交联引导组织再生膜及其制备方法.pdf

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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201510791523.7 (22)申请日 2015.11.17 A61L 27/36(2006.01) (71)申请人 深圳兰度生物材料有限公司 地址 518000 广东省深圳市南山区科技园南 区清华大学研究院 C309 (72)发明人 李丽花 朱勇军 钟梅玲 佘振定 谭荣伟 (74)专利代理机构 广州华进联合专利商标代理 有限公司 44224 代理人 生启 (54) 发明名称 交联引导组织再生膜及其制备方法 (57) 摘要 本发明公开了一种交联引导组织再生膜及其 制备方法， 制备方法包括如下步骤 ： 对哺乳动物 的皮肤进行预处理后得。

2、到真皮层皮片 ； 对真皮层 皮片依次进行脱细胞处理、 病毒灭活处理和致密 收缩处理， 得到交联引导组织再生膜前体 ； 将交 联引导组织再生膜前体置于 pH 为 2 7、 质量百 分浓度为 0.1 5的交联剂溶液中， 在 4 37下交联 1 小时 1 周， 交联反应结束后洗净， 预冷后冷冻干燥、 灭菌， 得到交联引导组织再生 膜。这种交联引导组织再生膜的制备方法通过对 真皮层皮片进行脱细胞处理、 病毒灭活处理和致 密收缩处理后再与交联剂进行交联， 得到的交联 引导组织再生膜的降解周期相对较长， 从而为骨 缺损组织修复与再生提供更加有效的、 更长时间 的空间支持。 (51)Int.Cl. (19)。

3、中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书2页 说明书7页 附图2页 CN 106693056 A 2017.05.24 CN 106693056 A 1.一种交联引导组织再生膜的制备方法， 其特征在于， 包括如下步骤： 对哺乳动物的皮肤进行预处理后得到真皮层皮片； 对所述真皮层皮片依次进行脱细胞处理、 病毒灭活处理和致密收缩处理， 得到交联引 导组织再生膜前体， 其中， 所述脱细胞处理的操作为： 对所述真皮层皮片依次进行低渗-高 渗盐处理、 酶处理以及去污剂处理； 以及 将所述交联引导组织再生膜前体置于pH为26、 质量百分浓度为0.15的交联剂 溶液中， 在437下交联。

4、1小时3天， 交联反应结束后洗净， 预冷后冷冻干燥、 灭菌， 得 到交联引导组织再生膜。 2.根据权利要求1所述的交联引导组织再生膜的制备方法， 其特征在于， 所述对哺乳动 物的皮肤进行预处理后得到真皮层皮片的操作为： 用机械法对所述哺乳动物的皮肤进行初 步脱脂及除毛， 接着用取皮机将所述哺乳动物的皮肤去掉0.1mm0.4mm的表皮与皮下脂肪 组织后制成厚度为0.2mm1mm的真皮层皮片。 3.根据权利要求2所述的交联引导组织再生膜的制备方法， 其特征在于， 所述哺乳动物 的皮肤为猪、 牛、 羊或马的皮肤。 4.根据权利要求1所述的交联引导组织再生膜的制备方法， 其特征在于， 还包括在对所 述。

5、真皮层皮片依次进行脱细胞处理、 病毒灭活处理和致密收缩处理的操作之前， 将所述真 皮层皮片浸泡在08的抗生素溶液中过夜的操作； 所述抗生素溶液的溶质为青霉素-链霉素、 庆大霉素、 妥布霉素、 万古霉素或替考拉宁； 所述抗生素溶液的质量百分浓度为0.0010.1。 5.根据权利要求1所述的交联引导组织再生膜的制备方法， 其特征在于， 对所述真皮层 皮片依次进行脱细胞处理、 病毒灭活处理和致密收缩处理的操作中， 所述脱细胞处理的操 作具体为： 将所述真皮层皮片分别在质量百分浓度为0.10.9氯化钠和质量百分浓度 为1.010氯化钠溶液中循环浸泡1次3次， 每次浸泡的时间为4h12h， 再将所述真 。

6、皮层皮片浸泡在质量浓度为0.11.0的胰蛋白酶溶液或中性酶溶液中， 置于537 摇床中摇12h48h， 接着将所述真皮层皮片在质量浓度为0.11的去污剂溶液中5 37洗涤2次8次， 每次洗涤的时间为2h10h， 最后用PBS或者生理盐水清洗所述真 皮层皮片4次10次， 每次清洗的时间为2h10h； 其中， 所述去污剂为十二烷基磺酸钠、 曲 拉通或3-(3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基-1-丙磺酸。 6.根据权利要求1所述的交联引导组织再生膜的制备方法， 其特征在于， 对所述真皮层 皮片依次进行脱细胞处理、 病毒灭活处理和致密收缩处理的操作中， 所述病毒灭活处理的 操作具体为： 将所述真皮层皮片浸入。

7、质量百分浓度为0.55的过氧化氢的乙醇溶液或 过氧乙酸的乙醇溶液中， 室温下浸泡30min480min， 随后用纯水清洗， 并将所述真皮层皮 片按照上表皮层朝上、 下表皮真皮层朝下的方式固定后-80-20预冷2h12h， 最后冷 冻干燥24h48h， 其中， 所述过氧化物为过氧化氢或过氧乙酸。 7.根据权利要求1所述的交联引导组织再生膜的制备方法， 其特征在于， 所述病毒灭活 处理的操作具体为： 将所述真皮层皮片按照上表皮层朝上、 下表皮真皮层朝下的方式固定 后-80-20预冷2h12h， 接着冷冻干燥24h48h， 最后对冷冻干燥后的所述真皮层皮 片进行干热灭活， 所述干热灭活的温度为501。

8、20， 所述干热灭活的时间为3h48h。 8.根据权利要求1所述的交联引导组织再生膜的制备方法， 其特征在于， 对所述真皮层 权 利 要 求 书 1/2 页 2 CN 106693056 A 2 皮片依次进行脱细胞处理、 病毒灭活处理和致密收缩处理的操作中， 所述致密收缩处理的 操作具体为： 将所述真皮层皮片按照上表皮层朝上、 下表皮真皮层朝下的方式放置后以压 力为5MPa50MPa保压12h48h， 随后将所述真皮层皮浸没在丙酮中15min600min， 然后 干燥。 9.根据权利要求1所述的交联引导组织再生膜的制备方法， 其特征在于， 所述交联剂为 戊二醛、 1-乙基-3-3-二甲基氨基丙。

9、基碳化二亚胺盐酸盐、 京尼平、 D-核糖、 D-来苏糖、 D- 木糖、 L-鼠李糖、 树胶醛糖、 D-葡萄糖、 D-甘露糖、 D-半乳糖、 D-古洛糖和D-果糖中的一种。 10.一种交联引导组织再生膜， 其特征在于， 所述交联引导组织再生膜采用如权利要求 19中任一项所述的交联引导组织再生膜的制备方法制备得到。 权 利 要 求 书 2/2 页 3 CN 106693056 A 3 交联引导组织再生膜及其制备方法 技术领域 0001 本发明涉及医疗材料领域， 特别是涉及一种交联引导组织再生膜及其制备方法。 背景技术 0002 引导组织再生技术(Guided Tissue Regeneration。

10、， GTR)是目前能够有效治疗牙 周病的一种最为先进的治疗方法， 其技术关键是利用生物屏障膜即组织再生引导膜的空间 隔离作用， 防止牙龈上皮和结蹄组织细胞向根面迁移， 同时选择性地使牙周细胞和牙槽骨 细胞粘附于根面并分化形成牙周新附着， 因此引导膜的作用至关重要。 随着GTR技术在临床 越来越广泛的应用， 引导膜的类型及性能已成为制备其发展的关键因素。 0003 传统的临床所用的引导膜主要分为可吸收和不可吸收两类。 由于不可吸收引导膜 如膨化聚四氟乙烯植入后需要二次手术取出， 给病人带来不必要的痛苦和经济心理负担， 因此可吸收引导膜逐渐成为今后GTR发展的主要趋势。 目前用于临床的可降解材料以。

11、胶原 为主， 这主要是因为胶原本身是动物组织的组成成分， 因而具有良好的生物相容性和生物 活性。 但是胶原也存在明显的缺点， 力学性能差， 降解速度过快， 不能为受伤组织提供足够 的空间支持。 0004 对于交联引导组织再生膜， 主要的功能是提供缺损骨组织生长修复所需的足够时 间的空间支持， 这只要是因为牙槽骨的生长很缓慢， 通常需要4个月以上， 因而这就要求引 导膜在满足生物安全性的同时还必须尽可能的延长材料的降解性能， 为牙槽骨的修复提供 足够长时间的空间支持。 目前临床上主流产品胶原膜的降解周期为12个月， 但这与实际 的临床要求仍有较大差距。 发明内容 0005 基于此， 有必要提供一。

12、种降解周期相对较长的交联引导组织再生膜及其制备方 法。 0006 一种交联引导组织再生膜的制备方法， 包括如下步骤： 0007 对哺乳动物的皮肤进行预处理后得到真皮层皮片； 0008 对所述真皮层皮片依次进行脱细胞处理、 病毒灭活处理和致密收缩处理， 得到交 联引导组织再生膜前体， 其中， 所述脱细胞处理的操作为： 对所述真皮层皮片依次进行低 渗-高渗盐处理、 酶处理以及去污剂处理； 以及 0009 将所述交联引导组织再生膜前体置于pH为26、 质量百分浓度为0.15的交 联剂溶液中， 在437下交联1小时3天， 交联反应结束后洗净， 预冷后冷冻干燥、 灭 菌， 得到交联引导组织再生膜。 00。

13、10 在一个实施例中， 所述对哺乳动物的皮肤进行预处理后得到真皮层皮片的操作 为： 用机械法对所述哺乳动物的皮肤进行初步脱脂及除毛， 接着用取皮机将所述哺乳动物 的皮肤去掉0.1mm0.4mm的表皮与皮下脂肪组织后制成厚度为0.2mm1mm的真皮层皮片。 0011 在一个实施例中， 所述哺乳动物的皮肤为猪、 牛、 羊或马的皮肤。 说 明 书 1/7 页 4 CN 106693056 A 4 0012 在一个实施例中， 还包括在对所述真皮层皮片依次进行脱细胞处理、 病毒灭活处 理和致密收缩处理的操作之前， 将所述真皮层皮片浸泡在08的抗生素溶液中过夜的 操作； 0013 所述抗生素溶液的溶质为青。

14、霉素-链霉素、 庆大霉素、 妥布霉素、 万古霉素或替考 拉宁； 0014 所述抗生素溶液的质量百分浓度为0.0010.1。 0015 在一个实施例中， 对所述真皮层皮片依次进行脱细胞处理、 病毒灭活处理和致密 收缩处理的操作中， 所述脱细胞处理的操作具体为： 将所述真皮层皮片分别在质量百分浓 度为0.10.9氯化钠和质量百分浓度为1.010氯化钠溶液中循环浸泡1次3 次， 每次浸泡的时间为4h12h， 再将所述真皮层皮片浸泡在质量浓度为0.11.0的胰 蛋白酶溶液或中性酶溶液中， 置于537摇床中摇12h48h， 接着将所述真皮层皮片在 质量浓度为0.11的去污剂溶液中537洗涤2次8次， 每。

15、次洗涤的时间为2h 10h， 最后用PBS或者生理盐水清洗所述真皮层皮片4次10次， 每次清洗的时间为2h10h； 其中， 所述去污剂为十二烷基磺酸钠、 曲拉通或3-(3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基-1-丙磺 酸。 0016 在一个实施例中， 对所述真皮层皮片依次进行脱细胞处理、 病毒灭活处理和致密 收缩处理的操作中， 所述病毒灭活处理的操作具体为： 将所述真皮层皮片浸入质量百分浓 度为0.55的过氧化氢的乙醇溶液或过氧乙酸的乙醇溶液中， 室温下浸泡30min 480min， 随后用纯水清洗， 并将所述真皮层皮片按照上表皮层朝上、 下表皮真皮层朝下的方 式固定后-80-20预冷2h12h， 最后。

16、冷冻干燥24h48h， 其中， 所述过氧化物为过氧 化氢或过氧乙酸。 0017 在一个实施例中， 所述病毒灭活处理的操作具体为： 将所述真皮层皮片按照上表 皮层朝上、 下表皮真皮层朝下的方式固定后-80-20预冷2h12h， 接着冷冻干燥24h 48h， 最后对冷冻干燥后的所述真皮层皮片进行干热灭活， 所述干热灭活的温度为50 120， 所述干热灭活的时间为3h48h。 0018 在一个实施例中， 对所述真皮层皮片依次进行脱细胞处理、 病毒灭活处理和致密 收缩处理的操作中， 所述致密收缩处理的操作具体为： 将所述真皮层皮片按照上表皮层朝 上、 下表皮真皮层朝下的方式放置后以压力为5MPa50M。

17、Pa保压12h48h， 随后将所述真皮 层皮浸没在丙酮中15min600min， 然后干燥。 0019 在一个实施例中， 所述交联剂为戊二醛、 1-乙基-3-3-二甲基氨基丙基碳化二亚 胺盐酸化物(EDC)、 京尼平、 D-核糖、 D-来苏糖、 D-木糖、 L-鼠李糖、 树胶醛糖、 D-葡萄糖、 D-甘 露糖、 D-半乳糖、 D-古洛糖和D-果糖中的一种。 0020 一种交联引导组织再生膜， 采用上述的交联引导组织再生膜的制备方法制备得 到。 0021 这种交联引导组织再生膜的制备方法通过对真皮层皮片进行脱细胞处理、 病毒灭 活处理和致密收缩处理， 得到了交联引导组织再生膜前体再与交联剂进行交。

18、联， 得到的交 联引导组织再生膜。 相对于传统的胶原成分的交联引导组织再生膜， 这种交联引导组织再 生膜的降解周期相对较长， 从而为骨缺损组织修复与再生提供更加有效的、 更长时间的空 间支持。 说 明 书 2/7 页 5 CN 106693056 A 5 附图说明 0022 图1为一实施方式的交联引导组织再生膜的制备方法的流程图； 0023 图2是实施例1制得的交联引导组织再生膜的光滑面的扫描电子显微镜照片； 0024 图3是实施例1制得的交联引导组织再生膜的粗糙面的扫描电子显微镜照片； 0025 图4为实施例1、 2、 3制得的交联引导组织再生膜与Bio-Gide胶原膜在胶原酶溶液 中的降解。

19、性能比较的实验结果图。 具体实施方式 0026 下面主要结合附图及具体实施例对交联引导组织再生膜及其制备方法作进一步 详细的说明。 0027 如图1所示的交联引导组织再生膜的制备方法， 包括如下步骤： 0028 S10、 对哺乳动物的皮肤进行预处理后得到真皮层皮片。 0029 对哺乳动物的皮肤进行预处理后得到真皮层皮片的操作为： 用机械法对哺乳动物 的皮肤进行初步脱脂及除毛， 接着用取皮机将哺乳动物的皮肤去掉0.1mm0.4mm的表皮与 皮下脂肪组织后制成厚度为0.2mm1mm的真皮层皮片。 0030 一般的， 可以将真皮层皮片剪成3cm6cm5cm10cm大小的皮片。 0031 哺乳动物的皮。

20、肤包括依次层叠的皮毛、 表皮层、 真皮层和皮下组织。 0032 具体的， 哺乳动物的皮肤为猪、 牛、 羊或马的皮肤。 优选的， 哺乳动物的皮肤为猪、 牛、 羊或马的腹部皮肤。 0033 得到的真皮层皮片可以低温储存备用。 具体的， 得到的真皮层皮片可以储存在-20 下备用。 0034 S10还包括将预处理后的得到真皮层皮片浸泡在08的抗生素溶液中过夜的 操作。 0035 抗生素溶液的溶质为青霉素-链霉素、 庆大霉素、 妥布霉素、 万古霉素或替考拉宁。 其中， 青霉素-链霉素为青霉素和链霉素按照质量比为3： 5形成的混合物。 0036 抗生素溶液的质量百分浓度为0.0010.1。 0037 S2。

21、0、 对S10得到的真皮层皮片依次进行脱细胞处理、 病毒灭活处理和致密收缩处 理， 得到交联引导组织再生膜前体。 0038 得到的交联引导组织再生膜前体具有光滑面与粗糙面的两面结构。 0039 脱细胞处理的操作为： 对真皮层皮片依次进行低渗-高渗盐处理、 酶处理以及去污 剂处理。 0040 具体的， 脱细胞处理的操作为： 将真皮层皮片分别在质量百分浓度为0.1 0.9氯化钠和质量百分浓度为1.010氯化钠溶液中循环浸泡1次3次， 每次浸泡的 时间为4h12h， 再将真皮层皮片浸泡在质量浓度为0.11.0的胰蛋白酶溶液或中性 酶溶液中， 置于537摇床中消化12h48h， 接着将真皮层皮片在质量。

22、浓度为0.1 1的去污剂溶液中537洗涤2次4次， 每次洗涤的时间为2h4h， 最后用PBS或者生 理盐水清洗真皮层皮片4次10次， 每次清洗的时间为2h6h。 其中， 去污剂为十二烷基磺 酸钠、 曲拉通或3-(3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基-1-丙磺酸。 说 明 书 3/7 页 6 CN 106693056 A 6 0041 脱细胞处理的操作为： 对真皮层皮片进行灭活处理后， 将经过灭活处理的真皮层 皮片按照上表皮层朝上、 下表皮真皮层朝下的方式置于低温冰箱中预冷后冷冻干燥。 0042 具体的， 病毒灭活处理的操作为： 将真皮层皮片浸入质量百分浓度为0.55 的过氧化氢的乙醇溶液或过氧乙酸的乙。

23、醇溶液中， 室温下浸泡30min480min， 随后用纯水 清洗， 并将真皮层皮片按照上表皮层朝上、 下表皮真皮层朝下的方式固定后-80-20 预冷2h12h， 最后冷冻干燥24h48h。 其中， 过氧化物为过氧化氢或过氧乙酸。 0043 或者， 病毒灭活处理的操作具体为： 将真皮层皮片按照上表皮层朝上、 下表皮真皮 层朝下的方式固定后-80-20预冷2h12h， 接着冷冻干燥24h48h， 最后对冷冻干燥 后的真皮层皮片进行干热灭活。 其中， 干热灭活的温度为50120， 干热灭活的时间为 3h48h。 0044 具体的， 致密收缩处理的操作为： 将真皮层皮片按照上表皮层朝上、 下表皮真皮层。

24、 朝下的方式放置后以压力为5MPa50MPa保压12h36h， 随后将真皮层皮浸没在丙酮中 15min600min， 最后干燥。 0045 S30、 将S20得到的交联引导组织再生膜前体置于pH为26、 质量百分浓度为0.1 5.0的交联剂溶液中， 在437下交联1小时3天， 交联反应结束后洗净， 预冷后冷 冻干燥、 灭菌， 得到交联引导组织再生膜。 0046 交联剂可以为戊二醛、 1-乙基-3-3-二甲基氨基丙基碳化二亚胺盐酸化物 (EDC)、 京尼平、 D-核糖、 D-来苏糖、 D-木糖、 L-鼠李糖、 树胶醛糖、 D-葡萄糖、 D-甘露糖、 D-半 乳糖、 D-古洛糖和D-果糖中至少一种。

25、。 0047 S30中， 预冷后冷冻干燥、 灭菌的操作中， 预冷的温度为-80-20， 预冷的时间 为2h12h， 冷冻干燥的时间为24h48h， 灭菌可以为钴60灭菌或电子辐照灭菌。 0048 这种交联引导组织再生膜的制备方法通过对真皮层皮片进行脱细胞处理、 病毒灭 活处理和致密收缩处理， 得到了交联引导组织再生膜前体再与交联剂进行交联， 得到的交 联引导组织再生膜。 相对于传统的胶原成分的交联引导组织再生膜， 这种交联引导组织再 生膜的降解周期相对较长， 从而为骨缺损组织修复与再生提供更加有效的、 更长时间的空 间支持。 0049 这种交联引导组织再生膜的制备方法采用低渗-高渗联合酶处理工。

26、艺， 具有脱细 胞彻底、 且对组织细胞外基质天然结构的损害轻， 保持了胶原纤维支架的完整性， 有利于后 期细胞的粘附与生长。 0050 这种交联引导组织再生膜的制备方法采用致密收缩处理工艺， 制备得到的引导膜 具有光滑面与粗糙面的两面结构， 具有天然的三维空间结构与良好的机械性能， 能够为新 生牙周组织提供充足的空间。 0051 一实施方式的交联引导组织再生膜， 采用上述的交联引导组织再生膜的制备方法 制备得到。 0052 这种交联引导组织再生膜通过上述的方法制备而成， 通过采用酶与表面活性剂交 替处理， 处理过程中对真皮的支架结构破坏较小， 能很好的保证纤维支架的完整性， 有利于 后期细胞的。

27、粘附与生长。 0053 这种交联引导组织再生膜通过上述的方法制备而成， 通过对真皮层皮片进行脱细 胞处理、 病毒灭活处理和致密收缩处理， 得到了交联引导组织再生膜前体再与交联剂进行 说 明 书 4/7 页 7 CN 106693056 A 7 交联， 得到的交联引导组织再生膜。 相对于传统的胶原成分的交联引导组织再生膜， 这种交 联引导组织再生膜的降解周期相对较长， 从而为骨缺损组织修复与再生提供更加有效的、 更长时间的空间支持。 0054 下面为具体实施例。 0055 实施例1 0056 (1)真皮层皮片的制备 0057 将健康猪的整张腹部皮用机械法进行初步脱脂， 用镊子把毛剔除干净， 用电。

28、动取 皮机先将猪皮的皮下组织去掉， 再去掉表皮0.4mm， 制成厚度为0.3mm的真皮层皮片， 再浸泡 在质量浓度为0.01的青霉素-链霉素的水溶液中， 置入4冰箱过夜后转入-25低温冰 箱冷冻保存备用。 0058 (2)交联引导组织再生膜前体的制备 0059 脱细胞处理： 将解冻后的真皮层皮片依次用质量浓度为0.1氯化钠(低渗盐)和 质量浓度为1.0氯化钠(高渗盐)溶液循环浸泡2次， 6h/次， 通过低渗溶液处理促使组织吸 水膨胀， 从而使组织中的细胞破裂， 同时组织中的胶原纤维结构松开， 从而使胶原束变得疏 松， 再通过高渗盐溶液处理破碎细胞的DNA从组织蛋白中分离出来； 再将真皮层皮片浸。

29、泡在 质量浓度为0.25的胰蛋白酶溶液中， 置于30摇床中24h， 清洗掉组织中去除组织残留的 细胞碎片和细胞核； 随后将真皮层皮片在0.1的十二烷基磺酸钠溶液， 35洗涤3次， 2h/ 次， 以去除组织中残留的细胞和细胞核， 彻底祛除组织的免疫原性， 同时可以达到一定的去 除组织中脂肪的效果； 最后用PBS洗涤6次， 2h/次。 0060 病毒灭活处理： 将脱细胞处理后的真皮层皮片浸入质量浓度为2过氧乙酸的乙 醇溶液中， 室温下浸泡30min， 随后用纯水清洗至PH7.4， 最后将真皮层皮片平铺于聚四氟乙 烯模具中， 其中上表皮层朝上， 下表皮真皮层朝下， 置于-80低温冰箱预冷4h后立即转。

30、入 冷冻干燥机中进行干燥24h。 0061 致密收缩处理： 将冻干后的真皮层皮片按上表皮层朝上， 下表皮真皮层朝下平铺 于不锈钢平板上， 置于压片机中以压力20MPa保压24h， 随后将模压后的引导膜先浸没在丙 酮中30min， 然后干燥除去残留的有机溶剂。 0062 (3)交联引导组织再生膜的制备。 0063 将(2)得到的交联引导组织再生膜前体置于pH为3、 质量百分浓度为3的交联剂 溶液中， 在28下交联3天， 交联反应结束后洗净， -80预冷2h后冷冻干燥48h、 电子辐照灭 菌， 得到交联引导组织再生膜。 其中， 交联剂为D-核糖。 0064 将实施例1制得的交联引导组织再生膜在扫描。

31、电子显微镜(SEM)下观察， 得到图2 和图3。 0065 由图2和图3可以看出， 实施例1制得的交联引导组织再生膜具有良好的胶原纤维 支架结构， 光滑面致密， 粗糙面为多孔纤维结构， 有利于后期成骨细胞在粗糙面的粘附与生 长。 0066 实施例2 0067 (1)真皮层皮片的制备 0068 将健康猪的整张腹部皮用机械法进行初步脱脂， 用镊子把毛剔除干净， 用电动取 皮机先将猪皮的皮下组织去掉， 再去掉表皮0.1mm， 制成厚度为0.9mm的真皮层皮片， ， 再浸 说 明 书 5/7 页 8 CN 106693056 A 8 泡在质量浓度为0.1的庆大霉素的水溶液中， 置入4冰箱过夜后转入-2。

32、5低温冰箱冷 冻保存备用。 0069 (2)交联引导组织再生膜前体的制备 0070 脱细胞处理： 将解冻后的真皮层皮片依次用质量浓度为0.9氯化钠(低渗盐)和 质量浓度为9.0氯化钠(高渗盐)溶液循环浸泡3次， 4h/次， 通过低渗溶液处理促使组织吸 水膨胀， 从而使组织中的细胞破裂， 同时组织中的胶原纤维结构松开， 从而使胶原束变得疏 松， 再通过高渗盐溶液处理破碎细胞的DNA从组织蛋白中分离出来； 再将真皮层皮片浸泡在 质量浓度为0.1的中性酶溶液中， 置于35摇床中24h， 清洗掉组织中去除组织残留的细 胞碎片和细胞核； 随后将真皮层皮片在0.1的曲拉通溶液， 35洗涤4次， 4h/次，。

33、 以去除组 织中残留的细胞和细胞核， 彻底祛除组织的免疫原性， 同时可以达到一定的去除组织中脂 肪的效果； 最后用生理盐水洗涤4次， 6h/次。 0071 病毒灭活处理： 将脱细胞处理后的真皮层皮片浸入质量浓度为0.5过氧乙酸的 乙醇溶液中， 室温下浸泡240min， 随后用纯水清洗后将真皮层皮片平铺于聚四氟乙烯模具 中， 其中上表皮层朝上， 下表皮真皮层朝下， 置于-80低温冰箱预冷4h后立即转入冷冻干 燥机中进行干燥24h。 0072 致密收缩处理： 将冻干后的真皮层皮片按上表皮层朝上， 下表皮真皮层朝下平铺 于不锈钢平板上， 置于压片机中以压力5MPa保压48h， 随后将模压后的引导膜先。

34、浸没在丙酮 中300min， 最后干燥除去残留的有机溶剂。 0073 (3)交联引导组织再生膜的制备 0074 将(2)得到的交联引导组织再生膜前体置于pH为6、 质量百分浓度为0.5的交联 剂溶液中， 在4下交联1天， 交联反应结束后洗净， -20预冷12h后冷冻干燥24h、 电子辐照 灭菌， 得到交联引导组织再生膜。 其中， 交联剂为1-乙基-3-3-二甲基氨基丙基碳化二亚 胺盐酸化物(EDC)。 0075 实施例3 0076 (1)真皮层皮片的制备 0077 将健康猪的整张腹部皮用机械法进行初步脱脂， 用镊子把毛剔除干净， 用电动取 皮机先将猪皮的皮下组织去掉， 再去掉表皮0.2mm， 。

35、制成厚度为0.5mm的真皮层皮片， 再浸泡 在质量浓度为0.1的妥布霉素的水溶液中， 置入4冰箱过夜后转入-25低温冰箱冷冻 保存备用。 0078 (2)交联引导组织再生膜前体的制备 0079 脱细胞处理： 将解冻后的真皮层皮片依次用质量浓度为0.5氯化钠(低渗盐)和 质量浓度为5.0氯化钠(高渗盐)溶液循环浸泡3次， 12h/次， 通过低渗溶液处理促使组织 吸水膨胀， 从而使组织中的细胞破裂， 同时组织中的胶原纤维结构松开， 从而使胶原束变得 疏松， 再通过高渗盐溶液处理破碎细胞的DNA从组织蛋白中分离出来； 再将真皮层皮片浸泡 在质量浓度为1的胰蛋白酶溶液中， 置于25摇床中36h， 清洗。

36、掉组织中去除组织残留的 细胞碎片和细胞核； 随后将真皮层皮片在1的3-(3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基-1-丙磺 酸溶液， 35洗涤3次， 2h/次， 以去除组织中残留的细胞和细胞核， 彻底祛除组织的免疫原 性， 同时可以达到一定的去除组织中脂肪的效果； 最后用PBS洗涤6次， 2h/次。 0080 病毒灭活处理： 将脱细胞处理后的真皮层皮片平铺于聚四氟乙烯模具中， 其中上 说 明 书 6/7 页 9 CN 106693056 A 9 表皮层朝上， 下表皮真皮层朝下， 置于-20低温冰箱预冷12h后立即转入冷冻干燥机中进 行干燥36h， 然后在100干热灭菌12h。 0081 致密收缩处理： 将。

37、冻干后的真皮层皮片按上表皮层朝上， 下表皮真皮层朝下平铺 于不锈钢平板上， 置于压片机中以压力50MPa保压12h， 随后将模压后的引导膜先浸没在丙 酮中480min， 最后真空干燥除去残留的有机溶剂。 0082 (3)交联引导组织再生膜的制备 0083 将(2)得到的交联引导组织再生膜前体置于pH为5、 质量百分浓度为0.25的交联 剂溶液中， 在37下交联2h， 交联反应结束后洗净， -50预冷6h后冷冻干燥36h、 钴60灭菌 灭菌， 得到交联引导组织再生膜。 其中， 交联剂为戊二醛。 0084 将实施例13制得的交联引导组织再生膜与商用Bio-Gide胶原膜(Geistlich Pha。

38、rma AG， Switzerland， REF 30802.6)在浓度为80单位/mL的胶原酶(sigma， 货号C0130， 来源于溶组织梭菌)中， 37下降解24小时， 比较各自的酶降解性能， 得到图4。 0085 由图4可以看出， 实施例13制得的交联引导组织再生膜的具有更优的耐胶原酶 降解性能， 因而具有更长的降解时间。 0086 以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式， 其描述较为具体和详细， 但并 不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。 应当指出的是， 对于本领域的普通技术人员 来说， 在不脱离本发明构思的前提下， 还可以做出若干变形和改进， 这些都属于本发明的保 护范围。 因此， 本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。 说 明 书 7/7 页 10 CN 106693056 A 10 图1 图2 说 明 书 附 图 1/2 页 11 CN 106693056 A 11 图3 图4 说 明 书 附 图 2/2 页 12 CN 106693056 A 12 。