技术领域
本发明涉及间充质干细胞和它们的分化以制备多维组织或生物材料或基质 的领域。本发明的产品可以用于风湿病学、组织重建和/或外科手术，尤其是创 伤、矫形、整形和颌面外科手术。尤其是，本发明的产品可以用于骨或软骨修 复或置换。
背景技术
组织工程是一个不断成长的领域，在此领域中，不断开发出新材料以用于 植入至体内。一个重要的领域包括置换由于创伤或疾病(如例如，肿瘤切除术) 而损失的骨区域的骨移植物材料。过去，移植物材料可以获自接受移植物材料 的个体的骨。然而，这需要额外的手术和额外的康复。骨也可以取自其它来源， 或甚至取自尸体，但这带来了生物相容性问题以及疾病转移的风险。
在用于制备组织的干细胞分化的领域已经进行了许多研究。例如， WO2007/103442公开了一种包含蚕丝支架和成体干细胞的组合物，其中所述成 体干细胞是脂肪来源的干细胞。
[技术问题]
然而，制备用于骨移植物或骨增强或骨重建的多维组织仍然存在实际的技 术问题。在软骨重建或减轻软骨缺损中也存在相同的问题。
因此在本领域中仍然需要这样的组织工程材料，其是完全生物相容的，并 且为特定应用提供适宜的机械特征。
发明内容
本发明涉及天然的人骨诱导性生物材料，其具有多维结构并且包含分化的 间充质干细胞(MSC)组织和脱矿质骨基质(DBM)，其中所述脱矿质骨基质分散 在所述分化的MSC组织内。
用来制备所述分化的MSC组织的MSC是人或动物来源的。
根据第一个实施方案，MSC已经从脂肪组织中分离，并且下文称为脂肪组 织间充质干细胞(AMSC)。
根据另一个实施方案，MSC已经从骨髓中分离，并且下文称为骨髓干细胞 (BMSC)。优选地，包含在本发明的生物材料中的MSC是传代晚期的(late passaged)脂肪组织来源的干细胞。
本发明的生物材料打算用于植入至人或动物体内。植入的生物材料可以是 自体来源的，或同种异体的。本发明的生物材料可以植入至骨或软骨区域中。 本发明的生物材料可以植入至人或动物身体的不规则区域中。
本发明的生物材料是生物相容的。
典型地，本发明的生物材料是均质的，这意味着所述生物材料的结构和/ 或构造在整个组织内是相似的。典型地，本发明的生物材料具有在原始疾病区 域中植入所需的合乎需要的处理和机械特性。
根据具体的实施方案，本发明的生物材料可以使用手术器械夹持而不会被 撕碎。
在本发明的实施方案中，所述生物材料不包含任何粘结剂或粘合剂。
根据优选的实施方案，根据本发明的生物材料是三维的。在此实施方案中， 本发明的生物材料可以形成厚度为至少1mm的厚膜。生物材料的尺寸可以适 当调节以便于使用。在另一个实施方案中，生物材料形成支架；因此，本发明 的生物材料不需要使用任何其它的合成支架。
根据另一个实施方案，本发明的生物材料可以形成小于1mm的薄膜。在 此实施方案中，生物材料是所谓两维的。
根据第一个实施方案，本发明的生物材料具有与实际骨相同的性质，其具 有骨钙蛋白表达和矿化性质，即，其包含骨细胞和中间结缔组织(interconnective tissue)。根据具体的实施方案，本发明的生物材料包含骨细胞(也称为骨细胞样 细胞)和胶原(优选钙化和矿化的胶原)、骨基质和骨细胞上的矿物涂层，所述涂 层为有序的磷钙晶体(organizedphosphocalciccrystal)。典型地，本发明的生物材 料具有与天然骨接近的多孔性。
根据第二个实施方案，本发明的生物材料具有与实际软骨相同的性质，即， 其包含软骨细胞和包含胶原和蛋白聚糖的细胞外基质。
本发明的生物材料的再生性质可以取决于所述生物材料被移植的环境：当 被置于骨质环境中时本发明的生物材料可以是可再生的，并且当被置于非骨质 环境中时可以是不可再生的。
本发明的生物材料为这样的材料：所述生物材料的细胞的分化已经达到终 点，并且当被移植时所述生物材料的表型仍然保持不变。本发明的移植物可以 是多层的，即，其包含至少两层生物材料，所述至少两层可能彼此被缝合在一 起或通过任何合适的方式，诸如例如外科胶或任何合适的固定方式彼此固定在 一起。
典型地，本发明的生物材料包含粒子形式的脱矿质骨基质，所述粒子具有 50-2500μm的平均粒径；在第一个实施方案中，所述粒子的平均粒径为50-125 μm；在第二个实施方案中，所述粒子的平均粒径为125-200μm；在第三个实施 方案中，所述粒子的平均粒径为500-1000μm。典型地，脱矿质骨基质来自年 龄小于40岁的供体。根据一个实施方案，骨基质的脱矿质率为90-99％，优选 95-98％，且甚至更优选约97％。使用HCl0.6N经3小时的过程有利地获得此 脱矿质率。根据特殊的实施方案，脱矿质骨基质被灭菌。
根据具体的实施方案，所述脱矿质骨基质由大学组织库(UniversityTissue Bank)(CliniquesuniversitairesSaint-Luc，Brussels，Belgium)提供。
本发明还涉及一种制备多维生物材料的方法，所述方法包含在15-25天期 间在成骨细胞培养基和/或软骨形成培养基中孵育MSC，然后在所述培养基中 加入脱矿质骨基质并维持孵育另外15-30天的时间，优选15-25天，更优选20 天；在所述另外的时间期间，优选地在不去除脱矿质骨基质的条件下每两天更 换培养基。
在加入脱矿质骨基质之前孵育MSC是本发明的方法的一个关键步骤。此 步骤对于使MSC分化成软骨形成细胞和/或成骨细胞是必不可少的。另外，此 步骤对于获得3D骨样结构是必不可少的。
根据优选的实施方案，MSC是传代晚期的脂肪组织间充质干细胞。
根据一个实施方案，每毫升培养基加入1-20mg脱矿质骨基质。根据优选 的实施方案，每毫升培养基加入1-10mg脱矿质骨基质。
最优选地，每毫升培养基加入5-10mg脱矿质骨基质。所述量的脱矿质骨 基质是用于提供所述生物材料的3D样结构的最适浓度。
根据一个实施方案，所有培养基不含动物蛋白。
根据第二个实施方案，分化培养基包含人血清。有利地，所述分化培养基 不包含任何动物血清，优选其不包含人血清以外的其它血清。
本发明还涉及能够通过本发明的方法获得的多维生物材料。能够通过本发 明的方法获得的生物材料打算用于植入至人或动物身体中。被植入的生物材料 可以是自体来源的，或同种异体的。本发明的生物材料可以植入至骨或软骨区 域中。此生物材料可以植入至人或动物身体的不规则区域中。
能够通过本发明的方法获得的生物材料是生物相容的。
此生物材料是均质的，这意味着所述生物材料的结构和/或构造在整个组织 内是相似的。优选地，此生物材料具有在原始疾病区域中植入所需的合乎需要 的处理和机械特性。典型地，能够通过本发明的方法获得的生物材料可以使用 手术器械夹持而不会被撕碎。
在本发明的实施方案中，所述生物材料不包含任何粘结剂或粘合剂。
在另一个实施方案中，能够通过本发明的方法获得的生物材料是三维的。 在此实施方案中，所述生物材料可以形成厚度为至少1mm的厚膜。生物材料 的尺寸可以适当调节以便于使用。在另一个实施方案中，所述生物材料形成支 架；因此，能够通过本发明的方法获得的生物材料不需要使用任何其它的合成 支架。
还在另一个实施方案中，能够通过本发明的方法获得的生物材料可以形成 小于1mm的薄膜。在此实施方案中，生物材料是两维的。
根据第一个实施方案，就骨钙蛋白表达和矿化性质而言，能够通过本发明 的方法获得的生物材料具有与实际骨相同的性质，即，其包含骨细胞和中间结 缔组织。在一个实施方案中，此生物材料包含骨细胞(也称为骨细胞样细胞)和 胶原(优选钙化和矿化的胶原)、骨基质和骨细胞上的矿物涂层，所述涂层为有 序的磷钙晶体。典型地，所述生物材料具有与天然骨接近的多孔性。
根据第二个实施方案，能够通过本发明的方法获得的生物材料具有与实际 软骨相同的性质，即，其包含软骨细胞和包含胶原和蛋白聚糖的细胞外基质。
能够通过本发明的方法获得的生物材料为这样的材料：所述生物材料的细 胞的分化已经达到终点，并且当被移植时所述生物材料的表型仍然保持不变。 本发明的移植物可以是多层的，即，其包含至少两层生物材料，所述至少两层 可能彼此被缝合在一起或通过任何合适的方式，诸如例如外科胶或任何合适的 固定方式彼此固定在一起。
能够通过本发明的方法获得的生物材料包含粒子形式的脱矿质骨基质，所 述粒子具有50-2500μm的平均粒径；在第一个实施方案中，所述粒子的平均粒 径为50-125μm；在第二个实施方案中，所述粒子的平均粒径为125-200μm； 在第三个实施方案中，所述粒子的平均粒径为500-1000μm。典型地，脱矿质 骨基质来自年龄小于40岁的供体。根据一个实施方案，骨基质的脱矿质率为 90-99％，优选95-98％，且甚至更优选约97％。使用HCl0.6N经3小时的过程 有利地获得此脱矿质率。根据优选的实施方案，脱矿质骨基质被灭菌。
典型地，所述脱矿质骨基质由大学组织库(UniversityTissueBank)(Cliniques universitairesSaint-Luc，Brussels，Belgium)提供。
本发明涉及本发明的生物材料作为医疗设备或包含在医疗设备中，或包含 在药物组合物中的任何用途。
本发明还涉及一种试剂盒，所述试剂盒包含包含本发明的生物材料的医疗 设备和合适的固定装置，所述固定装置诸如例如，外科胶，或组织胶，或任意 的粘合剂组合物，所述粘合剂组合物是生物相容的、无毒的以用于外科用途， 并且可能是生物可吸收的，并且特别地用于将生物组织彼此连接在一起或连接 到被植入的生物材料。
本发明还涉及一种试剂盒，所述试剂盒包含本发明的生物材料，和合适的 固定装置，所述固定装置诸如例如，外科胶，或组织胶，或任意的粘合剂组合 物，所述粘合剂组合物是生物相容的、无毒的以用于外科用途，并且可能是生 物可吸收的，并且特别地用于将生物组织彼此连接在一起或连接到被植入的生 物材料。
在另一个方面，本发明涉及在用于减轻或治疗骨质缺损或软骨缺损的方法 中使用的根据本发明的生物材料。
本发明还涉及一种减轻或治疗哺乳动物中的骨质缺损或软骨缺损的方法， 所述方法包含向所述具有骨质缺损或软骨缺损的哺乳动物施用治疗有效量的如 本文所述的生物材料。
所述生物材料以用于减轻或治疗哺乳动物中的骨质缺损或软骨缺损的有效 量使用。
骨质缺损或软骨缺损的非限制性实例是骨折、骨骼脆弱、骨矿物质密度损 失、关节炎、骨质疏松、骨软化、骨质减少、骨癌、帕哲病(Paget’sdisease)、 硬化病变、骨的浸润性病症、代谢性骨损失。
本发明还涉及所述生物材料在矫形外科，尤其是在颌面或整形外科中的用 途。本发明的生物材料还可以用于风湿病学。
本发明进一步涉及使用本发明的生物材料的方法，所述方法用于支持或纠 正关节、颅-面-上颌骨的先天性或获得性异常，正畸程序，手术、创伤或其它 先天性或获得性异常后的骨或软骨置换，和用于支持其它肌肉骨骼植入物、尤 其是人工和合成植入物。
在另一个方面，本发明涉及用于填充人或动物身体内的骨腔的本发明的生 物材料。
还在另一个方面，本发明涉及用于重建或美容外科的本发明的生物材料。 本发明的生物材料可以是自体的或同种异体的。其可以在组织移植中使用。
本发明进一步涉及一种填充人或动物身体内的腔隙的方法，所述方法包含 施用本发明的生物材料的步骤。
本发明的生物材料可用作同种异体移植物或自体移植物。
所述生物材料也是有利的，其原因在于其是无免疫原性的，并且在于其具 有免疫调节作用：令人惊奇地，在本发明的生物材料中，保留了未分化的MSC 的免疫调节性质，使得将本发明的生物材料植入至人或动物体内不会导致任何 炎症反应：相反，所述生物材料的存在减轻了植入部位的炎症。
本发明的生物材料因此尤其适合于作为抗炎药物的替代品，或作为减少遭 受关节炎导致的后果的患者所需的抗炎药物的量的方式，来治疗关节炎，尤其 是炎性关节炎。
本发明的生物材料进一步有利于刺激血管生成。实际上，生物材料的MSC 释放血管内皮细胞生长因子(VEGF)，其刺激新血管的生长。本发明的此方面是 非常有前途的，因为其为骨或软骨形成提供了最适条件。
[定义]
在本发明的含义中，术语“组织”是指互连细胞(interconnectedcells)的集合 体，所述互连细胞在天然人组织内执行相似的功能。
在本发明的含义中，术语“间充质干细胞”或MSC是可以分化成多种细胞类 型的多能干细胞。
“脂肪”是指任何脂肪组织。脂肪组织可以是褐色的、黄色的或白色的脂肪 组织。优选地，脂肪组织是皮下白色脂肪组织。脂肪组织包含脂肪细胞和基质。 脂肪组织可以存在于动物的身体各处。例如，在哺乳动物中，脂肪组织存在于 网膜、骨髓、皮下空间、脂肪垫(例如，肩胛或髌下脂肪垫)和周围的大多数器 官中。获自脂肪组织的细胞可以包括原代细胞培养或祖细胞系。脂肪组织可以 来自具有脂肪组织的任何生物体。
术语“脂肪组织来源细胞”是指源自脂肪组织的细胞。从脂肪组织分离的初 始细胞群是异源的细胞群，包括，但不限于基质血管成分(SVF)细胞。
当用于本文中时，术语“脂肪组织间充质干细胞”(AMSC)是指源自脂肪组 织的基质细胞，其可充当多种不同细胞类型、诸如但不限于脂肪细胞、骨细胞、 软骨细胞的前体。
当用于本文中时，术语“传代晚期的脂肪组织间充质干细胞”是指与传代早 期的细胞相比表现较少免疫原特性的细胞。脂肪组织来源的基质细胞的免疫原 性与代数相对应。优选细胞已经传代至至少第四代，更优选所述细胞已经传代 至至少第六代，和最优选所述细胞已经传代至至少第八代。
当在此使用时，“生物相容的”是指当被植入至哺乳动物中时不会引起哺乳 动物任何不良应答的任何材料。生物相容材料当引入至个体中时，对该个体是 无毒的或无害的，其也不会诱发所述材料在所述哺乳动物中的免疫排斥。
当在本文中使用时，“自体的”是指来源于个体的生物材料，所述材料以后 将被重新引入至该同一个体中。
当在本文中使用时，“同种异体的”是指来源于与其中将要引入所述材料的 个体相同的物种的基因不同的个体的生物材料。
当在本文中使用时，“移植物”是指被植入至个体中，典型地为置换、纠正 或以其它的方式克服缺损的细胞、组织或器官。所述组织或器官可以由源自同 一个体的细胞组成；此移植物在本文中以下面的可互换术语提及：“自体移植 物”、“自体移植体”、“自体植入物”和“自身移植物”。包含来自同一物种的基因 不同的个体的细胞的移植物在本文中以下面的可互换术语提及：“同种异基因移 植物”、“同种异体移植体”、“同种异体植入物”和“同种异体移植物”。来自其同 卵双生个体的移植物在本文中称为“同基因移植物”、“同系移植体”、“同系植入 物”或“同系移植物”。“异种移植物”、“异基因移植体”或“异基因植入物”是指来 自另一种不同物种的个体的移植物。
当在本文中使用时，术语“组织移植”和“组织重建”均指将移植物植入至个 体中以治疗或减轻组织缺损，诸如例如骨质缺损或软骨缺损。
当在本文中使用时，“减轻”疾病、缺损、病症或病况是指减小所述疾病、 缺损、病症或病况的一个或多个症状的严重性。
当在本文中使用时，“治疗”是指减少患者所经历的疾病、缺损、病症或不 良状况的症状发生的频率。
当在本文中使用时，“治疗有效量”是本发明的组合物足以对施用所述组合 物的个体提供有益效果的量。
当在本文中使用时，“骨质缺损”是指发生破碎、骨折、一部分缺失或以其 它方式受损害的骨。此类损害可能是由于先天性畸形、疾病、疾病治疗、创伤 或骨感染引起的，并且可能是急性的或慢性的。例如，骨质损失可以是由肿瘤 切除术导致发生的，因此导致骨质缺损。骨质缺损的非限制性实例包括：骨折、 骨/脊柱变形、骨肉瘤、骨髓瘤、骨发育不良、脊柱侧凸、骨质疏松症、骨软化、 佝偻病、纤维性骨炎、骨纤维异样增殖症、肾脏骨营养不良和佩吉特骨病(Paget′s diseaseofbone)。
当在本文中使用时，“软骨缺损”是指正在缺失、数量减少或以其它方式受 损的软骨。软骨组织缺损可以由先天性畸形、疾病、疾病治疗或创伤引起，或 可以是急性的或慢性的(骨关节炎)。
当在本文中使用时，术语“成骨细胞和/或软骨形成培养基”意指促进成骨细 胞和/或软骨形成细胞的生长和分化的培养基。
有利地，通过对标准培养基添加人或动物(优选胎牛或牛血清(FCS，FBS)) 血清、地塞米松(dexamethasone)、抗坏血酸钠、磷酸二氢钠、青霉素和链霉素 诱导骨生成。细胞在成骨培养物中培养，培养基每2天更换一次。
在优选实施方案中，成骨细胞培养基是标准培养基，优选DMEM，所述培 养基添加了10％v/v的人血清、1μM的地塞米松、50μg/ml的抗坏血酸钠、36 mg/ml的磷酸二氢钠、100U/ml的青霉素和100μg/ml的链霉素。
有利地通过对标准培养基添加人或动物(优选胎牛或牛血清(FCS，FBS))血 清、地塞米松、TGF-B3、L-脯氨酸、抗坏血酸钠、磷酸二氢钠、丙酮酸钠、ITS (胰岛素-转铁蛋白-硒，例如来自可获自Sigma的胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠培 养基添加物冻干粉末)、青霉素和链霉素诱导软骨形成。
优选软骨形成培养基是标准培养基，优选DMEM，所述培养基添加了10％ v/v的人血清、1μM的地塞米松、10ng的TGF-B3、40μg/ml的L-脯氨酸、50 μg/ml的抗坏血酸钠、36mg/ml的磷酸二氢钠、100μg/ml的丙酮酸钠、100μl/ml 的ITS(胰岛素-转铁蛋白-硒，例如来自可获自Sigma的胰岛素-转铁蛋白-亚硒 酸钠培养基添加物冻干粉末)、100U/ml的青霉素和100μg/ml链霉素。
用于成骨和软骨形成培养基两者的合适标准培养基包括但不限于DMEM、 EMEM、RPMI和GMEM，DMEM是优选的标准培养基。
当在本文中使用时，“支架”是指包括但不限于下列形式的结构：膜(例如， 二维基本上大于第三维的形式)、带、索、薄片、平皿、圆柱体、球体、三维无 定形形状等。
附图说明
图1.图1显示在添加有人血清和DBM的成骨培养基中的人AMSC分化。 通过用TrichromMasson染色法(C)染色发现具有组织收缩和中间结缔组织(B) 的多层结构(A)。
图2.图2显示在不含(A，B)和含(C，D，E)DBM的软骨形成培养基中的 AMSC分化。在不含DBM的软骨形成培养基(B)中形成具有汇合细胞的单层结 构(A)。相反，通过蜂窝状组织收缩(D)获得的多层结构(C)由被阿辛蓝(Alcianblue) 染色的软骨形成样基质(E和经过吉姆萨染色(Giemsastaining)的长方形)组成。
图3.图3显示在不含(A，B，C)和含(D，E，F)DBM的成骨培养基中的人 AMSC分化。在不含DBM的成骨培养基中形成了由单个骨结节(茜素红染色， B)和结节内胶原组织(C)制成的单层结构(A)。相反，具有中间结缔组织(E)的蜂 窝状组织收缩(D)由矿化胶原(F，VonKossa染色呈黑色：左侧长方形)与骨钙蛋 白表达细胞(F，右侧长方形)制成。
图4.图4显示在裸大鼠的椎旁肌肉中植入后60天后的BM-MSC和AMSC 活力。间充质干细胞通过GFP和骨钙蛋白抗体的免疫组织化学进行检测。在单 独骨植入的情况下，没有发现GFP的表达和骨钙蛋白染色细胞。在由“MSC— 人骨移植物”制成的复合移植物的情况下，检测到GFP和骨钙蛋白细胞。
图5.图5显示在添加了DBM的成骨(A-C)和软骨形成(E-F)培养基中孵育的AMSC形成的多维结构。组织收缩(A，D)，DBM相互连接(B，E)以及骨钙蛋白和蛋白聚糖(F)蛋白的表达。
图6.图6显示AMSC相比于BM-MSC的血管生成能力。通过将两种细胞 在不同的氧浓度(0.1、3、5和21％O2)下孵育发现了体外能力。在每个O2浓度 下，AMSC证明VEGF的释放显著高于BM-MSC。
具体实施方式
实施例1
根据本发明的多维生物材料的制备
临床前模型中AMSC的动物来源
绿色荧光转基因猪用作骨髓和脂肪细胞干细胞的供体(BrunettiD，Cloning StemCeils，eupb2008)。依照比利时农业和动物管理部(MinistryofAgriculture andAnimalCare)的指导方针圈养动物。所有程序获得Universitécatholiquede Louvain的动物管理地方伦理委员会批准。
来自动物的AMSC的来源
胶原酶(0.075g)在Hank’s平衡盐液(含有钙离子)中复配并在消化前在2-8℃ 保存。用NaCl0.009％洗涤脂肪组织(均值为15g)三次并在陪替氏培养皿中切割 以去除血管和纤维结缔组织。在消化之前对脂肪称重并将其转移至包含所述酶 的50-mlFlacon试管中。将组织置于37℃的振荡水浴中连续搅动60分钟。消 化后，胶原酶在添加有50ml的人血清、L-谷氨酰胺(5ml)和5ml抗生素(青霉 素/链霉素)的DMEM(500ml)中灭活。收集的组织在室温(20-25℃)下以1500rpm 离心10min。吸取包含成熟脂肪细胞的上清液。沉淀物重新悬浮在20ml由添 加有10％的人血清和抗生素(100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素)的DMEM制 成的增殖培养基(MP)中并通过500μm网筛过滤。收集的组织(过滤后)在室温 (20-25℃)下以1500rpm离心10min，沉淀物重新悬浮在MP中，并被鉴定为基 质血管成分(SVF)细胞。此初代的原代细胞被称为0代(P0)。在5％CO2在37℃ 下孵育24-48小时后，培养物用PBS洗涤并在MP中培养一直到P4(第四代)， 然后在特定培养基(见下)中分化。
来自人的AMSC的来源
在常规外科手术(腹部和矫形外科手术)期间取下人脂肪组织(小片皮下脂肪 组织，1-2g，n＝4)，在冷的4℃生理溶液中保存一直到实验室加工。如先前对 猪脂肪组织加工所述的那样进行人脂肪消化。消化后，人AMSC培养在MP中 并在添加有(i)胎牛血清(10％v/v)或(ii)人血清(10％v/v)的特定培养基(确切组成 见下)中分化。
观察到在包含FBS的分化培养基和包含人血清的分化培养基中AMSC均 分化。
脱矿质骨基质的来源
人脱矿质骨基质由大学组织库(UniversityTissueBank)(Cliniques universitairesSaint-Luc，Brussels，Belgium)提供，并且由多器官人供体制备。切 下股骨或胫骨的骨干并捣碎成1000μm以下的微粒用于脱矿质处理(见下)。
通过将来自所选择的人供体的皮质骨研磨来进行人DBM。首先，人骨组织 通过丙酮(99％)浴脱脂过夜，然后在脱矿质水中洗涤2小时。通过在HCL0.6N 中浸泡3小时(20ml溶液/克骨)并在室温下搅动来进行脱钙。然后，脱矿质骨粉 末用脱矿质水漂洗2小时，并控制pH。如果pH酸性过大，则用0.1M的磷酸 盐溶液在搅动的条件下缓冲DBM。最后，将DBM干燥并称重。DBM在冻结 温度下通过γ照射以25kGray进行灭菌。
干细胞分化和表征
脂肪形成
通过用脂肪细胞诱导培养基替换MP来诱导AMSC的铺满培养物发生脂肪 形成，所述脂肪细胞诱导培养基由添加了20％人血清、L-谷氨酰胺(5ml)、牛胰 岛素(5μg/ml)、吲哚美辛(indomethacine)(50μM)、3-异丁基-1-甲基-黄嘌呤 (IBMX，0.5mM)、地塞米松(1μM)以及青霉素100U/ml和链霉素100μg/ml的 Iscove改良杜氏培养基(IscovemodifiedDulbecco’sMedium)(IMDM)(Mauney JR，Biomaterials2005，第26卷：6167)组成。细胞保持在脂肪形成培养物中，每 2天更换一次培养基。培养物用PBS漂洗并在福尔马林溶液中固定，通过用油 红染色中性脂质来确定脂肪细胞分化。
骨生成
使用成骨培养基诱导AMSC的铺满培养物发生骨生成，所述成骨培养基通 过向DMEM添加人血清(10％v/v)、地塞米松(1μM)、抗坏血酸钠(50μg/ml)、 磷酸二氢钠(36mg/ml)、青霉素(100U/ml)和链霉素(100μg/ml)(参见图3-A、B、 C)获得。细胞保持在成骨培养物中，每2天更换一次培养基。培养物用PBS漂 洗并在70％乙醇中固定，通过用茜素红染色磷酸钙来确定成骨分化。另外，进 行骨钙蛋白的免疫组织化学和vonKossa染色以证实“骨”表型(参见图4)。
软骨形成
使用软骨形成培养基诱导AMSC的铺满培养物发生软骨形成，所述软骨形成培养基通过向DMEM添加人血清(10％v/v)、地塞米松(1μM)、TGF-B3(10ng)、L-脯氨酸(40μg/ml)、抗坏血酸钠(50μg/ml)、磷酸二氢钠(36mg/ml)、丙酮酸钠(100μg/ml)、ITS(胰岛素-转铁蛋白-硒，例如来自可获自Sigma的胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠培养基添加物冻干粉末)(100μg/ml)、青霉素(100U/ml)和链霉素(100μg/ml)(H，ExperimentalCellResearch2008第314卷：2400)获得。细胞保持在软骨形成培养物中，每2天更换一次培养基。
分化培养基的影响(对AMSC的成骨和软骨形成的影响)
生长
细胞和培养条件
AMSC生长在增殖培养基(MP)中并在37℃(95％空气和5％CO2)下保持直 至约85-90％汇合。每两天更换一次培养基。为悬浮细胞用于细胞毒性测定，用 0.25％胰蛋白酶-EDTA混合物在37℃下使细胞从培养瓶上脱离持续10min并且 将其重新悬浮在培养基中。细胞以1x104细胞/孔的密度接种在96孔微量滴定 板中用于MTS(溴化3-[4，5-二甲基噻唑-2-基]-5-[3-羧基甲氧基苯基]-2-[4-磺苯 基]-2H-四唑)。它们在37℃下在96小时生长接近汇合，然后接触不同的测试培 养基5天：(i)MP，(ii)成骨培养基，和(iii)软骨形成培养基。
MTS测定.提取物-细胞接触24小时后，向含有100μl提取物培养基的每孔中直接加入20μl“Celltiter96AQueousOneSolutionCellProliferationAssay”(Promega，Madison，WI)。细胞在37℃下孵育3小时。使用微量滴定板分光光度计(MultiskanEx，Labsystems，Brussels，Belgium)在492nm处测量吸光度。基准波长为690nm。估计光密度差OD＝OD492nm-OD690nm。
观察到仅当使用特定分化培养基时发生分化。
多维结构的形成
在特定(成骨或软骨形成)培养基中孵育AMSC(第4代传代培养物)15-20天 后，将脱矿质骨基质(DBM)添加至成骨和软骨形成培养基中持续另外20天的时 间，以产生多维结构(1mgDBM/ml分化培养基)。在不去除DBM的条件下每2 天更换培养基一次。
在分化结束时，培养物用PBS漂洗并在福尔马林溶液中固定以通过骨钙蛋 白组织学、阿辛蓝和吉姆萨染色表征骨和软骨形成(图2-C、D、E，图3-D、E、 F)。
细胞沉淀物在4％多聚甲醛中固定过夜。连续切片(5μm厚)与脱矿质水被 封固在载玻片上，在37℃干燥12小时，并通过经典的免疫检测或组织化学进 行处理。通过将切片置于过氧化氢(0.3％H2O2)中30min以封闭内源性过氧化物 酶活性。在Tris-Triton缓冲盐水(TBS-0.05M，0.05％，pH＝7.4)中洗涤后，载玻片 与正常山羊血清(1∶10；BIOSYS，Boussens，France)在室温下孵育30分钟，并与 稀释度为1∶100的用于染色骨钙蛋白的一抗(抗骨钙蛋白鼠单克隆抗体；ABCAM， Cambridge，UK)孵育过夜。在用Tris-TBS洗涤后，载玻片与用于免疫过氧化物 酶检测的抗鼠IgG二抗孵育1小时。
通过对每个样品的所有类型未分化/分化细胞的Masson’sTrichrom来研究 胶原结构。在增殖和分化(成骨、软骨形成和脂肪形成)培养基中孵育的成纤维 细胞充当阴性对照。
分泌蛋白聚糖的软骨细胞用阿辛蓝和吉姆萨染色法进行染色。
AMSC用饱和量的与藻红蛋白(PE)缀合的单克隆CD90抗体染色。采用 Celiquest软件通过流式细胞仪(FACScan，BDBiosciences)分析至少15,000个事 件。
在成骨和软骨形成分化培养基中，添加的DBM通过蜂窝状结构、胶原合 成和脱矿质骨基质微粒的重组来诱导三维结构形成(参见图5A-E)。在显微镜 下，分别在成骨(图5C)和软骨形成(图5F)条件下显示了骨钙蛋白表达和蛋白聚 糖分泌。
体内植入和组织学分析
成骨细胞分化的GFP-猪AMSC接种在由大学组织库(Universityclinical hospitalSaint-Luc，Brussels，Belgium)提供的人经处理的/脱细胞骨基质(Dufrane D，EurCellMater，第1卷：52，2001)上。复合移植物经皮下植入至裸大鼠(2个植 入物/受体且n＝10)(雄性，6-8周龄)的椎旁区中。60天后，将动物处死，将植 入物移出用于免疫组织化学处理。然后将植入物在HCL中脱钙，处理并在石蜡 中包埋并切片(5μm)。然后进行Masson’sTrichrom和免疫组织化学以分析骨钙 蛋白和“绿荧光蛋白”(单克隆抗体)。
实施例2：
来源于脂肪间充质干细胞的多维骨样移植物的能力
材料和方法
猪和人AMSC分离
为了实验的目的，如实施例1中公开的那样进行猪和人AMSC分离。
AMSC的血管生成能力
体外
为了评估干细胞在含氧量正常和低氧条件下的体外促血管生成能力，猪骨 髓-MSC和脂肪-MSC在低氧室中在0.1、3、5和21％O2下放置24、48和72hr， 并通过ELISA测试定量VEGF的释放。
用脱矿质骨基质优化多维结构
通过对MP添加胎牛血清(FBS，10％v/v)、地塞米松(1μM)、抗坏血酸钠(50 μg/ml)、磷酸二氢钠以及青霉素100U/ml和链霉素100μg/ml诱导AMSC发生 骨生成。细胞保持在成骨培养物中，培养基每两天更换一次(Post等.Bone2008， 43，1；32-39；Qu等InVitroCell.Dev.Biol.Anim.2007；43；95-100)。培养物用 PBS漂洗并在70％乙醇中固定，通过用茜素红染色磷酸钙来确定成骨分化。另 外，进行骨钙蛋白的免疫组织化学和vonKossa染色以证实“骨”表型。
多维结构与AMSC在存在由大学组织库(UniversityclinicalhospitalSt-Luc， Brussels，Belgium)获得的“脱矿质骨基质(DBM)”的情况下进行共孵育。脱矿质骨 基质的制备公开在实施例1)脱矿质骨的来源中。
基质
DBM的功效通过以下评估：(i)在脱矿质过程后测量的残留钙浓度(＞97％ [钙]减少)和(ii)在植入后1月时的体内(在裸大鼠中)成骨能力。在成骨细胞培养 基中孵育AMSC(第4代传代培养物)平均15-18天后，在特定的分化培养基中 加入不同浓度(0/1/5/10和20mg/ml)的DBM。在不去除DBM的条件下每两天 更换一次培养基。评估3D结构、蜂窝状结构、骨钙蛋白表达和VonKossa染 色(用于钙沉积)的程度来选择用于3D骨样结构的适宜DBM浓度。
具有脱矿质骨基质和AMSC的多维结构的植入操作和随访。
收集从具有最适DBM浓度(用于多维结构)的成骨培养物(第4代)中获得的 AMSC用于植入。
-裸大鼠(CharlesRiverLaboratoriesInternational，Inc.，Wilmington， Massachusetts，USA)用作受体。细胞植入至椎旁肌中。在脊柱上作纵向正中切 口，切开皮下组织以暴露筋膜。多维结构(大学组织库，UniversitéCatholiquede Louvain，Brussels，Belgium)直接植入至椎旁肌群中。通过在同一大鼠的对侧椎旁 肌中仅植入冻干的松质骨作为对照。使用不可吸收的缝合线缝合筋膜以便于植 入部位恢复。将动物处死并在移植后30天时通过T61心内注射(IntervetInt. GmbH-D，Germany)的方式在全麻下移出植入物。然后收获并处理植入物以用于 组织学和计算机体层摄影。
-猪受体.移植物在两种不同的外科模型中测试。本发明分析：(i)它们在 股骨皮质骨缺损中的桥接能力和(ii)它们在前腰椎体间融合(ALIF)中的融合能 力。
-(i)皮质骨缺损模型在实验性矫形外科中是为人所熟知的并且在我们实 验室中主要通过C.Delloye教授的工作获得。猪用于类似的模型中，在所述模 型中在长骨上建立节段性骨干骨缺损，然后填充移植材料或使其空置。在我们 的实验中，在猪的两根股骨上进行操作。制造1.5-cm皮质骨缺损并通过标准的 4.5-mm钛锁定加压钢板进行稳定。使一个股骨缺损空置，将AMSC移植物植 入至对侧腿中。
-(ii)在猪实验外科中ALIF模型已得到公认。我们的技术包含通过后外 侧入路的4水平ALIF操作。借助于椎体间聚醚醚酮(PEEK)笼获得融合。打开 椎间盘并取出髓核，刮除软骨以暴露软骨下骨，然后插入PEEK笼。这些笼被 设计为是空的但可以填充各种实验材料。在此情况下，每个水平将接受不同的 移植组织，从而建立4个不同的组：一个笼空置作为阴性对照，一个笼填充以 冻干的辐照松质骨(如在临床场所中经常实施的那样)，一个笼包含自体松质骨 移植物(在融合手术操作中被认为是金标准，因此作为我们的阳性对照)，最后 一个笼是AMSC移植物。将动物处死并在移植后7周时通过T61心内注射 (IntervetInt.GmbH-D，Germany)的方式在全麻下移出植入物。然后收获并处理 植入物以用于组织学和计算机体层摄影。
随访
裸大鼠：
移出的植入物在HCl中脱钙，处理，包埋在石蜡中并切片(5μm)。利用 Hemalun伊红、Masson’sGreenTrichrom、骨钙蛋白和VonKossa染色的标准显 色用于组织学染色。如通过EnvisionRsystem单克隆抗体(Dako，Denmark)显示， 借助于单克隆抗体(OC4-30，Abcam，Cambrige)获得骨钙蛋白染色。使用pQCT (外围定量计算机体层摄影机(Peripheralquantitativecomputedtomography machine)，型号XCTResearchSA，Stratec，Pforzheim，Germany)分析收获的植入 物的显微结构。在每个植入物的多个载片上测量皮质骨和总骨密度。通过在von Willebrandt染色(见上)后定量新形成的血管来进行体内新生血管生成的定量。
猪：
猪单独地圈养，自由进食和饮水。遵循实验动物管理的标准实验方案提供 术后护理和止痛。在自体移植物模型中，生物学随访将包含借助于血样的炎症 评估。
放射学随访使我们能够通过在植入后1、5和7周时进行计算机体层摄影 (CT)扫描来比较体内骨形成。临床CT扫描的高分辨率和多维平面重建如此精 确使得发明人可以分析体内PEEK笼的内容物，由此能够评价融合过程。
同样的操作用于股骨上，通过一次扫描采集所有信息。在安乐死后通过以 显微-CT处理移出的移植物来获得甚至更好的分辨率。对移出的移植物进行组 织学和免疫组织化学研究，从而与天然皮质桥接和融合能力相比较，评估新骨 形成和移植物血运重建(血管内皮生长因子、CD51、vonWillebrand因子)、硬化 (骨钙蛋白)和矿化(vonKossa)。
脱钙过程允许对移植的材料进行组织学和免疫组织化学研究。组织学、组 织形态测量学和显微射线照相术要求保持组织钙化；因此不脱钙的处理也是可 以的。
统计学
组间差异的统计学显著性通过使用Bonferroni事后检验的单因素方差分析 来检验。统计检验采用Systat8.0版来进行。p＜0.05时认为差异是显著的。
结果
具有最适DBM浓度的多维结构的概念验证：体外骨样结构
考虑到回避AMSC细胞移植的生物学支持问题，结合DBM开发了多维结 构。具有在体内促进裸大鼠(质量控制要求先前接触AMSC使用)中的成骨分化 的能力的脱矿质骨基质(平均粒径为700μm)对于与AMSC共孵育以实现体外细 胞重塑是必需的。
在两种成骨分化培养基中，与不添加DBM的单独AMSC相比，添加的DBM 通过细胞收缩、胶原合成和DBM微粒的重组诱导三维结构形成。考虑到优化 多维结构的形成，测试递增的DBM剂量。发现极端浓度(超过20mg/ml)不适用。 1mg/ml不会形成最适3-D结构以用于进行外科应用的移植物处理。相反，发 现5和10mg/ml形成最适的组织收缩以用于移出移植物和外科应用。在显微镜 下，使用最后面的这些DBM浓度显示了骨钙蛋白表达和矿化过程(VonKossa 染色)。与DBM共孵育平均20±3天对于在成骨条件下获得具有AMSC的三维 结构是必需的。
具有最适DBM浓度的多维结构的概念验证：体内骨生成
裸大鼠
在裸大鼠中植入后30天后，不添加DBM的单独AMSC不会诱导新的骨 样结构形成。仅有通过VonKossa染色的小骨结节(骨钙蛋白+)零星地分布在裸 大鼠肌群中。相反，在植入部位的良好定位下容易进行多维结构的植入。在植 入后30天后，发现紧密的/坚固的骨样结构进入了肌肉中，在显微镜下为DBM 微粒内的致密结缔组织。发现具有骨钙蛋白染色的结缔组织和矿化过程的骨样 结构。
猪受体
在植入后5周后，通过CT-扫描显示在猪中没有发现股骨缺损的自发性硬 化(未治疗)。在不使用任何支架的条件下，容易将该多维结构插入至骨缺损中。 该后一个移植物采用桥接原始皮质骨缺损的骨样结构显著地改善了植入后早期 (移植后5周)时的骨硬化。
具有最适DBM浓度的多维结构的概念验证：体内血管生成
为了评估干细胞在含氧量正常和低氧条件下的体外促血管生成能力，临床 前的猪骨髓-MSC和脂肪MSC在低氧室中在0.1、3、5和21％O2下放置24、 48和72hr，并通过ELISA定量VEGF的释放。在低氧条件下BM-MSC释放的 VEGF比在含氧量正常的条件下多，并且在所述时间内维持此分泌，在48和 72hr时的VEGF水平高于24hr时(p＜0.05)。相反，在不同的培养条件下从AMSC 的VEGF释放相似，但由AMSC释放的VEGF水平显著高于BM-MSC(分别为： 11274±679相比于2364±94pg/ml；p＜0.05)(图6)。
这些结果在移植BM-MSC和AMSC后在体内得到证实。发现与BM-MSC 相比，在成骨AMSC移植的情况下血管生成显著较多(p＜0.05)。