技术领域
本发明涉及骨科及口腔外科修复材料技术领域，特别涉及一种具有细胞外基质电学拓扑特征的带电复合膜及其制备方法。
背景技术
植入修复是目前治疗大范围组织缺损的主要手段。人工修复材料由于来源广泛、性能可控及成本低，在组织修复材料中受到广泛关注。根据仿生原理，皮肤创伤愈合、神经修复、骨缺损修复等均存在损伤电位，大量研究证实损伤电位对组织修复具有重要作用，因此，对于组织修复材料而言，使得材料带电将有利于促进组织快速愈合和功能修复。近年来电活性材料成为研究热点和趋势，也是组织修复材料设计的新思路。
然而，目前所用的电活性材料不具备天然细胞外基质纤维网络样电学拓扑结构特征，使得材料的电学特征与天然细胞外基质特征的匹配性差，导致材料的修复效果受限。
发明内容
本发明针对材料的电学特征与天然细胞外基质特征的匹配性差、材料的修复效果受限的技术问题，提供一种具有细胞外基质电学拓扑特征的带电复合膜及其制备方法。
为此，本发明提供一种具有细胞外基质电学拓扑特征的带电复合膜，所述具有细胞外基质电学拓扑特征的带电复合膜由高分子聚合物和压电纤维填料构成。
优选的，高分子聚合物的材质为铁电高分子聚偏氟乙烯(Polyvinylidene fluoride,PVDF)或聚偏氟-三氟乙烯(P(VDF-TrFE))的一种或其复合物；
优选的，压电纤维填料为压电活性纤维材料，所述压电活性纤维材料为钛酸钡纤维、氧化锌纤维、铌酸钾钠纤维等的一种或多种复合物。
优选的，所述带电复合膜为薄膜材料，其中所述带电复合膜的厚度为10μm～500μm。
优选的，所述具有细胞外基质电学拓扑特征的带电复合膜是一种薄膜状材料，膜厚为30-300μm，所述钛酸钡纤维在带电复合膜中的体积含量为5-15vol％。
本发明所述具有细胞外基质电学拓扑特征的带电复合膜的制备方法，所述铁电聚合物基体与压电纤维填料的复合成膜过程通过浇铸或流延法完成。具体的说，包括以下步骤：
(1)取一定量的冰醋酸和乙酰丙酮混合均匀，搅拌5min，制备冰醋酸与乙酰丙酮的混合溶剂，将醋酸钡加入到冰醋酸与乙酰丙酮的混合溶剂中，搅拌1小时，加入与醋酸钡相同摩尔量的钛酸四丁酯，搅拌15min，然后加入与醋酸钡质量比为9:32的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，搅拌3h。
(2)制备钛酸钡纳米纤维
将步骤(1)所得混合溶液注入注射器内，在电压10kV～16kV条件下，利用静电纺丝技术，获得直径为50nm～500nm的钛酸钡纳米纤维；
(3)将步骤(2)所得钛酸钡纳米纤维加入到0.01～0.1mol/L的多巴胺水溶液中，形成浓度范围为0.01～0.1g/mL的溶液，在40℃～80℃下搅拌6h～12h，然后再超声震荡1min～15min，离心洗涤3～5次，然后在功率为180W的条件下超声1～10min，分别得到长径比为8～20的钛酸钡纳米纤维填料；
(4)取步骤(3)所得钛酸钡纳米纤维填料，加入有机溶剂中，超声振荡并搅拌1h～3h，得到纤维填料分散液；有机溶剂选自氮氮二甲基甲酰胺(DMF)；本步骤所得纤维填料在有机溶剂中的质量百分比范围为1.5％～30％。
(5)称取铁电高分子聚合物，加入到有机溶剂DMF中，搅拌3h～6h至完全溶解，得到聚合物溶液；所得溶液的浓度为0.14g/ml，所述铁电高分子聚合物为P(VDF-TrFE)或PVDF。
(6)将步骤(4)中所得分散液加入步骤(5)所得聚合物溶液中，使得钛酸钡纤维填料在聚合物基体中的体积含量范围为1～20vol％，搅拌6h～12h使得纤维填料均匀分散在聚合物基体中，得到含有陶瓷纤维填料的聚合物混合液；
(7)取步骤(6)所得混合液于流延机中流延，将所得流延膜置于40℃～100℃温度下烘干，得到一种复合膜材料，膜厚为10μm～500μm；
(8)将步骤(7)所得膜材料经过极化处理，极化参数为：极化电压为1kV～30kV，极化距离为0mm～50mm，极化温度为25℃～150℃，极化时间为1min～60min，得到一种具有细胞外基质电学拓扑特征的带电复合膜。
优选的，步骤(1)所述冰醋酸与乙酰丙酮的混合溶剂中，冰醋酸与乙酰丙酮的体积质量比为9:1.34ml/g。
优选的，步骤(1)所述醋酸钡与冰醋酸的投料质量体积比为1.701:9g/ml。
铁电聚合物如聚偏氟乙烯(Polyvinylidene fluoride,PVDF)、聚偏氟-三氟乙烯(P(VDF-TrFE))等因具有内在的自发极化性能和生物相容性，目前广泛用于生物医用研究领域，同时具有良好的柔韧性和可加工性，使其具备良好的临床可操作性，成为当前带电生物医用材料的主要来源。为使材料具有天然细胞外基质纤维网络样电学拓扑结构特征，本发明将压电陶瓷钛酸钡纳米纤维无规则掺入实现材料与细胞/组织的电学适配。
本发明的有益效果为：
针对现有技术不足，本发明提供了一种具有细胞外基质电学拓扑特征的带电复合膜及其制备方法。
(1)本发明采用铁电聚合物和压电活性纤维填料为主要成分，形成的膜材料结构均一、纤维填料分布各向异性、性能稳定，具有良好柔性，临床可操作性强，详见附图1和附图2。
(2)本发明所制得的膜材料由于材料内在的自发极化特性，经过极化处理后可使膜材料表面带有一定的极化电荷，并可保持良好电学稳定性，而且由于纤维填料的结构特性和电势分布特征，使得复合膜表面具备天然细胞外基质电学拓扑特征，详见附图3和附图4
(3)本发明所制得的带电复合膜材料植入骨缺损后具有良好的诱导骨修复性能。详见附图6。
(4)本发明所采用的制备工艺简单，产率较高，可操作性强，能用于工业化生产。
综上所述，本发明所提供的一种具有细胞外基质电学拓扑特征的带电复合膜在宏观性能和微观结构上均具有良好的性能，在骨修复过程中，不仅可为骨缺损补偿适宜的电学微环境，而且可与宿主细胞和组织形成良好的电学适配性，促进新骨生成，同时不会发生组织粘连，避免材料残留，在临床适应性和诱导成骨适配性两方面得到双重改善。
附图说明
图1是实施例1所述具有细胞外基质电学拓扑特征的带电复合膜的实物照片。
图2是实施例1所述具有细胞外基质电学拓扑特征的带电复合膜的表面形貌扫描电镜照片。
图3是实施例1所述具有细胞外基质电学拓扑特征的带电复合膜的断面形貌扫描电镜照片。
图4是实施例1所述具有细胞外基质电学拓扑特征的带电复合膜的电学稳定性结果。
图5是实施例1所述具有细胞外基质电学拓扑特征的带电复合膜的表面电势分布模拟分析结果。
图6是实施例1所述具有细胞外基质电学拓扑特征的带电复合膜作用大鼠骨髓间充质干细胞12小时后粘附和铺展情况的激光共聚焦显微镜照片。
图7是实施例1所述带电复合膜修复大鼠颅骨缺损试验试验组与空白对照组的Micro-CT照片。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权力要求书中所描述的本发明。
实施例1
(1)取9ml冰醋酸和1.340g乙酰丙酮，混合搅拌5min后加入1.703g醋酸钡，搅拌1h，加入2.266g钛酸四丁酯，搅拌15min，然后加入0.45g聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，搅拌3h；
(2)将步骤(1)所得混合溶液注入注射器内，在电压14kV条件下，利用静电纺丝技术，获得直径为200nm的钛酸钡纳米纤维；
(3)将步骤(2)所得钛酸钡纳米纤维放入0.01mol/L的多巴胺水溶液中，60度水浴加热搅拌12h，然后再超声震荡5min，离心干燥后得到长径比为12的钛酸钡纳米纤维填料；
(4)取适量步骤(3)所得钛酸钡纳米纤维填料超声振荡分散在3mL有机溶剂DMF中，采用超声振荡结合搅拌1.5h，得到纤维填料分散液；
(5)称取1g聚合物P(VDF-TrFE)，加入7mL有机溶剂DMF，搅拌5h使其完全溶解，得到聚合物P(VDF-TrFE)溶液；
(6)将步骤(4)中所得分散液加入步骤(5)所得聚合物P(VDF-TrFE)溶液中，使得钛酸钡纤维填料占聚合物的体积比为7vol％，搅拌10h使得钛酸钡纤维填料均匀分散在聚合物P(VDF-TrFE)基体中，得到混合液；
(7)取步骤(6)所得混合液于流延机中流延，将所得流延膜置于55℃温度下烘干，使溶剂完全挥发，得到一种复合膜材料，膜厚为30μm；
(8)将步骤(7)所得膜材料经过极化处理，极化参数为：极化电压为20kV，极化距离为20mm，极化温度为25℃，极化时间为30min，得到一种具有细胞外基质电学拓扑特征的带电复合膜，其主要成分为聚合物P(VDF-TrFE)和钛酸钡纳米纤维，为薄膜状材料，膜厚为30μm，钛酸钡纤维填料在带电复合膜中的体积含量为5vol％。本实施例产品实物照片见附图1，表面形貌扫描电镜照片见附图2，断面形貌扫描电镜照片见附图3。
产品性能检测：
(1)利用COMSOL软件对膜材料表面的电势分布特征进行模拟分析。模拟分析结果见附图4。
(2)将步骤(8)所得膜材料放置于无血清培养基内，与37℃条件下分别孵育0、1、3、7、14和21天，每个时间点取出材料进行压电常数测试。测试结果见附图5。
(3)将步骤(8)所得膜材料经钴60灭菌后，在其上面接种密度为5×104的大鼠骨髓间充质干细胞，共培养12小时后对细胞进行固定、黏着斑免疫染色，然后利用激光共聚焦显微镜观察。测试结果见附图6。
(4)将步骤(8)所得膜材料经钴60灭菌后，剪成直径为8mm的圆形膜片，覆盖于直径为5mm的大鼠颅骨缺损处，缺损未覆盖任何材料作为空白对照组，术后4周处死动物，分离膜材料后进行micro-CT扫描观察。测试结果见附图7。
实施例2
(1)取9ml冰醋酸和1.340g乙酰丙酮，混合搅拌5min后加入1.703g醋酸钡，搅拌1h，加入2.266g钛酸四丁酯，搅拌15min，然后加入0.45g聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，搅拌3h；
(2)将步骤(1)所得混合溶液注入注射器内，在电压16kV条件下，利用静电纺丝技术，获得直径为300nm的钛酸钡纳米纤维；
(3)将步骤(2)所得钛酸钡纳米纤维放入0.05mol/L多巴胺水溶液中，60度水浴加热搅拌12h，然后再超声震荡10min，离心干燥后得到长径比为8的钛酸钡纳米纤维填料；
(4)取适量步骤(3)所得钛酸钡纳米纤维填料超声振荡分散在3mL有机溶剂DMF中，采用超声振荡结合搅拌1.5h，得到纤维填料分散液；
(5)称取1g聚合物P(VDF-TrFE)，加入7mL有机溶剂DMF，搅拌3h使其完全溶解，得到聚合物P(VDF-TrFE)溶液；
(6)将步骤(4)中所得分散液加入步骤(5)所得聚合物P(VDF-TrFE)溶液中，使得钛酸钡纤维填料占聚合物的体积比为7vol％，搅拌10h使得钛酸钡纤维填料均匀分散在聚合物P(VDF-TrFE)基体中，得到混合液；
(7)取步骤(6)所得混合液于流延机中流延，将所得流延膜置于45℃温度下烘干，使溶剂完全挥发，得到一种复合膜材料，膜厚为50μm；
(8)将步骤(7)所得膜材料经过极化处理，极化参数为：极化电压为15kV，极化距离为20mm，极化温度为50℃，极化时间为60min，得到一种具有细胞外基质电学拓扑特征的带电复合膜，其主要成分为聚合物P(VDF-TrFE)和钛酸钡纳米纤维，为薄膜状材料，膜厚为50μm，钛酸钡纤维填料在带电复合膜中的体积含量为7vol％。
产品性能检测：
(1)利用COMSOL软件对膜材料表面的电势分布特征进行模拟分析。
(2)将步骤(8)所得膜材料放置于无血清培养基内，与37℃条件下分别孵育0、1、3、7、14和21天，每个时间点取出材料进行压电常数测试。
(3)将步骤(8)所得膜材料经钴60灭菌后，在其上面接种密度为5×104的大鼠骨髓间充质干细胞，共培养12小时后对细胞进行固定、黏着斑免疫染色，然后利用激光共聚焦显微镜观察。
(4)将步骤(8)所得膜材料经钴60灭菌后，剪成直径为8mm的圆形膜片，覆盖于直径为5mm的大鼠颅骨缺损处，缺损未覆盖任何材料作为空白对照组，术后4周处死动物，分离膜材料后进行micro-CT扫描观察。
实施例3
(1)取9ml冰醋酸和1.340g乙酰丙酮，混合搅拌5min后加入1.703g醋酸钡，搅拌1h，加入2.266g钛酸四丁酯，搅拌15min，然后加入0.45g聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，搅拌3h；
(2)将步骤(1)所得混合溶液注入注射器内，在电压12kV条件下，利用静电纺丝技术，获得直径为400nm的钛酸钡纳米纤维；
(3)将步骤(2)所得钛酸钡纳米纤维放入0.08mol/L多巴胺水溶液中，60度水浴加热搅拌12h，然后再超声震荡1min，离心干燥后得到长径比为20的钛酸钡纳米纤维填料；
(4)取适量步骤(3)所得钛酸钡纳米纤维填料超声振荡分散在3mL有机溶剂DMF中，采用超声振荡结合搅拌1.5h，得到纤维填料分散液；
(5)称取1g聚合物P(VDF-TrFE)，加入7mL有机溶剂DMF，搅拌5h使其完全溶解，得到聚合物P(VDF-TrFE)溶液；
(6)将步骤(4)中所得分散液加入步骤(5)所得聚合物P(VDF-TrFE)溶液中，使得钛酸钡纤维填料占聚合物的体积比为10vol％，搅拌10h使得纤维填料(如钛酸钡)均匀分散在聚合物P(VDF-TrFE)基体中，得到混合液；
(7)取步骤(6)所得混合液于流延机中流延，将所得流延膜置于80℃温度下烘干，使溶剂完全挥发，得到一种复合膜材料，膜厚为100μm；
(8)将步骤(7)所得膜材料经过极化处理，极化参数为：极化电压为10kV，极化距离为15mm，极化温度为100℃，极化时间为40min，得到一种具有细胞外基质电学拓扑特征的带电复合膜，其主要成分为聚合物P(VDF-TrFE)和钛酸钡纳米纤维，其为薄膜状材料，膜厚为100μm，钛酸钡纤维填料在带电复合膜中的体积含量为10vol％。
产品性能检测：
(1)利用COMSOL软件对膜材料表面的电势分布特征进行模拟分析。
(2)将步骤(8)所得膜材料放置于无血清培养基内，与37℃条件下分别孵育0、1、3、7、14和21天，每个时间点取出材料进行压电常数测试。
(3)将步骤(8)所得膜材料经钴60灭菌后，在其上面接种密度为5×104的大鼠骨髓间充质干细胞，共培养12小时后对细胞进行固定、黏着斑免疫染色，然后利用激光共聚焦显微镜观察。
(4)将步骤(8)所得膜材料经钴60灭菌后，剪成直径为8mm的圆形膜片，覆盖于直径为5mm的大鼠颅骨缺损处，缺损未覆盖任何材料作为空白对照组，术后4周处死动物，分离膜材料后进行micro-CT扫描观察。
实施例4
(1)取9ml冰醋酸和1.340g乙酰丙酮，混合搅拌5min后加入1.703g醋酸钡，搅拌1h，加入2.266g钛酸四丁酯，搅拌15min，然后加入0.45g聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，搅拌3h；
(2)将步骤(1)所得混合溶液注入注射器内，在电压12kV条件下，利用静电纺丝技术，获得直径为400nm的钛酸钡纳米纤维；
(3)将步骤(2)所得钛酸钡纳米纤维放入0.09mol/L多巴胺水溶液中，60度水浴加热搅拌12h，然后再超声震荡1min，离心干燥后得到长径比为20的钛酸钡纳米纤维填料；
(4)取适量步骤(3)所得钛酸钡纳米纤维填料超声振荡分散在3mL有机溶剂DMF中，采用超声振荡结合搅拌1.5h，得到纤维填料分散液；
(5)称取1g聚合物PVDF，加入7mL有机溶剂DMF，搅拌5h使其完全溶解，得到聚合物PVDF溶液；
(6)将步骤(4)中所得分散液加入步骤(5)所得聚合物PVDF溶液中，使得钛酸钡纤维填料占聚合物的体积比为10vol％，搅拌10h使得纤维填料(如钛酸钡)均匀分散在聚合物PVDF基体中，得到混合液；
(7)取步骤(6)所得混合液于流延机中流延，将所得流延膜置于80℃温度下烘干，使溶剂完全挥发，得到一种复合膜材料，膜厚为100μm；
(8)将步骤(7)所得膜材料经过极化处理，极化参数为：极化电压为10kV，极化距离为15mm，极化温度为100℃，极化时间为40min，得到一种具有细胞外基质电学拓扑特征的带电复合膜，其主要成分为聚合物PVDF和钛酸钡纳米纤维，为薄膜状材料，膜厚为120μm，钛酸钡纤维填料在带电复合膜中的体积含量为10vol％。
产品性能检测：
(1)利用COMSOL软件对膜材料表面的电势分布特征进行模拟分析。
(2)将步骤(8)所得膜材料放置于无血清培养基内，与37℃条件下分别孵育0、1、3、7、14和21天，每个时间点取出材料进行压电常数测试。
(3)将步骤(8)所得膜材料经钴60灭菌后，在其上面接种密度为5×104的大鼠骨髓间充质干细胞，共培养12小时后对细胞进行固定、黏着斑免疫染色，然后利用激光共聚焦显微镜观察。
(4)将步骤(8)所得膜材料经钴60灭菌后，剪成直径为8mm的圆形膜片，覆盖于直径为5mm的大鼠颅骨缺损处，缺损未覆盖任何材料作为空白对照组，术后4周处死动物，分离膜材料后进行micro-CT扫描观察。
实施例5
(1)取9ml冰醋酸和1.340g乙酰丙酮，混合搅拌5min后加入1.703g醋酸钡，搅拌1h，加入2.266g钛酸四丁酯，搅拌15min，然后加入0.45g聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，搅拌3h；
(2)将步骤(1)所得混合溶液注入注射器内，在电压10kV条件下，利用静电纺丝技术，获得直径为500nm的钛酸钡纳米纤维；
(3)将步骤(2)所得钛酸钡纳米纤维放入0.1mol/L多巴胺水溶液中，60度水浴加热搅拌12h，然后再超声震荡15min，离心干燥后得到长径比为8的钛酸钡纳米纤维填料；
(4)取适量步骤(3)所得钛酸钡纳米纤维填料超声振荡分散在3mL有机溶剂DMF中，采用超声振荡结合搅拌1.5h，得到纤维填料分散液；
(5)称取1g聚合物P(VDF-TrFE)，加入7mL有机溶剂DMF，搅拌5h使其完全溶解，得到聚合物P(VDF-TrFE)溶液；
(6)将步骤(4)中所得分散液加入步骤(5)所得聚合物P(VDF-TrFE)溶液中，使得钛酸钡纤维填料占聚合物的体积比为15vol％，搅拌10h使得钛酸钡纤维填料均匀分散在聚合物P(VDF-TrFE)基体中，得到混合液；
(7)取步骤(6)所得混合液于流延机中流延，将所得流延膜置于100℃温度下烘干，使溶剂完全挥发，得到一种复合膜材料，膜厚为300μm；
(8)将步骤(7)所得膜材料经过极化处理，极化参数为：极化电压为30kV，极化距离为50mm，极化温度为150℃，极化时间为10min，得到一种具有细胞外基质电学拓扑特征的带电复合膜，其主要成分为聚合物P(VDF-TrFE)和钛酸钡纳米纤维，为薄膜状材料，膜厚为300μm，钛酸钡纤维填料在带电复合膜中的体积含量为15vol％。
产品性能检测：
(1)利用COMSOL软件对膜材料表面的电势分布特征进行模拟分析。
(2)将步骤(8)所得膜材料放置于无血清培养基内，与37℃条件下分别孵育0、1、3、7、14和21天，每个时间点取出材料进行压电常数测试。
(3)将步骤(8)所得膜材料经钴60灭菌后，在其上面接种密度为5×104的大鼠骨髓间充质干细胞，共培养12小时后对细胞进行固定、黏着斑免疫染色，然后利用激光共聚焦显微镜观察。
(4)将步骤(8)所得膜材料经钴60灭菌后，剪成直径为8mm的圆形膜片，覆盖于直径为5mm的大鼠颅骨缺损处，缺损未覆盖任何材料作为空白对照组，术后4周处死动物，分离膜材料后进行micro-CT扫描观察。
实施例2～5的产品性能检测结果参见实施例1。