一种多尺度三维生物组织工程支架的制备方法.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201610329410.X (22)申请日 2016.05.16 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 106039417 A (43)申请公布日 2016.10.26 (73)专利权人 浙江大学 地址 310027 浙江省杭州市西湖区浙大路 38号 (72)发明人 赵朋 顾海兵 贺永 傅建中 (74)专利代理机构 杭州天勤知识产权代理有限 公司 33224 代理人 黄燕 (51)Int.Cl. A61L 27/50(2006.01) A61L 27/56(2006.。

2、01) A61L 27/18(2006.01) D04H 1/728(2012.01) D04H 1/76(2012.01) D04H 1/55(2012.01) D01D 5/00(2006.01) D01F 6/62(2006.01) (56)对比文件 CN 105216316 A,2016.01.06, CN 104874027 A,2015.09.02, CN 104888277 A,2015.09.09, Mahesh Kumar Joshi等.Multi-layerd macroporous three-dimensional nanofibrous scaffold via a 。

3、novel gas foaming technique. Chemical Engineering Journal .2005,第275卷摘要、 第81页左栏第2段. 审查员 周丹 (54)发明名称 一种多尺度三维生物组织工程支架的制备 方法 (57)摘要 本发明公开了一种多尺度三维生物组织工 程支架的制备方法， 包括如下步骤： (1)制作具有 三维网络结构或者型腔结构的模具； (2)利用静 电纺丝制作二维纤维薄膜； (3)将模具和二维纤 维薄膜同时置于对模具内表面具有亲和力的、 且 可产生气泡的液相体系中， 且保证模具压于二维 纤维薄膜顶面， 气泡和毛细作用力共同作用下促 使二维纤维薄膜向三。

4、维网络结构的网格孔内或 者型腔内迁移膨胀， 在三维网络结构内成型； (4) 真空干燥得到对细胞具有导向作用的组织工程 支架； 可选择的， 将模具拆除。 本发明结合3D打印 的快速、 高精度个性化制模以及静电纺丝在制备 高空隙率纳米纤维的优点， 制备具有可控几何形 状的三维纳米纤维支架， 过程简单， 实用性强。 权利要求书1页 说明书5页 附图2页 CN 106039417 B 2019.01.29 CN 106039417 B 1.一种多尺度三维生物组织工程支架的制备方法， 其特征在于， 包括如下步骤： (1)制作具有三维网络结构或者型腔结构的模具； (2)利用静电纺丝制作二维纤维薄膜； (3。

5、)将模具和二维纤维薄膜同时置于对模具内表面具有亲和力的、 且可产生气泡的液 相体系中， 且保证模具压于二维纤维薄膜顶面， 气泡和毛细作用力共同作用下促使二维纤 维薄膜向三维网络结构的网格孔内或者型腔内迁移膨胀， 在三维网络结构内成型； (4)真空干燥得到对细胞具有导向作用的组织工程支架。 2.根据权利要求1所述的多尺度三维生物组织工程支架的制备方法， 其特征在于， 步骤 (1)中， 采用三维打印方法制作具有三维网络结构或者型腔结构的模具。 3.根据权利要求2所述的多尺度三维生物组织工程支架的制备方法， 其特征在于， 三维 打印采用的材料为生物可降解的聚乳酸。 4.根据权利要求1所述的多尺度三维。

6、生物组织工程支架的制备方法， 其特征在于， 步骤 (2)中， 静电纺丝采用的纤维材料为聚己内酯、 聚乙醇酸、 聚乙交酯丙交酯、 聚乳酸、 聚羟基 丁酸戊酸共聚酯、 聚丁二酸丁二醇酯、 聚对二氧环己酮中的一种或几种复合而成。 5.根据权利要求4所述的多尺度三维生物组织工程支架的制备方法， 其特征在于， 静电 纺丝采用的纤维材料为聚己内酯， 其静电纺丝过程如下： (2-1)将聚己内酯溶于二甲基甲酰胺与二氯甲烷溶液， 二甲基甲酰胺： 二氯甲烷溶液体 积比1： 51： 3中， 搅拌， 得到聚己内酯的质量百分比为520的PCL/二甲基甲酰胺/ 二氯甲烷溶液； (2-2)进行PCL/二甲基甲酰胺/二氯甲烷。

7、溶液的静电纺丝， 流量为0.37ml/h， 施加电 压为850kv， 接收距离为1030cm。 6.根据权利要求1所述的多尺度三维生物组织工程支架的制备方法， 其特征在于， 所述 液相体系选自如下体系之一： 硼氢化钠/甲醇溶液； 碳酸水溶液； 碳酸钠/稀硫酸； 双氧水。 7.根据权利要求6所述的多尺度三维生物组织工程支架的制备方法， 其特征在于， 所述 硼氢化钠/甲醇溶液中， 硼氢化钠质量百分比为525。 8.根据权利要求7所述的多尺度三维生物组织工程支架的制备方法， 其特征在于， 步骤 (3)在常温进行， 处理时间为2040min。 9.根据权利要求1所述的多尺度三维生物组织工程支架的制备方。

8、法， 其特征在于， 静电 纺丝的接收装置为规则的铝箔。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 106039417 B 2 一种多尺度三维生物组织工程支架的制备方法 技术领域 0001 本发明属于组织工程中细胞支架及其制备和应用领域， 特别是涉及一种多尺度三 维生物组织工程支架的制备方法。 背景技术 0002 组织工程是一个跨领域的学科， 是将工程和生命科学的原理应用于发展生物替代 品， 是用于恢复、 维持或改善组织的功能， 或是替代一个整体组织功能的科学。 传统的医疗 手段对于器官的坏死和组织的失能而引起的许多疾病缺乏有效的疗法， 而组织工程中设计 的具有生物功能的组织和器官为治愈这些疾病。

9、提供了新的途径。 组织工程的一个主要的目 标是设计并制备合适的支架来模拟天然细胞外基质(ECM)的结构及生物学功能从而用来替 代生物组织。 为细胞提供生长繁殖的环境， 同时诱导它形成具有一定几何外形的组织结构， 在被植入人体后提供适当的力学性能且能够在体内随着细胞的繁殖以及新组织的生成而 降解， 对于不同损伤组织， 其所需要的支架结构与性能也大不相同。 在组织工程过程中需要 将人造组织植入受损组织或器官， 因此植入的支架材料需要具有符合受损组织或器官的几 何外形。 这就要求支架具有立体的三维结构， 并且同时具有相互连通的多孔结构使细胞能 够自由的在支架内部迁移、 生长， 且泡孔的尺寸应与目标组。

10、织的细胞尺寸相适应。 具有较大 表面积/体积比的支架有利于大量细胞的粘附以及营养物质的运输和代谢废物的排出。 然 而， 制备高连通性、 具有均一泡孔尺寸的三维支架仍然面临着很大的挑战。 0003 研究者们采用不同的工艺方法来制备具有多种结构的组织工程支架， 发现不同的 支架结构能够显著影响细胞行为。 一般来说低于75的孔隙率不足以满足多数细胞的正常 生长， 高于90的孔隙率可能导致细胞无法形成连续的细胞膜。 不同细胞所能够适应的泡 孔尺寸也不相同， 例如： 心脏细胞能够适应100 m左右的泡孔， 而成骨细胞一般需要200 m的 泡孔尺寸才能够获得良好的生长状态。 另外， 细胞一般无法迁移通过小。

11、于10 m的泡孔。 因 此， 符合目标细胞的泡孔尺寸和目标组织要求的支架结构是制备组织工程支架中应考虑的 重要因素。 制备出具有几何形状的三维立体结构以及具有高连通性且具有均一泡孔尺寸的 支架有着十分重要的意义。 0004 快速成型技术(3D打印技术)由于其产品生产周期短、 制造精度高、 能够直接制造 复杂模型等可以快速实现优质的个性化定制产品而广受医学研究者的关注。 在作为仿生生 物支架方面研究较广泛， 比如： 制备一体化的仿生复合支架模型、 具有生物相容性的骨架、 具有多孔结构的组织等等。 但是由于其制作精度不足以达到微纳级， 这就限制了其作为一 种真正的可直接的细胞支架使用， 现阶段三维。

12、打印在细胞支架上的应用处于一种辅助支架 的使用。 0005 另外， 静电丝纺技术的微纳米纤维支架具有高的孔隙率和微纳米级的孔径， 可以 更好地适应细胞的生长黏附， 有利于调节细胞的营养物质和废物交换运输， 提高材料降解 率， 并有利于生物活性因子的释放， 形成类似于天然ECM的形态结构。 由于其在结构方面的 可控性， 与性能方面的日益改善而得到医院的广泛关注， 在神经再生、 血管、 心脏组织、 骨骼 说 明 书 1/5 页 3 CN 106039417 B 3 肌再生、 肌腱修复、 角膜修复等方面都有研究。 但是， 由于静电纺丝制备过程的独特性， 以及 其尺寸处于微纳级别的原因， 所制备出的材。

13、料的力学性能以及三维形状的可控性较差。 0006 综上， 本发明的发明人认为， 可以结合三维打印与静电纺丝的各自的优点将两者 相结合， 制备出既有三维几何形状又具有特定的微纳结构以及一定强度的组织工程支架。 这将对推动人类医学的进步与改善人类健康有着重要的意义。 发明内容 0007 本发明所解决的技术问题是提供一种多尺度三维生物组织工程支架的制备方法， 将静电纺丝得到的高孔隙率的网状纳米纤维固定在三维宏观尺寸网络结构内部， 既保证了 组织工程支架的力学性能又保证了组织工程支架内部高的孔隙率和微纳米级的孔径， 或者 将3D打印外壳作为一种模具， 制备出具有特定几何外形的组织工程支架， 上述结构的。

14、组织 工程支架具有导向细胞分化、 输送养分的作用。 0008 一种多尺度三维生物组织工程支架的制备方法， 包括如下步骤： 0009 (1)制作具有三维网络结构或者型腔结构的模具； 0010 (2)利用静电纺丝制作二维纤维薄膜； 0011 (3)将模具和二维纤维薄膜同时置于对模具内表面具有亲和力的、 且可产生气泡 的液相体系中， 且保证模具压于二维纤维薄膜顶面， 气泡和毛细作用力共同作用下促使二 维纤维薄膜向三维网络结构的网格孔内或者型腔内迁移膨胀， 在三维网络结构内成型； 0012 (4)真空干燥得到对细胞具有导向作用的组织工程支架； 0013 可选择的， 将模具拆除。 0014 通过本发明的。

15、方法， 即可制备得到具有良好机械强度的组织工程支架， 也可通过 对型腔结构的设计， 制作各种形状的组织工程支架， 比如可根据人体器官和组织的形状， 设 计型腔结构。 0015 作为优选， 步骤(1)中， 采用三维打印方法制作具有三维宏观尺寸的网络结构或者 型腔结构的模具。 采用三维打印与静电纺丝相结合， 同时结合了三维打印与静电纺丝的各 自的优点的同时， 也使得整个制备方法操作简单快捷， 成本低， 对环境友好， 经济效益高。 0016 三维打印可以采用现有的方法， 比如， 实现进行三维模型设计， 将三维打印数据导 入三维打印装置中， 然后利用三维打印装置进行打印即可。 利用三维打印， 可以实现。

16、各种三 维网络结构的设计和打印， 灵活性较高， 实用性很强。 0017 另外一方面， 结合三维打印本身的特点， 三维打印一般分层打印， 材料固化后， 从 微观结构讲， 每一层均为向外弧形凸起的环状的结构， 层与层衔接的部位会形成凹槽结构， 在三维网络孔壁上会形成多层环形的凹槽结构， 在后续二维纤维薄膜膨胀并向网格孔内迁 移且成型后， 这些环形的凹槽结构内会形成纤维部分的固定臂， 进一步增加了与三维网络 结构的固定强度。 0018 三维打印采用的材料可以采用生物可降解的聚乳酸(PLA)。 0019 步骤(2)中， 静电纺丝采用的纤维材料选自可降解纤维， 可以是有序也可以是无序 的。 其材料可以有。

17、生物可降解高分子材料聚己内酯(PCL)、 聚乙醇酸(PGA)、 聚乙交酯丙交酯 (PGLA)、 聚乳酸(PLA)、 聚羟基丁酸戊酸共聚酯(PHBV)、 聚丁二酸丁二醇酯(PBS)、 聚对二氧 环己酮(PDS)中的一种或几种复合制备而成。 说 明 书 2/5 页 4 CN 106039417 B 4 0020 作为优选， 静电纺丝采用的纤维材料为聚己内酯(PCL)， 其静电纺丝过程如下： 0021 (2-1)将PCL溶于二甲基甲酰胺与二氯甲烷溶液(二甲基甲酰胺： 二氯甲烷溶液体 积比1： 51： 3)中， 搅拌， PCL的质量百分比为520的PCL/二甲基甲酰胺/二氯甲烷 溶液； 0022 (2。

18、-2)进行PCL/二甲基甲酰胺/二氯甲烷溶液的静电纺丝， 流量为0.37ml/h， 施 加电压为850kv， 接收距离为1030cm。 0023 本发明中， 所述的生物支架内部结构是采用静电纺丝法喷射的PCL微纳米级纤维 制成的高表面积、 高孔隙率、 三维网络状结构。 外部几何结构是采用FDM打印成型的具有宏 观尺寸的规则网格状孔形结构作为模具成型的。 0024 步骤(2)完成静电纺丝后， 取下二维纤维薄膜， 在真空条件下干燥2030h。 0025 步骤(2)中的静电纺丝接收装置为规则的平板铝箔。 0026 本发明步骤(3)中， 由于液相体系对模具内表面具有亲和力， 可促二维纤维薄膜快 速的进。

19、入到模具内腔或者网孔内； 同时在气体协同作用下， 进一步膨胀和向模具内腔或者 网孔内转移。 0027 作为优选， 所述液相体系选自如下体系之一： 0028 硼氢化钠/甲醇溶液； 0029 碳酸水溶液； 0030 碳酸钠/稀硫酸； 0031 双氧水。 0032 步骤(3)中， 作为优选， 所述硼氢化钠/甲醇溶液中， 硼氢化钠质量百分比为5 25。 保证亚微米级纤维以适当的速度进入到三维网络状结构内， 同时以适当的速度膨胀 定型。 该步骤一般在常温下进行， 时间一般为2040min。 0033 步骤(4)中， 用蒸馏水以及70的甲醇溶液洗净， 在真空条件下干燥2030h， 并包 装消毒， 从而可用。

20、作对细胞导向的组织工程支架。 0034 当需要将模具拆除时， 可采用现有的方法拆除。 例如可以将模具本身设计为可拆 卸的结构， 烘干完成后， 可以利用外部机械力将模具拆除； 或者， 可利用模具的溶解特性， 利 用一定的溶剂将模具溶解等。 0035 通过调整3D打印的网格状模型内网格大小可以控制支架的形状与强度以及柔软 性； 0036 通过调节静电纺丝的工艺参数可以控制组织工程支架的纤维直径、 孔隙率、 空洞 尺寸等结构参数。 0037 本发明的聚己内酯(PCL)静电纺丝/3D打印组织工程支架可用于培养需要特定形 状的组织的细胞。 0038 本发明的支架微观上是具有高孔隙率的三维网状纳米纤维， 。

21、宏观上是具有高长宽 比、 高比表面积、 高孔隙率的长孔状的三维网络结构， 具有多尺度三维结构。 所述的生物支 架高10mm30mm； 0039 与现有技术相比， 本发明的有益效果体现在： 0040 (1)本发明的组织工程支架是通过静电纺丝装置在3D打印模具的控制下制备而成 的一种高比表面积、 高孔隙率、 具有三维网状与三维几何外形的结构， 可以起到导向细胞生 说 明 书 3/5 页 5 CN 106039417 B 5 长、 输送养分等作用。 0041 (2)本发明的制备方法操作简单， 成本低， 对环境友好， 经济效益高； 0042 (3)本发明的3D打印模具可以按需设计、 打印， 满足需求广。

22、泛。 0043 (4)本发明可以通过型腔结构的设计， 制作出各种形状的组织工程支架， 满足各种 场合的需要。 0044 总之， 本发明结合3D打印的快速、 高精度个性化制模以及静电纺丝在制备高空隙 率纳米纤维的优点， 制备具有优良机械强度， 且可控几何形状的三维纳米纤维支架， 过程简 单， 实用性强。 附图说明 0045 图1： 3D打印俯视图； 0046 图2： 3D打印模具外观图； 0047 图3： 静电纺丝胀大示意图。 具体实施方式 0048 下面结合具体实例， 进一步阐述发明。 应理解， 这些实施例仅用于说明发明而不用 于限制本发明的范围。 此外应理解， 在阅读了本发明讲授的内容之后，。

23、 本领域技术人员可以 对本发明作各种移动或修改， 这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书限定的范围。 0049 实施例 0050 (1)采用聚乳酸(PLA)作为打印材料， 利用FDM三维打印机打印出设计好的具有网 格状立体型腔的模具， 其中形成的立体型腔为边长为2.5mm2.5mm的长方体状结构， 结构 如图1和图2所示； 0051 (2)将聚己内脂(PCL)溶解于二甲基甲酰胺与二氯甲烷溶液(二甲基甲酰胺： 二氯 甲烷体积比1： 4)中， 搅拌成质量分数为12的PCL/二甲基甲酰胺/二氯甲烷溶液。 0052 本步骤中， 聚己内酯(PCL)也可替换为聚乙醇酸(PGA)、 聚乙交酯丙交酯(PGL。

24、A)、 聚 乳酸(PLA)、 聚羟基丁酸戊酸共聚酯(PHBV)、 聚丁二酸丁二醇酯(PBS)、 聚对二氧环己酮 (PDS)等。 0053 (3)利用现有的静电纺丝设备， 进行PCL/二甲基甲酰胺/二氯甲烷溶液的静电纺 丝， 采用平板接收装置作为接收器， 收集静电纺丝纺出的纤维； 流量为1.5mL/h， 施加电压值 为17kv， 接地距离(喷死头末端与平板接收装置之间的距离)为10cm； 0054 (4)静电纺丝结束后， 取下纺好的二维纤维薄膜， 在真空下干燥24h， 并将二维纤维 薄膜置于质量百分比为525(本实施例中硼氢化钠的质量百分比为15)的硼氢化 钠/甲醇溶液， 同时将3D打印的网格状。

25、模型压于二维纤维薄膜之上， 硼氢化钠与甲醇产生的 氢气会对二维纤维薄膜产生推动力， 由于三维网格的阻挡作用， 促使其向网格孔内移动， 同 时在氢气的作用下膨胀成型， 形成柱状三维结构； 0055 如图3所示， 由于三维打印工艺本身的特点， 在层2与层2衔接处形成沟槽结构3， 二 维纤维薄膜1进入网格孔内时， 也会向这些沟槽结构3内迁移， 进而形成纤维的固定臂， 进一 步增强了纤维结构的固定强度。 0056 (5)取出三维结构支架， 用蒸馏水以及70的甲醇溶液洗净， 在真空下干燥24h， 并 说 明 书 4/5 页 6 CN 106039417 B 6 包装消毒， 从而可用作对细胞导向的组织工程支架。 说 明 书 5/5 页 7 CN 106039417 B 7 图1 图2 说 明 书 附 图 1/2 页 8 CN 106039417 B 8 图3 说 明 书 附 图 2/2 页 9 CN 106039417 B 9 。