口腔内疾病的预防、 改善或治疗剂 【技术领域】
本发明涉及一种龋齿或牙周炎等口腔内疾病的预防、 改善或治疗剂。背景技术 口腔内微生物群由 400 ～ 500 种微生物构成。因此， 口腔内存在龋齿菌、 牙周病菌 及念珠菌等各种病原微生物， 引发龋齿病、 牙周疾病、 舌炎、 鹅口疮、 口腔念珠菌病等各种疾 病。此外， 据报道， 最近有研究发现， 念珠菌也与牙周病有关。
因此， 迄今， 已有多项关于添加有抗菌物质的口腔用组合物的技术方案提出。但 是， 即使向口腔内投入抗菌剂， 抗菌剂会在短时间内被唾液、 食物冲走， 其效果只能说是一 过性的。
此外， 近年来， 鉴于乳酸菌在大肠内抑制各种疾病的原因菌， 人们研究将该方法应 用到牙科疾病中。例如， 有报告指出， 唾液乳酸杆菌 ( 专利文献 1、 专利文献 2)、 罗伊氏乳酸 杆菌 ( 专利文献 3、 专利文献 4)、 副干酪乳杆菌 ( 专利文献 5)、 德氏乳酸杆菌 ( 专利文献 6)、 发酵乳酸杆菌 ( 非专利文献 1) 等乳酸菌对龋齿、 牙周病的预防有效。
然而， 即使是对龋齿菌、 牙周病菌显示出抗菌力的乳酸菌， 也存在抗菌谱窄， 发酵 能力不充分、 从而不能得到良好的发酵物， 得不到风味良好、 嗜好性优异的发酵物的问题。
专利文献
专利文献 1 ： WO2002/016554
专利文献 2 ： WO2003/082027
专利文献 3 ： 特开 2003-299480 号公报
专利文献 4 ： 特开 2008-502360 号公报
专利文献 5 ： 特开 2008-37859 号公报
专利文献 6 ： 特开 2008-237198 号公报
非专利文献
专利文献 1 ： 三村纯代、 二川浩树、 牧平清超、 桧山 AYA， 高本祐子， 日本齿科技工学 会志， 第 29 卷特别号， 298(2008)
发明内容 本发明涉及提供一种对口腔内疾病的原因菌的抗菌谱广， 能制造风味良好、 嗜好 性优异的发酵物的新型乳酸菌株， 以及用其制成的食品、 口腔内疾病的预防、 改善或治疗 剂。
本发明者对口腔内微生物进行了深入的研究， 结果发现， 存在于唾液中的属于鼠 李糖乳杆菌、 干酪乳杆菌及副干酪乳杆菌的特定乳酸菌株对龋齿菌、 牙周病菌及念珠菌均 有优异的抗菌力， 且用其可以制造出嗜好性优异的发酵物。
即， 本发明涉及以下 1) ～ 8)。
1. 口腔内疾病的预防、 改善或治疗剂， 其以选自鼠李糖乳杆菌 (Lactobacillus
rhamnosus)KO3 菌株 (NITE BP-771)、 干酪乳杆菌 (Lactobacillus casei)YU3 菌株 (NITE BP-772) 及副干酪乳杆菌 (Lactobacillus paracasei)YU4 菌株 (NITE BP-775) 中的 1 种以 上乳酸菌的菌体或菌体培养物或它们的提取物为有效成分。
2. 食品， 其含有选自鼠李糖乳杆菌 (Lactobacillus rhamnosus)KO3 菌株 (NITE BP-771)、 干酪乳杆菌 (Lactobacillus casei)YU3 菌株 (NITE BP-772) 及副干酪乳杆菌 (Lactobacillus paracasei)YU4 菌株 (NITE BP-775) 中的 1 种以上乳酸菌的菌体或菌体培 养物或它们的提取物。
3. 上述 2 的食品， 其为发酵乳或发酵饮料。
4. 龋 齿 菌、 牙 周 病 菌 和 念 珠 菌 的 增 殖 抑 制 剂， 其以选自鼠李糖乳杆菌 (Lactobacillus rhamnosus)KO3 菌株 (NITE BP-771)、 干酪乳杆菌 (Lactobacillus casei) YU3 菌 株 (NITE BP-772) 及 副 干 酪 乳 杆 菌 (Lactobacillus paracasei)YU4 菌 株 (NITE BP-775) 中的 1 种以上乳酸菌的菌体或菌体培养物或它们的提取物为有效成分。
5.4 所述的龋齿菌、 牙周病菌和念珠菌的增殖抑制剂， 其中， 所述龋齿菌、 牙周病 菌和念珠菌至少为变形链球菌 (Streptococcus mutans)、 远缘链球菌 (Streptococcus sobrinus)、 牙 龈 卟 啉 单 胞 菌 (Porphyromonas gingivalis) 及 白 色 念 珠 菌 (Candida albicans)。
6. 保藏在独立行政法人制品评价技术基盘机构特许微生物寄托中心的保藏号为 NITE BP-771 的鼠李糖乳杆菌 (Lactobacillus rhamnosus)KO3 菌株、 保藏号为 NITE BP-772 的干酪乳杆菌 (Lactobacillus casei)YU3 菌株及保藏号为 NITE BP-775 的副干酪乳杆菌 (Lactobacillus paracasei)YU4 菌株。
7. 乳酸菌的菌体或菌体培养物或它们的提取物， 其用作口腔内疾病的预防、 改 善或治疗剂， 所述乳酸菌选自鼠李糖乳杆菌 (Lactobacillus rhamnosus)KO3 菌株 (NITE BP-771)、 干酪乳杆菌 (Lactobacillus casei)YU3 菌株 (NITE BP-772) 及副干酪乳杆菌 (Lactobacillus paracasei)YU4 菌株 (NITE BP-775) 中的 1 种以上。
8. 口腔内疾病的预防、 改善或治疗方法， 其包括给予或摄取选自鼠李糖乳杆菌 (Lactobacillus rhamnosus)KO3 菌株 (NITE BP-771)、 干酪乳杆菌 (Lactobacillus casei) YU3 菌 株 (NITE BP-772) 及 副 干 酪 乳 杆 菌 (Lactobacillus paracasei)YU4 菌 株 (NITE BP-775) 中的 1 种以上乳酸菌的菌体或菌体培养物或它们的提取物。
根据本发明， 可提供一种能发挥预防、 改善或治疗龋齿病、 牙周疾病、 舌炎、 鹅口 疮、 口腔念珠菌等各种口腔内疾病效果的嗜好性高的食品、 药品、 口腔内组合物等。 附图说明
图 1a 是显示对 Streptococcus mutans 的生长抑制效果的图表。 图 1b 是显示对 Streptococcus mutans 的生长抑制效果的图表。 图 2 是显示对 Streptococcus sobrinus 的生长抑制效果的图表。 图 3a 是显示对 Porphyromonas gingivalis 的生长抑制效果的图表。 图 3b 是显示对 Porphyromonas gingivalis 的生长抑制效果的图表。 图 4a 是显示对 Candida albicans 的生长抑制效果的图表。 图 4b 是显示对 Candida albicans 的生长抑制效果的图表。图 5 是显示对 Candida albicans 的生物膜形成抑制效果的图表。
图 6 是显示对味道的评价结果 ( 视觉模拟评分 (VAS) 法 ) 的图表。
图 7 是 显 示 酸 奶 的 抗 菌 作 用 的 图 表。(A) ： S.mutans ingbritt 菌 株、 (B) ： S.sobirinus B13 菌株
图 8a 是显示人口腔内的龋齿菌及牙周病菌的菌数减少效果的图表。 (A) ： 龋齿菌， (B) ： P.intermedia(Pi)
图 8b 是 显 示 人 口 腔 内 的 龋 齿 菌 及 牙 周 病 菌 的 菌 数 减 少 效 果 的 图 表。(C) ： T.forsythensis(Tf)， (D) ： F.nucleatum(Fuso) 具体实施方式
用于本发明的发酵乳的乳酸菌为属于鼠李糖乳杆菌、 干酪乳杆菌及副干酪乳杆菌 的乳酸菌株， 具体指保藏在独立行政法人制品评价技术基盘机构特许微生物寄托中心 ( 地 址 ： 292-0818 日本国千叶县木更津市 KAZUSA 镰足 2-5-8) 的保藏日为 2009 年 6 月 10 日、 保藏号为 NITE BP-771 的鼠李糖乳杆菌 (Lactobacillus rhamnosus)KO3 菌株、 保藏日 为 2009 年 6 月 10 日、 保藏号为 NITE BP-772 的干酪乳杆菌 (Lactobacillus casei)YU3 菌 株及保藏日为 2009 年 6 月 24 日、 保藏号为 NITE BP-775 的副干酪乳杆菌 (Lactobacillus paracasei)YU4 菌株。 KO3 菌株是由本发明者从人唾液中初次分离得到的， 由于其 16S rRNA 的碱基序列 和鼠李糖乳杆菌 (Lactobacillus rhamnosus) 菌株 IDCC 3201 的碱基序列在 1485/1485 间 显示出 100％的同源性， 革兰氏染色后在显微镜下呈现革兰氏阳性杆菌形态， 因此将其鉴定 为鼠李糖乳杆菌 (Lactobacillus rhamnosus)。KO3 菌株的主要菌学性质如下所示。
1) 革兰氏阳性乳酸杆菌， 2) 同型乳酸发酵， 3) 过氧化氢酶阴性， 4) 不形成芽孢， 5) 在好氧条件下也可培养， 6) 产生菌体外多糖类。
YU3 菌株是由本发明者从人唾液中初次分离得到的， 由于其 16S rRNA 的碱基序列 和干酪乳杆菌 (Lactobacillus casei)ATCC 334 的碱基序列在 1485/1485 间显示出 100％ 的同源性， 革兰氏染色后在显微镜下呈现革兰氏阳性杆菌的形态， 因此将其鉴定为干酪乳 杆菌 (Lactobacillus casei)。YU3 菌株的主要菌学性质如下所示。
1) 革兰氏阳性乳酸球菌， 2) 同型乳酸发酵， 3) 过氧化氢酶阴性， 4) 不形成芽孢， 5) 在好氧条件下也可培养， 6) 产生菌体外多糖类。
YU4 菌株是由本发明者从人唾液中初次分离得到的， 由于其 16S rRNA 的碱基序列 和副干酪乳杆菌 (Lactobacillus paracasei) 菌株 DJ1 16S 核糖体 RNA 基因的部分序列显 示 1477/1477(100％ ) 的同源性， 革兰氏染色后在显微镜下呈现革兰氏阳性杆菌的形态， 因 此将其鉴定为副干酪乳杆菌 (Lactobacillus paracasei)。YU4 菌株的主要菌学性质如下 所示。
1) 革兰氏阳性乳酸球菌， 2) 同型乳酸发酵， 3) 过氧化氢酶阴性， 4) 不形成芽孢， 5) 在好氧条件下也可培养， 6) 产生菌体外多糖类。
在本发明中， 不仅可以直接使用将上述乳酸菌的菌体按乳酸菌培养的常法进行培 养、 从所得培养物中通过离心分离等集菌手段进行分离而得到的产物， 也可使用该培养发 酵液 ( 培养上清液 )、 其浓缩液或将菌体用酶、 物理方法处理后的细胞质、 细胞壁部分。此
外， 不仅可以是活菌体， 也可以是死菌体。
培养本发明的乳酸菌的培养基可以是果汁培养基、 蔬菜汁培养基、 牛奶培养基、 脱 脂奶粉培养基或含有奶成分的培养基、 不含奶成分的半合成培养基等培养基。此类培养基 可列举如将脱脂乳还原后加热灭菌而得到的还原脱脂乳培养基、 添加有酵母浸膏的脱脂奶 粉培养基、 MRS 培养基、 GAM 培养基等。
培养方法只要是静置培养、 将 pH 保持一定的中和培养、 批次培养和连续培养等， 具有使菌体良好生长的条件， 则无特殊限制。
本发明的乳酸菌的菌体或菌体培养物的提取物是指菌体或菌体培养物通过溶剂 提取而得到的各种溶剂提取液、 其稀释液、 其浓缩液或其干燥粉末。
作为用于得到本发明的提取物的提取溶剂， 极性溶剂、 非极性溶剂均可使用， 也可 将其混合使用。可列举如， 水； 甲醇、 乙醇、 丙醇、 丁醇等醇类 ； 丙二醇、 丁二醇等多元醇类 ； 丙酮、 甲基乙基酮等酮类 ； 醋酸甲酯、 醋酸乙酯等酯类 ； 四氢呋喃、 乙醚等链状及环状醚类 ； 聚乙二醇等聚醚类 ； 己烷、 环己烷、 石油醚等烃类 ； 苯、 甲苯等芳香烃类 ； 吡啶类等。其中， 优 选醋酸乙酯等酯类、 乙醇等醇类。
提取条件视所用溶剂而异， 但优选为， 例如， 对于培养液 1 质量份， 用 1 ～ 10 质量 份的溶剂在 0 ～ 50℃， 优选 25 ～ 37℃的温度下提取 0.5 小时～ 3 小时。
上述提取物既可直接使用， 也可将该提取物稀释、 浓缩或冷冻干燥后， 根据需要调 制成粉末或糊状使用。此外， 还可用液液分配等技术适当精制后使用。
在本发明的口腔内疾病的预防、 改善或治疗剂中， “口腔内疾病” 是指由龋齿菌、 牙 周病菌及念珠菌所引发的口腔内疾病， 可列举如龋齿病 ； 牙龈炎、 牙周炎等牙周病、 舌炎、 鹅 口疮、 嘴角炎等口腔念珠菌病。
此 外， 作 为 龋 齿 菌， 可 列 举 出 变 形 链 球 菌 (Streptococcus mutans)、 远 缘 链 球 菌 (Streptococcus sobrinus)， 作 为 牙 周 病 菌， 可列举出牙龈卟啉单胞菌 (Porphyromonas gingivalis)、 中 间 普 氏 菌 (Prevotella intermedia)、 齿垢密螺旋体 (Treponema denticola)、 福赛斯坦纳菌 (Tannerella forsythensis)、 伴放线放线杆菌 (Actinobacillus actinomycetemcomitans)、 具核梭杆菌 (Fusobacterium nucleatum) 等， 作为念珠菌， 可列举出白色念珠菌 (Candida albicans)、 光滑念珠菌 (Candida glabrata)、 热带念珠菌 (Candida tropicalis) 等。
如 后 述 实 施 例 中 所 示， 本发明的乳酸菌对属于龋齿菌的变形链球菌 (Streptococcus mutans) 及 远 缘 链 球 菌 (Streptococcus sobrinus)， 属于牙周病菌的 牙 龈 卟 啉 单 胞 菌 (Porphyromonas gingivalis) 及 属 于 念 珠 菌 的 白 色 念 珠 菌 (Candida albicans) 均有增殖抑制效果。此外， 还有抑制作为口腔内的龈下牙垢形成菌而为人所知 的 Fusobacterium.nucleatum 等 Fusobacterium 属细菌增殖的作用。并且， 用该乳酸菌调 制成的发酵乳风味及口感好， 此外， 与现有的发酵乳中的其他乳酸菌， 如 Lactobacillus. bulgaricus 等共存时不会损害其风味， 或可使风味进一步改善。
因此， 该乳酸菌的菌体或菌体培养物或它们的提取物可作为口腔内疾病的预防、 改善或治疗剂或龋齿菌、 牙周病菌及念珠菌的增殖抑制剂。 这种口腔内疾病的预防、 改善或 治疗剂或龋齿菌、 牙周病菌及念珠菌的增殖抑制剂， 其自身即可作为食品、 药品、 口腔用组 合物使用， 用于由该口腔内的病原微生物所引起的龋齿病、 牙周病、 口腔念珠菌病等口腔内疾病的预防、 改善或治疗， 或用于龋齿菌、 牙周病菌及念珠菌的增殖抑制， 或者可作为调配 食品、 药品、 口腔用组合物用的原材料使用。此外， 也可将食品制成以龋齿、 牙周病、 其他口 腔疾内感染症的预防、 改善等为概念、 根据需要标示该内容的健康食品、 保健品或特定保健 用食品等功能性食品。
作为药品使用时的形式优选为口服给药形式， 其剂型可列举如液剂 ； 丸剂、 颗粒 剂、 细粒剂、 粉剂、 片剂等固体制剂 ； 或者封入有该液剂或固体制剂的胶囊剂、 口腔用喷雾、 含片等各种形式。为了调制上述各种剂型的药剂和保健品， 在不影响本发明菌体和培养物 的作用的范围内， 可将其他药学上允许的赋形剂、 粘合剂、 增量剂、 崩解剂、 表面活性剂、 润 滑剂、 分散剂、 缓冲剂、 防腐剂、 矫味剂、 香料、 包衣剂、 载体、 稀释剂等适当组合使用。
作为此类口服制剂使用时， 该制剂中本发明的乳酸菌的菌体或菌体培养物或它们 的提取物的含量占整个组成的 1 质量％～ 50 质量％， 优选占 10 质量％～ 20 质量％。
作为食品使用时的形式的例子， 除果汁或蔬菜汁饮料、 碳酸饮料、 茶类饮料、 含乳 饮料、 发酵乳、 发酵果汁、 发酵蔬菜汁、 酒精饮料、 清凉饮料等饮料， 啫喱状食品、 各种点心 类、 烘焙糖果、 蛋糕类、 巧克力、 果酱、 面包、 口香糖、 糖、 汤类、 酱菜、 咸烹海味等各类食品外， 还有与上述口服给药制剂相同形式 ( 丸剂、 胶囊、 糖浆等 ) 的保健品等。 本发明的乳酸菌的培养物可直接作为酸奶、 奶酪、 味噌、 酱油、 酱菜等发酵食品， 也 可将此类发酵乳、 奶酪用作原材料， 做成预防、 改善龋齿、 牙周病用的面包、 点心、 蛋糕等。
采用本发明的乳酸菌进行的发酵， 优选预先准备好发酵剂， 将其接种到发酵用原 料物质中使其发酵的方法。这里， 作为发酵剂的代表性例子有预先向经常规杀菌处理过的 发酵用原料物质 ( 如添加有酵母浸膏的 10％脱脂奶粉等 ) 中接种乳酸菌后培养得到的产 物。 发酵用原料物质中还可根据需要加入发酵促进物质， 如葡萄糖、 淀粉、 蔗糖、 乳糖、 糊精、 山梨糖醇、 果糖等碳源， 酵母浸膏、 蛋白胨等氮源， 维生素类、 矿物质类等。
乳酸菌的接种量一般以从 1mL 含有发酵用原料物质的液体中含有菌体约 1×106 个细胞以上、 优选 1×107 个细胞左右的含量中选择为宜。 培养条件一般从发酵温度 20-42℃ 左右， 优选 25-37℃左右， 发酵时间 5-72 小时左右中选择。 这样得到的乳酸发酵物具有卡片 状形态 ( 酸奶样形态 )， 该产品可直接作为固体食品。 该卡片状形态的乳酸发酵物可通过将 其进一步均质处理而得到所希望的饮料形式。
将本发明的口腔内疾病的预防、 改善或治疗剂等作为口腔用组合物使用时的具体 形式可列举如口腔清洗剂、 漱口水、 牙膏、 牙粉、 液体牙膏、 口腔用软膏剂、 凝胶剂、 丸剂、 颗 粒剂、 细粒剂、 粘性果冻、 含片、 片剂、 胶囊、 糖果、 口香糖等， 优选例子为牙膏、 口腔清洗剂、 粘性果冻、 含片。
对上述药品、 食品中的本发明的乳酸菌的含量无特殊限制， 根据一日给药量做适 6 当调节即可。例如， 剂型为液体时， 优选使乳酸菌菌体浓度为 1×10 个细胞 /ml ～ 1×108 个细胞 /ml， 固体时则优为 1×107 个细胞 /g ～ 1×1010 个细胞 /g。
将本发明的乳酸菌以活菌形式给药时， 优选按成人每人 1×108 ～ 5×1010cfu/ 日 进行给药。
以下给出实施例及试验例对本发明进行更详细的说明。
实施例制造例 1 乳酸菌菌体的调制
将 MRS 培 养 基 (Difco 公 司 ) 于 121 ℃ 灭 菌 20 分 钟 后， 接种鼠李糖乳杆菌 (Lactobacillus rhamnosus)KO3 菌株 ( 保藏号 NITE BP-77I， 2009 年 6 月 10 日在独立行政 法人制品评价技术基盘机构特许微生物寄托中心 ( 住址 ： 292-0818 日本国千叶县木更津 市 KAZUSA 镰足 2-5-8) 保藏 )， 于 37℃空气中培养 48 小时， 用蒸馏水、 超纯水、 缓冲液等清 洗后可得到菌体。
同样地， 将 MRS 培养基 (Difco 公司 ) 于 121 ℃灭菌 20 分钟后， 接种干酪乳杆菌 (Lactobacillus casei)YU3 菌株 ( 保藏号 NITE BP-772， 2009 年 6 月 10 日在独立行政法 人制品评价技术基盘机构特许微生物寄托中心 ( 住址 ： 292-0818 日本国千叶县木更津市 KAZUSA 镰足 2-5-8) 保藏 )， 于 37℃空气中培养 48 小时， 用蒸馏水、 超纯水、 缓冲液等清洗后 可得到菌体。
此外， 将 MRS 培养基 (Difco 公司 ) 于 121 ℃灭菌 20 分钟后， 接种副干酪乳杆菌 (Lactobacillus paracasei)YU4 菌株 ( 保藏号 NITE BP-775， 2009 年 6 月 24 日在独立行政 法人制品评价技术基盘机构特许微生物寄托中心 ( 住址 ： 292-0818 日本国千叶县木更津 市 KAZUSA 镰足 2-5-8) 保藏 )， 于 37℃空气中培养 48 小时， 用蒸馏水、 超纯水、 缓冲液等清 洗后可得到菌体。 另外， 用作比较的发酵乳杆菌 (Lactobacillus Fermentum) 使用上述非专利文献 1 中记载的从人口腔内采集的 Lactobacillus Fermentum SU3 菌株， 按与上述相同的方法进 行培养， 供试验。
试验例 1 对龋齿菌、 牙周病菌及念珠菌的抗菌作用
试验方法
将保存在 -80℃的各菌株于常温下解冻， 通过离心沉淀 (3000rpm×5min) 回收后， 用灭菌蒸馏水 (MQ 水 ) 清洗 2 次， 调节至 OD600 为 0.3( 约 1.0×109cfu/ml)。取各混悬液 500μl 接种到 15ml 的 MRS 肉汤或脑心浸液肉汤 ( 以下称 BHI 肉汤 ； Difco 公司产品 ) 中 后， 于 37℃静置培养 48 小时。然后， 以 3000rpm 离心沉淀 5 分钟 ( 室温 ) 后， 回收上清液， 用于抗菌测定。
< 受试菌株 >
作 为 龋 齿 菌 (mutans streptococci)， 使 用 Streptococcus mutans Ingbritt、 Streptococcus sobrinus B13。在这些菌的预培养中， 使用添加有 5％酵母浸膏 (Difco) 的胰酶大豆肉汤 ( 以下称 TSBY ； Difco 公司产品 ) 于 37℃培养 24 小时。然后， 使用用 MQ 水 清 洗 2 次 后 调 整 至 OD600 为 0.3(Streptococcus mutans Ingbritt， 1.0×108cfu/ml ； Streptococcus sobrinus B13， 1.0×108cfu/ml) 的菌液。
作为牙周病菌， 使用 Porphyromonas gingivalis 381 株， 在添加有 1 ％氯化血 红素及 0.2 ％维生素 K 的 GAM 培养基中于 37 ℃在装有 AneroPack(MCG) 的厌氧罐 (BBL， Cookeysville， USA)(10％ CO2) 中预培养 7 天。然后， 使用用磷酸缓冲液 (pH 7.4 ； PBS) 清 7 洗 2 次后调整至 OD600 为 0.3( 约 0.5×10 cfu/ml) 的菌液。
此外， 作为念珠菌， 使用 Candida albicans MYA274， 在沙氏葡萄糖肉汤 (Difco) 于 37℃预培养 24 小时。 然后， 使用用 MQ 水清洗 2 次后调整至 OD600 为 0.3(Candida albicans 7 MYA274 ； 1.0×10 个细胞 /ml) 的菌液。
< 抗菌测定 >
在 24 孔板上接种培养基 1ml、 各上清液 1ml、 用 OD600 调整至 0.3 的乳酸菌的菌混 悬液 50μl， 于 37℃培养 24 小时后测定浊度， 其中， 对于龋齿菌， 使用 TSBY， 对于牙周病菌， 使用添加有 1％氯化血红素及 0.2％维生素 K 的 GAM 培养基或 BHI 培养基， 对于念珠菌， 使用 沙氏肉汤。在 TSBY 或沙氏肉汤中添加与乳酸菌预培养中使用的培养基相同的培养基 1ml， 即 MRS 肉汤或 BHI 肉汤， 接种 OD600 调至 0.3 的菌混悬液 50μl， 将其作为对照。此外， 各上 清及对照分别制备 4 份同样的试料， 算出其平均值 ±SD。
结果示于图 1a 及 1b、 图 2、 图 3a 及 3b、 图 4a 及 4b。
YU3 菌 株、 YU4 菌 株 及 KO3 菌 株 对 Streptococcus mutans、 Streptococcus sobrinus、 Porphyromonas gingivalis、 Candida albicans 均显示出较高的增殖抑制效果。
此外， 其抗菌力也优于公知的 Lactobacillus Fermentum SU3 株。
试验例 2 生物膜抑制作用
用 Nikawa 等 1996 年的方法 (Nikawa， H.， Nishimura， H.Yamamoto， T.， Hamada， T.& Samaranayake， L.P. ： The role of saliva and serum in Candida albicans biofilm formation on denture acrylic surfaces.Microbial Ecol Health & Dis 9， 35-48， 1996.) 进行 Candida albicans 生物膜测定。用假牙床用树脂 (BioResin ； 京都松风公司产 品 ) 按厂家指示的混合液体比用通常方法聚合成 50×50×0.2mm 的树脂试料。用树脂刀将 其切成 10×10×0.2mm， 用于生物膜测定。
在 24 孔 板 底 面 放 置 树 脂 板， 添 加 人 血 清 (Type， Sigma co.human male AB plasma)500μl 于 37 ℃ 培 养 1 小 时。 随 后 去 除 人 血 清。 将 OD600 调 至 0.3 的 Candida albicans MYA274 菌株的混悬液 50μl 接种在试料表面， 于 37℃静置 2 小时， 促进固定。随 后添加 MRS 培养上清 1ml 和沙氏肉汤 1ml， 于 37℃培养 72 小时。轻轻地取出树脂， 不破坏 形成在试料表面的生物膜， 用 400ml 的 MQ 水清洗 5 秒钟， 去除剩余的菌。树脂试料上形成 的生物膜量通过提取 ATP 后用光度计 (AB2200Luminescencer PSN ； 东京 ATTO 公司产品 ) 对 ATP 定量来检测。用等量 MRS 肉汤代替乳酸菌培养上清， 作为对照。此外， 各上清及对照分 别制备 4 份同样的试料， 算出其平均值 ±SD。
结果示于图 5。
YU3 菌株、 YU4 菌株及 KO3 菌株强烈抑制了 Candida albicans 的生物膜形成。
实施例 1 发酵乳的制造 (1)
用 MRS 培养基于 37 ℃下培养鼠李糖杆菌 (Lactobacillus rhamnosus)KO3 菌株 (NITE BP-771)18 小时， 作为预培养液。用 MQ 水清洗 2 次后， 经离心分离回收菌。向加有 “达能酸奶” (Danone Japan 株式会社 ； 使用双歧杆菌 ) 的市售牛奶中添加清洗后的前述 KO3 菌株和乳糖， 使牛奶 100ml 中的乳糖含量为 0.1 ～ 10％， 于 37℃培养 24 小时， 得到发酵乳。
此外， 据认为， 少量添加 “达能酸奶” ( 使用双歧杆菌 ) 进行通常的培养时， 由于双 歧杆菌为专性厌氧菌， 只有酸奶中使用的发酵剂增殖。
试验例 3 发酵乳的评价 (1)
以 127 名受试者为对象， 按视觉模拟评分 (VAS) 法进行味道调查。食用完酸奶后， 在 10 厘米长的比例尺线上进行记录， 比例尺左端表示非常可口， 右端表示非常难吃， 中间 表示一般， 通过测定距左端的距离后取平均进行定量化。结果示于图 6。此外， 在同时进行的记载自由意见的统计中， 写 “可口” 、 “味道醇厚” 的人合计占到 72％， 由此得以确认， 本发明的发酵乳均具有良好味道。
实施例 2 发酵乳的制作 (2)
将含乳原材料均匀混合， 加热、 灭菌。冷却后， 以 S.thermophilus 作为发酵剂， 用 L.bulgaricus 和 L.rhamnosus KO3 菌株于 37 ～ 40℃进行发酵， 得到酸奶 (L8020)。此外， 以 S.thermophilus 作为发酵剂， 仅用 L.bulgaricus 制得空白对照酸奶。
试验例 4 发酵乳的评价 (2)
用实施例 2 中调制的 L8020 酸奶进行对龋齿菌的抗菌试验。
作为龋齿菌， 使用前述 S.mutans ingbritt 株和 S.sobirinus B13 株。各菌株用 TSBY 进行预培养后， 用灭菌蒸馏水清洗 3 次， 调至 1×108cfu/ml。向 24 孔板中分注 1.5mL 的 TSBY 后， 向各孔中接种 100μL 菌液。
在装有各酸奶的培养用筒状膜容器 (intercell) 放入 24 孔板中， 比较培养 24 小 时后的菌量。
将 24 小时后的菌量作为 ATP 进行测定。各样品制备相同的 4 份， 求出其平均值 ±SD。结果示于图 7。
图 7(A)、 (B) 中， 图表的纵轴表示 ATP 量 (pmol/ 孔 )， 经确认， 对于 Ingbritt 菌株 和对于 B-13 株， 在空白对照中均呈略为增加的趋势， 而在添加有 KO3 的 L8020 酸奶的状态 下， 也显示出有意义的抑制效果。
试验例 5 发酵乳的评价 (3)
用实施例 2 中调制的 L8020 酸奶进行了人体试验。
将 40 名 19 ～ 25 岁的受试者按随机数字表分成两组。第 1 组和第 2 组于每天午 餐时分别食用空白对照酸奶和 L8020 酸奶， 连续食用两周。
口腔内龋齿菌及牙周病菌的含菌数的计算方法是， 用 BML 的试剂盒采集唾液后， 对 于 龋 齿 菌， 使 用 培 养 法， 对 于 牙 周 病 菌， 就 P.intermedia(Pi)、 T.forsythensis(Tf)、 F.nucleatum(Fuso)4 个菌种用 PCR- 侵染法或侵染法进行定量。
唾液采集 ： 在试吃开始 3 天前通过咀嚼口香糖法在刺激 5 分钟后将唾液采集在冰 上， 算出上述各菌的口腔内含菌数， 作为上述试验的前值。
试吃 2 周后， 同样通过咀嚼口香糖法刺激后将约 5mL 的唾液采集在冰上， 算出上述 各菌的口腔内含菌数， 评价上述试验的效果， 将结果示于图 8。
从图 8(A) 可知， 以龋齿菌的口腔内含菌数的前值作为 100 时， 空白对照酸奶使其 降至 60％左右。另一方面， 使用 L8020 酸奶， 则有意义地减少至 15％左右。根据该结果可 知， 摄取 L8020 酸奶 2 周， 可有意义地且有效地减少龋齿菌的口腔内含菌数。
从图 (B) 可知， 以 Pi 菌的口腔内含菌数的前值作为 100 时， 空白对照酸奶使其增 至 180％左右。 另一方面， 使用 L8020 酸奶， 则有意义地减少至 50％左右。 根据该结果可知， 摄取 L8020 酸奶 2 周， 可有意义地且有效地减少 Pi 菌的口腔内含菌数。
从图 (C) 可知， 以 Tf 菌的口腔内含菌数的前值作为 100 时， 空白对照酸奶使其增 至 105％左右。 另一方面， 使用 L8020 酸奶， 则有意义地减少至 60％左右。 根据该结果可知， 摄取 L8020 酸奶 2 周， 可有意义地且有效地减少 Tf 菌的口腔内含菌数。
从图 8(D) 可知， 以 Fuso 菌的口腔内含菌数的前值作为 100 时， 空白对照酸奶使其增至 160％左右。另一方面， 使用 L8020 酸奶， 则有意义地减少至 60％左右。根据该结果可 知， 摄取 L8020 酸奶 2 周， 可有意义地且有效地减少 Tf 菌的口腔内含菌数。
此外， Pg 菌因含菌者少而未发现有意义的变化。
上述结果表明， L8020 酸奶使龋齿菌、 牙周病菌中的 Pi 菌、 Tf 菌、 作为龈下牙垢形 成菌而为人所知的 Fusobacterium 属细菌有意义地减少， 与普通的酸奶相比， 对与龋齿及 牙周病相关的细菌具有非常高的效果。