技术领域
本发明涉及一种纳米纤维表面改性的异种脱细胞神经移植物及其制备方法，属于生物医用材料领域。
背景技术
周围神经损伤可能造成机体感觉和运动功能的部分或全部丧失，从而严重影响机体的功能行使和病患的生活质量。周围神经缺损的修复，尤其是长距离缺损的修复，一直是临床上较为棘手的难题。目前最常用的方法是利用自体神经移植来桥接断端以修复损伤，虽然修复效果良好，但存在诸如来源有限、导致二次创伤及易形成供区神经瘤等缺点，极大限制了其临床应用。近年来发展起来的神经导管类修复材料，虽具有一定的周围神经缺损修复效果，但由于其内部一般为中空结构，无法有效引导细胞的迁移和增殖，因此对于长距离缺损修复无能为力。
目前在临床上应用的同种异体脱细胞神经保留了天然神经内部的微结构，可用于修复长距离周围神经损伤，但由于受供体来源限制导致价格昂贵，患者可接受度较差。异种脱细胞神经同样有着接近人周围神经的网架微结构，材料本身所保留的成分有引导或诱导组织再生的能力，同时具备来源广泛、免疫原性低的特点，因此在用于构建组织工程神经以修复周围神经缺损方面具有明显的优势。
在周围神经损伤及修复过程中，粘连的形成具有普遍性。上述脱细胞神经移植物在植入体内后，虽然能修复神经缺损部位，但同时，必定会促使成纤维细胞大量增生，分泌大量胶原纤维，形成瘢痕、粘连，不利于神经之间的衔接，影响手术效果，有时还可导致严重的术后并发症。因此，临床上长期需要一种能有效预防组织粘连、可修复长距离缺损同时来源广泛、价格低廉的脱细胞神经移植物。
发明内容
本发明的目的是提供一种纳米纤维表面改性的异种脱细胞神经移植物及其制备方法；本发明采用静电纺丝工艺在异种脱细胞神经移植物表面沉积一层可降解聚酯高分子纳米纤维膜，以期在用于外科手术中修复周围神经缺损的同时，防止组织粘连的发生，加快神经修复和神经传导的重建。
本发明所提供的纳米纤维表面改性的异种脱细胞神经移植物，由异种脱细胞神经移植物和附着于其表面的可降解聚酯纳米纤维膜组成；
所述异种脱细胞神经移植物为健康哺乳动物的离体周围神经经脱细胞处理得到的细胞外基质，所述脱细胞处理可在常规工艺条件下进行。
所述纳米纤维表面改性的异种脱细胞神经移植物中，所述可降解聚酯纳米纤维膜的厚度可为0.01～0.5mm，具体可为0.05～0.1mm、0.05mm、0.07mm、0.08mm或0.2mm。
所述纳米纤维表面改性的异种脱细胞神经移植物中，所述可降解聚酯纳米纤维膜由可降解聚酯制成；
所述可降解聚酯可为聚乳酸、聚己内酯、聚乙醇酸、聚对二氧环己酮、聚三亚甲基碳酸酯、聚乙二醇、聚羟基丁酸酯、聚羟基乙酸、聚羟基戊酸酯、聚丁二酸丁二醇酯和聚氨酯中至少一种或其中至少两种的共聚物；
所述可降解聚酯的重均分子量可为30～500Kda，具体可为150～300Kda、150Kda、200Kda、250Kda或300Kda。
本发明纳米纤维表面改性的异种脱细胞神经移植物中的可降解聚酯纳米纤维膜，具有多孔纤维状结构，且结合牢固、分布均匀；同时其具有结构同人体天然细胞外基质相似、孔隙率高、比表面积大及孔径小等特点，在再生医学领域得到了广泛的应用。高分子纤维膜内部纳米级孔结构的存在可实现良好的组织粘连阻隔效果，起到防止神经移植物和周围组织粘连的作用，同时还可以实现膜两侧的组织液流通顺畅，有利于营养物质的交换并促进神经再生。
本发明进一步提供了所述纳米纤维表面改性的异种脱细胞神经移植物的制备方法，包括如下步骤：
利用可降解聚酯配制纺丝液，利用静电纺丝工艺将所述纺丝液沉积于所述异种脱细胞神经移植物的表面形成所述可降解聚酯纳米纤维膜，然后依次经去除溶剂步骤、冷冻干燥和灭菌处理即得所述纳米纤维表面改性的异种脱细胞神经移植物。
上述的制备方法中，所述纺丝液中，所述可降解聚酯的质量体积浓度可为0.02～0.2g/ml，具体可为0.06～0.15g/ml、0.06g/ml、0.075g/ml、0.08g/ml或0.15g/ml。
上述的制备方法中，所述纺丝液的溶剂可为丙酮、二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺、四氢呋喃、二氯甲烷、三氯甲烷、去离子水、1,4-二氧六环、六氟异丙醇、乙醇、二甲基亚砜和三氟乙酸中至少一种，优选丙酮、二氯甲烷或六氟异丙醇。
上述的制备方法中，所述静电纺丝工艺的条件如下：
所述纺丝液的供给流量可为0.1～20ml/h，具体可为1～3ml/h、1ml/h、2ml/h或3ml/h；
高压发生端与收集装置之间的距离可为3～30cm，具体可为10～15cm、10cm、12.5cm、13cm或15cm，所述收集装置包括滚轴和固定其上的所述异种脱细胞神经移植物，所述异种脱细胞神经移植物可随所述滚轴匀速转动；
所述高压发生端提供的电压可为0.1～40KV，具体可为10～15KV、10KV、12.5KV、13KV或15KV；
所述滚轴的转速可为100～1000转/分，具体可为100～300转/分、100转/分、200转/分、250转/分或300转/分。
上述的制备方法中，所述去除溶剂步骤包括依次在乙醇和水中浸泡的步骤，各浸泡6～24小时，具体可为6～12小时、6小时、8小时、10小时或12小时，重复2～8次。
上述的制备方法中，所述冷冻干燥的温度可为-10℃～-45℃，具体可为-10℃～-30℃、-10℃、-15℃、-20℃或-30℃，时间可为6小时～12小时，具体可为6小时、8小时、10小时或12小时；
所述灭菌处理采用下述1)-2)中任一种方式：
1)环氧乙烷灭菌
2)钴-60或电子束辐照灭菌，辐照剂量可为10～15KGy，具体可为12～15KGy、12KGy、13KGy或15KGy；
上述灭菌方式可以降低对所得产物的降解性能的破坏。
本发明纳米纤维表面改性的异种脱细胞神经移植物可应用于周围神经缺损的修复。
本发明具有如下有益效果：
(1)本发明纳米纤维表面改性的异种脱细胞神经移植物，来源广泛、价格低廉，同时无免疫原性、生物相容性好、使用安全；完整保留了周围神经细胞外基质的微结构，为神经轴突再生、恢复神经传导功能提供天然的管道支架和营养环境。
(2)通过静电纺丝工艺将可降解高分子纳米纤维膜包覆在异种脱细胞神经的表面，纳米级孔隙具有很好的物理阻隔作用，保证了防粘连的效果；多孔结构的存在又可以实现膜两侧的组织液流通顺畅，有利于营养物质的交换，促进神经再生。
(3)可以通过改变电纺的电压、距离、时间等参数，很方便的调控纳米纤维膜的厚度、孔隙率、纤维直径，可以根据植入环境的要求获得具有不同形貌结构和降解时间的纤维膜。
(4)纳米纤维表面改性的异种脱细胞神经移植物经过冷冻干燥处理后水分含量极低，性能稳定，灭菌、封装后可以实现无保护液、常温保存。
附图说明
图1是本发明纳米纤维表面改性的异种脱细胞神经移植物的结构示意图，其中1表示异种脱细胞神经，2表示可降解高分子纳米纤维膜。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中所用的异种脱细胞神经移植物是按照如下方法制备的：
取健康哺乳动物周围神经，利用中国发明专利申请CN106139250A中公开的脱细胞工艺处理后，即得到异种脱细胞神经移植物。
实施例1：
1、将重均分子量为20万的聚乳酸-己内酯共聚物溶解于六氟异丙醇中，浓度为0.08g/ml，在室温下搅拌后形成均一稳定的溶液后，将其置入注射器中，注射器针头处连接高压电源。
2、以固定有异种脱细胞神经移植物的滚轴为收集装置，转速为100转/分。开启静电纺丝过程，将溶液供给流量控制在1ml/h，施加电压为15KV，高压端同接地端的距离为15cm。
3、将收集得到的纳米纤维改性脱细胞神经移植物利用乙醇和去离子水各清洗12h，重复5次。
4、将产物在冻干机内冷冻干燥(温度为-30℃)10小时后，进行环氧乙烷灭菌并封装，即得到最终产品，其示意图如图1所示。
本实施例制备的产品中，附着于异种脱细胞神经移植物表面的聚乳酸-己内酯共聚物纤维膜的厚度为0.05mm。
实施例2：
1、将重均分子量为30万的消旋聚乳酸溶解于二氯甲烷中，浓度为0.075g/ml，在室温下搅拌后形成均一稳定的溶液后，将其置入注射器中，注射器针头处连接高压电源。
2、以固定有异种脱细胞神经的滚轴为收集装置，转速为250转/分。开启静电纺丝过程，将溶液供给流量控制在3ml/h，施加电压为12.5KV，高压端同接地端的距离为10cm。
3、将收集得到的纳米纤维改性脱细胞神经移植物利用乙醇和去离子水各清洗6h，重复3次。
4、将产物在冻干机冷冻干燥(温度为-20℃)8小时后，进行辐照剂量为15KGy的钴-60灭菌并封装，即得到最终产品，其示意图如图1所示。
本实施例制备的产品中，附着于异种脱细胞神经移植物表面的聚乳酸纤维膜的厚度为0.07mm。
实施例3：
1、将重均分子量为15万的聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶解于丙酮中，浓度为0.15g/ml，在室温下搅拌后形成均一稳定的溶液后，将其置入注射器中，注射器针头处连接高压电源。
2、以固定有异种脱细胞神经的滚轴为收集装置，转速为300转/分。开启静电纺丝过程，将溶液供给流量控制在2ml/h，施加电压为10KV，高压端同接地端的距离为12.5cm。
3、将收集得到的纳米纤维改性脱细胞神经移植物利用乙醇和去离子水各清洗8h，重复4次。
4、将产物在冻干机冷冻干燥(温度为-15℃)6小时后，进行辐照剂量为13KGy的电子束灭菌并封装，即得到最终产品，其示意图如图1所示。
本实施例制备的产品中，附着于异种脱细胞神经移植物表面的聚乳酸-己内酯共聚物纤维膜的厚度为0.1mm。
实施例4：
1、将重均分子量为25万的聚对二氧环己酮溶解于六氟异丙醇中，浓度为0.06g/ml，在室温下搅拌后形成均一稳定的溶液后，将其置入注射器中，注射器针头处连接高压电源。
2、以固定有异种脱细胞神经的滚轴为收集装置，转速为200转/分。开启静电纺丝过程，将溶液供给流量控制在2ml/h，施加电压为13KV，高压端同接地端的距离为13cm。
3、将收集得到的纳米纤维改性脱细胞神经移植物利用乙醇和去离子水各清洗10h，重复3次。
4、将产物在冻干机冷冻干燥(温度为-10℃)12小时后，进行环氧乙烷灭菌并封装，即得到最终产品，其示意图如图1所示。
本实施例制备的产品中，附着于异种脱细胞神经移植物表面的聚乳酸-己内酯共聚物纤维膜的厚度为0.08mm。
实施例5：
选用健康成年犬为实验动物，以右下肢坐骨神经为缺损模型，以实施例3制备得到的产品为实验品，分为实施纳米纤维表面改性异种脱细胞神经修复组(A组)、脱细胞神经修复对照组(B组，自体神经移植组)、神经缺损对照组(C组)，分别进行暴露术部、桥接神经、缝合。术后对三组实验犬进行大体观察、组织学观察、神经电生理检测，验证本发明纳米纤维表面改性的异种脱细胞神经移植物的防止组织粘连及神经修复功能。
三组实验犬术后2周内右下肢均出现不同程度肿胀、皮肤溃疡。A组实验犬平均8周时溃疡基本愈合，患肢无明显肿胀，活动自如，无感染。B组实验犬平均10周时溃疡基本愈合，患肢无明显肿胀。C组实验犬神经再生修复效果不佳，足部及小腿长期红肿、溃疡不愈合。A组实验犬，术后4周取材，可见纤维膜与周围组织无明显粘连，神经活动度尚可；12周时，纤维膜已经基本降解吸收，形成膜样组织，局部无明显瘢痕组织增生；16周时，纤维膜已完全降解吸收，局部无明显瘢痕和粘连，神经活动度良好。B组实验犬，术后4周时可见神经局部瘢痕组织增生，与周围组织粘连，神经活动受限；术后12周、16周时粘连加重，神经基本无活动度。组织学观察结果，A组可见神经瘢痕组织增生不明显，与周围组织分界清楚，炎症反应不明显，术后12周时，纵切面上再生神经轴突较直，排列结构较整齐。B组局部瘢痕增生和粘连明显，纵切面上再生神经轴突扭曲较明显。电生理结果显示，术后16周，A组坐骨神经诱发电位的波幅的恢复率比B组较高，且差异有显著性意义，潜伏期的延迟率A组比B组相比有所降低。
由上述实验结果可以看出，本发明纳米纤维表面改性的异种脱细胞神经移植物具有良好的组织相容性，可用于实验犬坐骨神经缺损的修复，并且能够有效预防神经与周围组织发生粘连。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限制。对于所属领域的技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或改进，凡是在本发明的精神和原则的前提下所作的任何变化和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。