毒副作用， 同时能够促进细胞的粘附、 增殖和创口的复合； 另一方面， 。

9、皮胶原特 有的微孔结构使得胶原基材料具有很好的渗透性， 有利于生物因子的生长扩散； 其良好的 粘附性， 可以诱导并促进成纤维细胞的生长， 从而促进伤口的愈合。 （但卫华,李志强,廖隆 理,等.皮胶原及其在组织工程中的应用J .皮革化工,2004,21(5):24-29） 。 而对于皮胶 原突出的止血性能， 也有大量的文献报道。 0004 创面止血和化解疼痛是皮胶原的一大生物医学性能， 主要原因在于皮胶原在与创 面的接触过程中不仅可以保护创面进一步损伤， 而且其超分子结构中游离的氨基酸侧链氨 基可以加快血液中血小板的凝聚和激活血液凝固生长因子， 从而促使创面止血。 （林炜, 穆畅道, 王坤余, 。

10、等. 皮革固体废弃物资源化( ) 胶原的性质及其在医药和化妆品工 业中的应用J .中国皮革.2001,30(15):8 11. ） （俞耀庭. 生物医用材料 M . 天津: 天津大学出版社,2000. ） 在创面愈合的过程中， 皮胶原通过快速促进细胞生长代谢， 可以 有效地缩短创面的修复时间。 0005 目前， 关于皮胶原较为常见的提取制备方法为酸酶结合提取法， 其提取制备技术 主要包括原料的预处理、 脱脂、 酶解消化、 盐析、 离心、 纯化等步骤。 根据国内外大量的文献 报道， 大多研究制备得到的皮胶原存在纯度低、 产率低、 成本高等问题。 另一方面， 胶原虽然 具有优良的止血性能， 但其在。

11、生物力学性能方面无法满足止血材料的要求， 甚至在其提取 制备过程中时有因处理过度使皮胶原进一步水解而失去生物力学性能， 因此要进行必要的 改性交联来满足止血材料应用过程中所需的力学性能要求。 0006 综上所述， 现有技术存在以下不足： 0007 1 现有的胶原可吸收止血材料的制备技术要先从动物皮中提取制备胶原， 然后再 进行改性交联， 最后获得胶原止血材料， 其制备步骤繁琐、 制备周期长， 止血效果一般； 0008 2 现有的皮胶原提取制备技术， 提取工艺复杂， 会对皮胶原结构造成一定程度的 损坏， 使其生物力学性能变差， 无法达到快速止血的效果； 0009 3 所制备得到皮胶原原料产率低、。

12、 纯度低且成本高， 时有细胞毒性不达标等问题， 说 明 书 1/5 页 3 CN 104874012 B 3 已经无法满足目前市场的要求。 发明内容 0010 本发明的目的是针对现有相关技术的不足而提供了蓬松型皮胶原止血材料的制 备方法， 其特点是利用医用纯化猪真皮为原料， 经过反复的碱膨胀和酸膨胀， 使皮胶原纤维 产生充分适度地分离和松散， 然后经过特定条件的碳化二亚胺交联改性后获得胶原本体材 料， 最后通过反复的机械蓬松， 使胶原本体进一步蓬松， 获得类似棉絮的蓬松型皮胶原止血 材料。 该材料集成了皮胶原优良的生物学性能和止血材料所要求的生物力学性能， 能够进 行快速有效止血。 0011 。

13、本发明的目的可以由以下制备技术来实现， 其制备方法步骤如下： 0012 （1） 医用纯化猪真皮前处理： 取医用纯化猪真皮， 将其剪成520mm520mm的 规则小块， 接着用生理盐水反复清洗35次， 再用pH为7.5 的Tris-NaCl缓冲溶液浸泡2 4h； 倾去缓冲液， 用超纯水继续反复漂洗皮片35次， 沥水备用； 0013 （2） 碱膨胀： 向不锈钢转鼓中投入按皮片重2.07.0的氢氧化钠， 超纯水调节 液比至3.05.0， 待氢氧化钠充分溶解后， 加入皮片， 碱膨胀作用24h， 检测医用纯化猪真 皮的膨胀情况， 倾去碱液。 之后， 按上述碱膨胀工艺重复36次， 便得到碱膨胀纯化猪真皮；。

14、 0014 （3） 水洗： 加超纯水调节液比为3.05.0， 常温下水洗1030min， 反复水洗35 次， 倾去废液， 沥水； 0015 （4） 酸膨胀： 将液比为3.05.0、 pH值为2.04.0的醋酸溶液投入不锈钢转鼓对皮 片进行酸膨胀处理810h， 检测纯化猪真皮的膨胀情况， 倾去酸液。 之后， 按上述工艺反复 酸膨胀36次， 得到酸膨胀纯化猪真皮； 0016 （5） 碳化二亚胺改性： 室温下将80120mM 2-吗啉乙磺酸溶解在5080% （v/v） 乙醇 溶液中， 将经过反复碱、 酸膨胀处理后的医用纯化猪真皮浸泡在上述乙醇溶液中60 120min， 接着加入3060mM N-羟基。

15、琥珀酰亚胺和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐 酸盐， 室温下搅拌反应1248h， 待反应结束后倾去废液， 接着用95的乙醇清洗1030min， 反复清洗25次， 最后用PBS缓冲液清洗1012h， 反复清洗25次， 冷冻干燥备用； 0017 （6） 机械蓬松： 用喷枪将4045热水均匀喷施于冻干医用纯化猪真皮皮片表面， 再用塑料薄膜包裹密封静置120150min， 接着用轧花机对皮片进行反复蓬松操作， 反复蓬 松次数为36次， 检查蓬松情况； 最后剂量为 630KGy/h60Co所产生的射线消毒灭菌， 成型包装， 即为成品。 0018 在上述的制备方法中， 步骤 （1） 中使用的医用。

16、纯化猪真皮为本研究室前期研究结 果， 其细胞毒性级别为I级别； 步骤 （2） 中所述的蓬松型皮胶原是以医用纯化猪真皮为原料， 在碱酸反复膨胀后， 采用碳化二亚胺进行改性交联， 轧花机反复蓬松后得到类似棉絮状的 皮胶原， 其纯度更高、 胶原损失更小； 步骤 （2） 中氢氧化钠为分析纯， 成都市科龙化工试剂厂 购买； 步骤 （4） 中醋酸为分析纯， 成都市科龙化工试剂厂购买； 步骤 （5） 中碳化二亚胺为色谱 纯， 上海延长生化公司购买； 步骤 （6） 中轧花机机械蓬松的时间和次数视皮胶原的蓬松程度 而定。 0019 本发明有以下优点： 0020 (1) 本发明制备工艺通过碱膨胀和酸膨胀的反复处理。

17、， 能够使皮胶原纤维充分而 说 明 书 2/5 页 4 CN 104874012 B 4 适度的分离和松散， 皮胶原纤维之间的空隙增大， 孔隙率提高， 胶原纤维之间相对滑动达到 无约束状态， 更有利于创面修复过程中， 营养物质和生物因子的扩散及血管的复合生长， 有 利于提高该材料的止血性能； 0021 (2) 本工艺采用碳化二亚胺进行交联改性， 进一步增强了皮胶原材料的理化性 能， 避免在创面修复过程中由于力学性能较差而导致创面的二次损伤； 0022 (3) 本工艺以纯化猪真皮作为胶原本体材料， 进一步对其进行蓬松处理， 所得到 皮胶原纯度更高， 也避免了皮胶原在提取制备过程中的大量损失， 其。

18、免疫原性也更低； 同 时， 也省去了皮胶原提取制备复杂繁琐的工艺过程， 大大降低了生产成本； 0023 (4) 本工艺制备过程中， 借助轧花机的机械作用对酸碱膨胀后的胶原本体材料进 一步蓬松， 操作简易， 得到的形似棉花状的止血材料， 有利于提高材料的止血性能； 0024 (5) 本工艺制备得到的蓬松型皮胶原止血材料具有良好的生物学性能和止血、 力 学性能， 便于包装、 保存、 携带。 具体实施方式 0025 下面通过实施对本发明进行具体的描述， 有必要在此指出的是本实施例只用于本 发明进行进一步说明， 而不能理解为对本发明保护范围的限制， 该领域的技术熟练人员可 以根据上述发明的内容作出非本。

19、质的改进和调整。 0026 实施例1 0027 （1） 医用纯化猪真皮前处理： 取8重量份的医用纯化猪真皮， 将其剪成10mm10mm 的规则小块， 接着用生理盐水反复清洗3次， 再用pH为7.5 的Tris-NaCl缓冲溶液浸泡2h； 倾 去缓冲液， 用超纯水继续反复漂洗皮片3次， 沥水备用； 0028 （2） 碱膨胀： 向不锈钢转鼓中投入按皮片重2.5的氢氧化钠， 超纯水调节液比至 3.0， 待氢氧化钠充分溶解后， 加入皮片， 碱膨胀作用2h， 检测医用纯化猪真皮的膨胀情况， 倾去碱液。 之后， 按上述碱膨胀工艺重复3次， 便得到碱膨胀纯化猪真皮； 0029 （3） 水洗： 加超纯水调节液。

20、比为3.0， 常温下水洗10min， 反复水洗3次， 倾去废液， 沥水； 0030 （4） 酸膨胀： 将液比为3.0、 pH值为2.0的醋酸溶液投入不锈钢转鼓对皮片进行酸膨 胀处理8h， 检测纯化猪真皮的膨胀情况， 倾去酸液。 之后， 按上述工艺反复酸膨胀3次， 得到 酸膨胀纯化猪真皮； 0031 （5） 碳化二亚胺改性： 室温下将80mM 2-吗啉乙磺酸溶解在50% （v/v） 乙醇溶液中， 将经过反复碱、 酸膨胀处理后的医用纯化猪真皮浸泡在上述乙醇溶液中60min， 接着加入 30mM N-羟基琥珀酰亚胺和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐， 室温下搅拌反应 12h， 待反应结。

21、束后倾去废液， 接着用95的乙醇清洗10min， 反复清洗2次， 最后用PBS缓冲 液清洗10h， 反复清洗2次， 冷冻干燥备用； 0032 （6） 机械蓬松： 用喷枪将40热水均匀喷施于冻干医用纯化猪真皮皮片表面， 再用 塑料薄膜包裹密封静置120min， 接着用轧花机对皮片进行反复蓬松操作， 反复蓬松次数为3 次， 检查蓬松情况； 最后剂量为 15KGy/h60Co所产生的射线消毒灭菌， 成型包装， 即为成 品。 0033 实施例2 0034 （1） 医用纯化猪真皮前处理： 取10重量份的医用纯化猪真皮， 将其剪成15mm 说 明 书 3/5 页 5 CN 104874012 B 5 15。

22、mm的规则小块， 接着用生理盐水反复清洗4次， 再用pH为7.5 的Tris-NaCl缓冲溶液浸泡 3h； 倾去缓冲液， 用超纯水继续反复漂洗皮片4次， 沥水备用； 0035 （2） 碱膨胀： 向不锈钢转鼓中投入按皮片重4.0的氢氧化钠， 超纯水调节液比至 4.0， 待氢氧化钠充分溶解后， 加入皮片， 碱膨胀作用3h， 检测医用纯化猪真皮的膨胀情况， 倾去碱液。 之后， 按上述碱膨胀工艺重复4次， 便得到碱膨胀纯化猪真皮； 0036 （3） 水洗： 加超纯水调节液比为4.0， 常温下水洗20min， 反复水洗4次， 倾去废液， 沥 水； 0037 （4） 酸膨胀： 将液比为4.0、 pH值为3。

23、.0的醋酸溶液投入不锈钢转鼓对皮片进行酸膨 胀处理9h， 检测纯化猪真皮的膨胀情况， 倾去酸液。 之后， 按上述工艺反复酸膨胀4次， 得到 酸膨胀纯化猪真皮； 0038 （5） 碳化二亚胺改性： 室温下将100mM 2-吗啉乙磺酸溶解在60% （v/v） 乙醇溶液中， 将经过反复碱、 酸膨胀处理后的医用纯化猪真皮浸泡在上述乙醇溶液中80min， 接着加入 40mM N-羟基琥珀酰亚胺和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐， 室温下搅拌反应 24h， 待反应结束后倾去废液， 接着用95的乙醇清洗20min， 反复清洗3次， 最后用PBS缓冲 液清洗11h， 反复清洗3次， 冷冻干燥备用。

24、； 0039 （6） 机械蓬松： 用喷枪将42热水均匀喷施于冻干医用纯化猪真皮皮片表面， 再用 塑料薄膜包裹密封静置130min， 接着用轧花机对皮片进行反复蓬松操作， 反复蓬松次数为4 次， 检查蓬松情况； 最后剂量为 20KGy/h60Co所产生的射线消毒灭菌， 成型包装， 即为成 品。 0040 实施例3 0041 （1） 医用纯化猪真皮前处理： 取12重量份的医用纯化猪真皮， 将其剪成20mm 20mm的规则小块， 接着用生理盐水反复清洗5次， 再用pH为7.5 的Tris-NaCl缓冲溶液浸泡 4h； 倾去缓冲液， 用超纯水继续反复漂洗皮片5次， 沥水备用； 0042 （2） 碱膨胀。

25、： 向不锈钢转鼓中投入按皮片重6.5的氢氧化钠， 超纯水调节液比至 5.0， 待氢氧化钠充分溶解后， 加入皮片， 碱膨胀作用4h， 检测医用纯化猪真皮的膨胀情况， 倾去碱液。 之后， 按上述碱膨胀工艺重复6次， 便得到碱膨胀纯化猪真皮； 0043 （3） 水洗： 加超纯水调节液比为5.0， 常温下水洗30min， 反复水洗5次， 倾去废液， 沥 水； 0044 （4） 酸膨胀： 将液比为5.0、 pH值为4.0的醋酸溶液投入不锈钢转鼓对皮片进行酸膨 胀处理10h， 检测纯化猪真皮的膨胀情况， 倾去酸液。 之后， 按上述工艺反复酸膨胀6次， 得到 酸膨胀纯化猪真皮； 0045 （5） 碳化二亚胺。

26、改性： 室温下将120mM 2-吗啉乙磺酸溶解在80% （v/v） 乙醇溶液中， 将经过反复碱、 酸膨胀处理后的医用纯化猪真皮浸泡在上述乙醇溶液中120min， 接着加入 60mM N-羟基琥珀酰亚胺和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐， 室温下搅拌反应 48h， 待反应结束后倾去废液， 接着用95的乙醇清洗30min， 反复清洗5次， 最后用PBS缓冲 液清洗12h， 反复清洗5次， 冷冻干燥备用； 0046 （6） 机械蓬松： 用喷枪将45热水均匀喷施于冻干医用纯化猪真皮皮片表面， 再用 塑料薄膜包裹密封静置150min， 接着用轧花机对皮片进行反复蓬松操作， 反复蓬松次数为6 次， 检查蓬松情况； 最后剂量为30KGy/h60Co所产生的射线消毒灭菌， 成型包装， 即为成 说 明 书 4/5 页 6 CN 104874012 B 6 品。 说 明 书 5/5 页 7 CN 104874012 B 7 。