含有 4'- 去甲基川陈皮素或 4'- 去甲基橘皮素作为活性成分 的神经突起伸长剂、 记忆力改善剂和抗阿尔茨海默氏症剂 以及制造该化合物的方法 技术领域 本发明涉及一种 4'- 去甲基川陈皮素或 4'- 去甲基橘皮素的制造方法， 该制造方 法包括 ： 利用特定种类的曲霉菌 (Aspergillus mold) 对特定种类的柑橘的皮进行发酵而获 得发酵物。本发明还涉及一种含有所述化合物作为活性成分的药物制剂 ( 神经突起伸长 剂、 记忆力改善剂、 或抗阿尔茨海默氏症剂 )。
背景技术 作为多甲氧基黄酮类的川陈皮素 (nobiletin) 和橘皮素 (tangeretin) 是柑橘所 特有的黄酮类， 近年来已发现这类化合物具有多种生理活性， 如预防癌症、 延缓衰老和抗动 脉粥样化活性。此外， 已有报道川陈皮素具有阿尔茨海默氏症改善活性 ( 参见非专利文献 1) 和神经突起伸长活性 ( 参见专利文献 1)。
另一方面， 关于川陈皮素和橘皮素生理活性的所有研究是对于川陈皮素和橘皮素 本身 ( 未改变的化合物 ) 进行的， 但是近来的报道指出这两种化合物自小肠粘膜被吸收并 被代谢成为一些去甲基化的化合物， 这两种化合物中的 6- 甲氧基均被部分地去甲基化 ( 参 见非专利文献 2)。
使用以下的合成的去甲基化化合物对川陈皮素癌症抑制活性的研究的实例表明 ： 就通过抑制一氧化氮 (NO)、 诱导型一氧化氮合成酶 (iNOS) 和环氧化酶 -2(COX-2) 的合成来 防止癌症发生的效果 ( 其中 NO、 iNOS 和 COX-2 促进炎症及癌症发生 ) 而言， 三种去甲基化 的去甲基川陈皮素 ( 特别是， 3'- 去甲基川陈皮素、 4'- 去甲基川陈皮素、 和 3',4'- 二去甲 基川陈皮素 ) 均具有显著高于川陈皮素本身的效果。 特别是， 4'- 去甲基川陈皮素具有高活 性 ( 参见非专利文献 3)。
作为存在于柑橘中且具有羟基的多甲氧基黄酮类， 对在 5 或 3' 位具有羟基的从 柑橘中获得的两种多甲氧基黄酮类 ( 特别是， 5- 羟基 -3,6,7,8,3',4'- 六甲氧基黄酮和 3'- 羟基 -5,6,7- 三甲氧基黄酮 ) 的生理活性研究也表明， 这些化合物强烈抑制 iNOS 和 COX-2 的 mRNA 表达并且诱导乳癌细胞的凋亡。
以上两个研究均提示， 通过用羟基取代部分甲氧基显著增强多甲氧基黄酮类的生 理功能， 去甲基多甲氧基黄酮类有望用作功能成分。
然而， 任何目前已知天然物质中所含有的、 其中部分甲氧基已被羟基取代的这种 多甲氧基黄酮类的含量却非常低， 因此使用这些物质作为原材料来提取并应用该成分是不 现实的。
引用文献列表 专利文献 专利文献 1: 日本特开 2002-60340 号公报 非专利文献非专利文献 1 ： J Pharmacol Exp Ther.2008,326:739 非专利文献 2 ： Koga N.et al.:Biol.Pharm.Bull.,2007,30:2317 非专利文献 3 ： Li S.et al.:Bioorg.Med.Chem.Lett.,2007,17:5177。 发明内容 发明要解决的问题 本发明的目的是解决上述问题， 并且通过原材料容易获得、 步骤简单、 口服摄入安全性 高的方法来制造具有优异生理活性的去甲基多甲氧基黄酮。
解决问题的手段 鉴于上述情况， 本发明的发明人利用以高含量含有多甲氧基黄酮类的柑橘皮尝试了多 种生物转化， 结果发现通过利用特定种类的曲霉菌进行发酵可产生部分去甲基化的多甲氧 基黄酮类。然后， 本发明人阐明了这些化合物具有 4'- 去甲基川陈皮素和 4'- 去甲基橘皮 素的分子结构， 它们均具有优异的癌症预防活性并且在 4' 位被羟基取代。
同时， 本发明的发明人首次发现 4'- 去甲基川陈皮素和 4'- 去甲基橘皮素均具有 神经突起伸长活性。此外， 本发明人发现这两个合物与未改变的化合物 ( 即， 川陈皮素和橘 皮素 ) 相比具有显著增强的活性。此外， 本发明人还发现这两个化合物具有优异的记忆改 善活性。
本发明基于上述发现而完成。
亦即， 本发明的第一方面涉及 4'- 去甲基川陈皮素的制造方法， 该方法包括 ： 泡 盛 曲 霉 (Aspergillus awamori )、 米曲 利 用 选 自 白 曲 霉 (Aspergillus kawachii )、 霉 (Aspergillus oryzae )、 酱 油 曲 霉 (Aspergillus sojae )、 斋 藤 曲 霉 (Aspergillus
saitoi )、 宇佐美曲霉 (Aspergillus usamii ) 的一种以上曲霉菌对柑橘皮或其水提取物进 行发酵而获得发酵物， 其中所述皮来源于选自属于柑橘属后生柑橘 (Metacitrus ) 亚属柑 组的柑橘类或者属于柑橘属初生柑橘 (Archicitrus ) 亚属橙组的柑橘类中的至少一种柑橘。 此外， 本发明的第二发明涉及一种 4'- 去甲基橘皮素的制造方法， 该方法包括 ： 利 用选自白曲霉、 泡盛曲霉、 米曲霉、 酱油曲霉、 斋藤曲霉和宇佐美曲霉的一种以上曲霉菌对 柑橘皮或其水提取物进行发酵而获得发酵物， 其中所述皮来源于选自属于柑橘属后生柑橘 亚属柑组的柑橘类或者属于柑橘属初生柑橘亚属橙组的柑橘类中的至少一种柑橘。
此外， 本发明的第三方面涉及一种神经突起伸长剂， 其含有 4'- 去甲基川陈皮素 作为活性成分。
此外， 本发明的第四方面涉及一种神经突起伸长剂， 其含有 4'- 去甲基橘皮素作 为活性成分。
此外， 本发明的第五方面涉及一种神经突起伸长剂， 其含有 4'- 去甲基川陈皮素 和 4'- 去甲基橘皮素作为活性成分。
此外， 本发明的第六方面涉及一种记忆改善剂或抗阿尔茨海默氏症剂， 其含有 4'- 去甲基川陈皮素作为活性成分。
此外， 本发明的第七方面涉及一种记忆改善剂或抗阿尔茨海默氏症剂， 其含有 4'- 去甲基橘皮素作为活性成分。
此外， 本发明的第八方面涉及一种记忆改善剂或抗阿尔茨海默氏症剂， 其含有 4'- 去甲基川陈皮素和 4'- 去甲基橘皮素作为活性成分。
发明的效果 本发明通过利用特定的曲霉菌对用作原材料的特定柑橘进行发酵 ( 利用原材料非常 容易获得且步骤非常简单的方法 )， 而使作为优异功能成分的 4'- 去甲基川陈皮素和 4'- 去 甲基橘皮素的简单大规模生产成为可能。
本发明还使得可提供来源于天然食用植物的、 安全的 4'- 去甲基川陈皮素和 4'- 去甲基橘皮素。
本发明还使得可提供一种含有上述 4'- 去甲基川陈皮素或 4'- 去甲基橘皮素作为 活性成分的功能食品或饮料或药物制剂 ( 癌症预防剂、 神经突起伸长剂、 记忆改善剂、 或抗 阿尔茨海默氏症剂 )。 附图说明
[ 图 1] 为显示在实施例 1 中利用曲霉菌进行发酵前后的 HPLC 分析结果的图。
[ 图 2] 为显示在实施例 4 中所确定的 4'- 去甲基川陈皮素的分子结构的图。 [ 图 3] 为在实施例 5 中所确定的 4'- 去甲基橘皮素的分子结构的图。
[ 图 4] 为在实施例 6 中对多种试样的神经突起伸长活性进行比较的图像。
[ 图 5] 为在实施例 9 中将试样给予小鼠给药时对自发变换行为 ( 代表空间工作记 忆的指标 ) 进行比较的图表。
具体实施方式
在下文中对本发明进行详细说明。
本发明涉及一种 4'- 去甲基川陈皮素或 4'- 去甲基橘皮素的制造方法， 该方法包 括： 利用特定种类的曲霉菌对特定种类的柑橘的皮进行发酵而获得发酵物。本发明还涉及 一种含有所述化合物作为活性成分的药物制剂 ( 神经突起伸长剂、 记忆改善剂、 或抗阿尔 茨海默氏症剂 )。
[ 原材料 ] 可用于本发明的原材料， 是含有多甲氧基黄酮类 ( 具体地， 川陈皮素和橘皮素 ) 的柑橘 的 “皮” 。应当指出的是也可使用水果 ( 全果包括果皮、 果汁、 果肉、 和种子 )， 但从多甲氧基 黄酮含量和废物有效利用的观点来看， 理想的是仅使用果皮。
应当指出的是， 也可使用包含柑橘植物其它部分 ( 如叶、 芽、 茎、 和花 ) 的原材料， 但从多甲氧基黄酮含量的观点来看， 理想的是该材料不包含这些部分。
任何属于柑橘属后生柑橘亚属柑组的柑橘或者属于柑橘属初生柑橘亚属橙组的 柑橘， 无论品种和系统如何均可使用。
这里， 后生柑橘亚属中的柑组或者初生柑橘亚属中的橙组是由田中长三郎的分类 所定义的分类学组 (Tanaka T.,Bull. Univ.Osaka Pref.,Ser.B.21,139-145(1969))， 柑 组包括温州蜜柑 (Citrus unshiu )、 芦柑 (Citrus reticulate ， 又名 : 椪柑 )、 橘柚 （Citrus mandarin , 又名 : 地中海橘柚 )、 红橘 ( 又名 : 丹西橘 )、 地蜜柑 (Citrus succosa )、 立花橘 (Citrus tachibana )、 乳橘 (Citrus kinokuni )、 扁平橘 (Citrus depressa )、 Shikaikan 、 朱橘 (Citrus erythrosa )、 和日本酸橘 (Citrus keraji )。
同时， 橙组包括甜橙、 伏令夏橙 (Citrus sinensis Valencia )、 伊予柑 (Citrus iyo )、 日向夏蜜柑 (Citrus tamurana )、 和春光柑 (Citrus shunkokan )。
特别是从多甲氧基黄酮含量和废物有效利用的观点来看， 优选柑组的芦柑 ( 又 名 : 椪柑 )、 扁平橘、 红橘和立花橘。
本发明中用作原材料的柑橘， 优选使用刚收获采集的新鲜水果或用水清洗的水 果， 但也可使用经干燥、 冷冻或长期保存的水果。
此外， 在本发明中用作原材料的柑橘可以原样的形式使用， 但优选利用切割、 破碎 和研磨中的任一种方式对柑橘进行处理。
此步骤包括对用作原材料的柑橘的多种处理， 例如切割成几大块、 切割成小块、 破 碎、 研磨和粉碎。优选地， 该步骤通过将原材料切割成尺寸约为 1 厘米至数厘米的大块来进 行。
此外， 也可使用通过预先从这种原材料中提取 ( 特别是水提取 ) 多甲氧基黄酮类 所获得的提取产品 ( 提取物或干燥物 )、 或者以纯多甲氧基黄酮类的形式所分离的产品。
应当指出的是， 就水提取物的条件而言， 所述提取可通过如下方式进行 ： 以果皮的 1 至 50 倍 ( 重量比 )、 优选 2 至 15 倍的量加入溶剂， 在 0℃至溶剂沸点、 优选室温至溶剂沸 点以下范围内的温度条件下， 将混合物浸泡或摇动 5 分钟至 1 个月、 优选 20 分钟至 1 周。
此外， 特别理想的是在高温下进行水提取 ( 热水提取 )。具体地， 理想的是在 90℃ 以上 ( 优选在沸腾状态下 ) 进行约数分钟至数小时 ( 例如， 5 分钟至 5 小时 ) 的提取。
提取后所得提取液 ( 提取物 ) 可以直接用于后续的曲霉菌发酵， 但理想的是对该 提取液进行过滤或离心以除去固体物 ( 果皮的残留物等 ) 后再用于发酵。
应当指出的是， 可以通过将溶剂再次加入所除去的固体物中进行多次提取， 来提 高提取效率。
可对如此获得的提取液 ( 提取物 ) 进行干燥处理 ( 冷冻干燥、 使用蒸发器进行干 燥等 )， 以制备干燥物。
[ 曲霉菌发酵 ] 本发明包括使用以上述方式制备的发酵原材料 ( 果皮、 或者果皮的水提取物 ) 作为基 质利用曲霉菌进行发酵而获得发酵物的步骤。
应当指出的是， 优选的是在进行曲霉菌发酵前对上述发酵原材料进行热处理从而 对原材料中的无用细菌进行灭菌。
作为用于原材料发酵的曲霉菌， 可使用白曲霉、 泡盛曲霉、 米曲霉、 酱油曲霉、 斋藤 曲霉或宇佐美曲霉。此外， 这些曲霉菌也可组合使用。
曲霉菌中， 白曲霉、 泡盛曲霉和米曲霉因为可以高含量地获得 4'- 去甲基川陈皮 素和 4'- 去甲基橘皮素， 故优选使用。
在将上述曲霉菌接种入发酵原材料的方法中， 可将曲霉菌孢子直接喷洒在发酵原 材料上， 使得孢子粘附在原材料上。 可选地， 可通过散布预先利用液体培养由曲霉菌的预发 酵所获得的培养基， 而将上述曲霉菌接种入整个发酵原材料中。
在将上述曲霉菌接种入发酵原材料中的情况下， 优选的是在有氧条件下进行微生 物发酵， 因此例如优选的是使用具有宽底的圆柱形浅容器进行发酵。可将发酵原材料均匀地散布于这种容器的底部， 以增加与空气的接触面积。
同时， 在发酵原材料是液体的情况下， 优选的是进行如通气或搅拌的处理。
发酵是在适于上述曲霉菌生长的条件下， 即在优选 10 至 40℃、 更优选 20 至 40℃、 更优选 25 至 32℃的温度下进行。此外， 发酵优选的是在适于上述曲霉菌生长的条件下， 即 在暗处进行。而且， 在发酵原材料不是液体的情况下， 优选的是原材料中含有足够量的水 ( 例如， 水含量为 25% 以上 )。
制造大量 4'- 去甲基川陈皮素和 4'- 去甲基橘皮素的微生物发酵的发酵期优选为 2 至 21 天、 更优选为 3 至 14 天、 进一步优选为 4 至 12 天。
在发酵期短于 2 天的情况下， 不能充分地获得 4'- 去甲基川陈皮素和 4'- 去甲基 橘皮素， 这是因为利用上述曲霉菌的微生物发酵难以进行。相反， 在发酵期超过 21 天的情 况下， 通过微生物转变所产生的 4'- 去甲基川陈皮素和 4'- 去甲基橘皮素逐渐地被分解， 从 而导致来源于柑橘的香气消失。
同时， 在本发明的曲霉菌发酵中， 利用由曲霉菌分泌的酶使多甲氧基黄酮去甲基 化而成为去甲基多甲氧基黄酮。
因此， 代替曲霉菌发酵， 还可以对曲霉菌或发酵后所得发酵物进行溶液提取， 而制 备含有能够使多甲氧基黄酮去甲基化的酶的酶溶液， 接着使用所述酶进行与原材料的酶反 应而制备反应产物， 由此获得去甲基多甲氧基黄酮。 具体地， 可以通过收集曲霉菌发酵后来自发酵物的水溶液并使用该水溶液作为粗 酶溶液来进行酶反应。
当进行本发明的曲霉菌发酵时， 作为柑橘原材料中的多甲氧基黄酮类的所有川陈 皮素和橘皮素均被转化为 4'- 去甲基川陈皮素和 4'- 去甲基橘皮素。
具体地， 柑橘原材料的曲霉菌发酵可以产生以高含量含有 4'- 去甲基川陈皮素和 4'- 去甲基橘皮素的曲霉菌发酵物， 即， 基于干重含有约 0.5 至 1.5 质量 %( 具体地约 1 质 量 %) 的 4'- 去甲基川陈皮素， 并且基于干重含有约 0.25 至 0.75 质量 %( 具体地约 0.5 质 量 %) 的 4'- 去甲基橘皮素。
因此， 以上述方式获得的曲霉菌发酵物可以直接或者在对该材料进行加工 ( 例 如， 破碎、 研磨、 粉碎、 干燥等 ) 后用作药物或功能食品的原材料。
[ 溶液提取 ] 应当指出的是， 从纯度的观点出发， 理想的是以溶液提取的方式从霉菌发酵后所得发 酵物中获得提取物。
可对曲霉菌发酵物直接进行溶液提取步骤， 但更理想的是对利用破碎、 压碎、 研 磨、 粉碎等中的任一方法处理曲霉菌发酵物所得产物进行溶液提取步骤。
溶液提取步骤中使用的溶剂可以是水、 缓冲液、 有机溶剂或含水溶剂。 有机溶剂的 实例包括 ： 低级脂肪醇 ( 如乙醇、 甲醇、 异丙醇、 或丁醇 )、 丙酮、 乙酸乙酯和氯仿。
这些溶剂中， 从提取效率、 操作性和安全性的观点来看， 特别优选的是水、 乙醇或 含水乙醇。
此外， 特别优选的是使用最终浓度为 55% 以上、 优选 60% 以上、 更优选 80% 以上的 乙醇进行提取， 因为这样能够抑制杂质 ( 即多糖类 ) 的溶出并提高去甲基多甲氧基黄酮的 提取效率。
就提取条件而言， 可通过如下方式进行提取 ： 以原材料 ( 优选破碎物 ) 的 1 至 50 倍 ( 重量比 )、 优选 2 至 15 倍的量加入溶剂， 并且在 0℃至溶剂沸点、 优选室温至溶剂沸点 以下的温度条件下， 对混合物进行 5 分钟至 1 个月、 优选 20 分钟至 1 周的浸泡或摇动。
可对所得提取液进行冷冻干燥或者用蒸发器等进行干燥， 以制备浓缩干燥产物。
此外， 可使用多种不同溶剂来实施多次溶液提取步骤。 特别是， 在使用水或低浓度 含水醇进行第一次提取时， 可以通过随后使用浓度等于或大于上述特定浓度的乙醇进行提 取， 而提高去甲基多甲氧基黄酮的提取效率。
然后， 可将以上述方式获得的提取物 ( 上述提取液或者浓缩干燥产物 ) 用作药物 及功能食品的原材料。
[ 纯化 ] 此外， 可对提取物或产物实施纯化步骤以提高纯度。
纯化步骤可以通过液 - 液分离提取或者通过使用例如硅胶、 化学改性硅胶、 活性 炭或合成吸附树脂载体的柱纯化来提高纯度。
作为实例， 本文揭示用以提高去甲基多甲氧基黄酮纯度的纯化条件。
首先， 将通过从提取液中除去乙醇所获得的液体 ( 具体地， 利用乙醇提取所获得 的提取液 ) 加入到用水平衡的包含多孔合成吸附树脂 ( 具体地， DIAION HP-20[ 由三菱化 学公司制造 ]) 的柱中。然后， 除去用水洗脱的成分， 再除去用 39 至 41% 乙醇 ( 具体地 40% 乙醇 ) 洗脱的液体。然后， 收集用 44 至 46% 乙醇 ( 具体地 45% 乙醇 ) 洗脱的成分， 由此获 得纯度提高的含去甲基多甲氧基黄酮的组合物。 应当指出的是， 如果在前述优选条件下进行提取和纯化， 可以获得纯度为 80% 以 上的富含去甲基多甲氧基黄酮的组合物。
此外， 可进一步对以上述方式获得的含去甲基多甲氧基黄酮的组合物进行 ODS 柱 层析 ( 具体地， 用 45% 甲醇进行洗脱 )、 薄层层析 (TLC)[ 具体地， 使用己烷 / 乙醇 (7:3)]、 或 ODS-HPLC( 具体地， 37%(v/v) 乙腈溶于水中的混合溶剂 ) 处理， 并收集目标峰， 由此分离 出各个去甲基多甲氧基黄酮的纯产物。
具体地， 以上述方式获得的去甲基多甲氧基黄酮类是 “4'- 去甲基川陈皮素” (参 见下面的化学式 1) 和 “4'- 去甲基橘皮素” ( 参见下面的化学式 2)。
所述化合物是通过在 4' 位进行去甲基化而获得的川陈皮素和橘皮素的一去甲基 化产物。与各自未改变的化合物相比， 所述化合物由于去甲基化而显示更高的极性并且在 醇类和水中的溶解性更好。
[ 化学式 1]
[ 化学式 2][ 生理活性 ] 与未改变化合物 ( 川陈皮素和橘皮素 ) 相比， 以上述方式获得的 4'- 去甲基川陈皮素 和 4'- 去甲基橘皮素具有更优异的 “神经突起伸长活性” 。此外， 所述化合物在临床上具有 优异的 “记忆改善活性” 和 “抗阿尔茨海默氏症活性” 并且提供针对痴呆症和阿尔茨海默氏 症的有效的治疗、 改善和预防活性。 应当指出的是， 所述化合物对于健康对象的健忘症和记 忆丧失也具有有效的改善和预防活性。
此外， 所述化合物有望提供对可通过神经突起伸长活性来改善的神经系统疾病有 效的治疗、 改善和预防活性。
此外， 与未改变的化合物 ( 川陈皮素和橘皮素 ) 相比， 4'- 去甲基川陈皮素和 4'- 去甲基橘皮素具有更优异的 “癌症预防活性” 。特别是， 4'- 去甲基川陈皮素具有极高的 活性 ( 参见 Li S.et al.:Bioorg.Med.Chem.Lett.,2007,17:5177)。
本文所用的 “癌症预防活性” 具体包括 ： 通过抑制一氧化氮 (NO)、 诱导型一氧化氮 合成酶 (iNOS)、 和环氧化酶 -2(COX-2) 的合成来防止癌症发生 ； 或者诱导乳癌细胞的凋亡。
[ 药物以及功能食品或饮料 ] 以上述方式获得的 4'- 去甲基川陈皮素或 4'- 去甲基橘皮素 ( 具体地， 作为 “曲霉菌发 酵物” 、 “发酵后的溶液提取物” 、 “纯化产物” 、 或 “分离产物” )， 可通过将所述化合物与多种 原材料混合而用作药物或功能食品或饮料中的活性成分。
应当指出的是， 所述化合物是通过对多甲氧基黄酮类进行去甲基化所获得的 “去 甲基多甲氧基黄酮类” ， 因此与未变化的多甲氧基黄酮类相比具有更高的极性并且具有更 好的水溶性。因此， 所述化合物可以采用多甲氧基黄酮类难以采用的形态。此外， 所述化合物可以以含有所述化合物中的一个、 或者含有所述化合物两者的 方式来使用。
关于 4'- 去甲基川陈皮素或 4'- 去甲基橘皮素的有效剂量， 当体重为 60 kg 成人 每人每天以 1 mg 以上、 优选 10 mg 以上的量口服摄入所述化合物时， 可以获得上述的优异 生理活性 ( 特别是神经突起伸长活性、 记忆改善活性、 和抗阿尔茨海默氏症活性 )。
因此， 当以可确保所需量的上述形态和摄取方法 ( 次数、 剂量 ) 摄入 4'- 去甲基川 陈皮素或 4'- 去甲基橘皮素时， 可期待获得上述药理活性。然而， 理想的是根据对象的年 龄、 体重和症状、 以及摄入方案、 剂型等来适当地确定形态和摄入方法。
同时， 所述化合物在药物或功能食品或饮料中的含量， 可以是确保上述必需摄入 剂量的量， 具体地， 含量为 0.1 质量 % 以上、 优选为 0.5 质量 % 以上、 更优选为 3 质量 % 以上。 此外， 含量的上限为例如 50 质量 % 以下。
作为 “药物” ， 可将所述化合物制成例如粉剂、 微粒剂、 颗粒剂、 填充了所述化合物 的胶囊、 将所述化合物分散于水中的溶液剂、 或者通过将所述化合物与填充剂共混所获得 的片剂等。
此外， 作为 “功能食品或饮料” ， 可将所述化合物与各种食品原材料混合并且加到 例如饼干、 点心、 口香糖、 咀嚼片、 清凉饮料、 饮料、 汤、 果冻或糖果中。
应当指出的是， 一般认为以上述方式获得的 4'- 去甲基川陈皮素和 4'- 去甲基橘 皮素对所有哺乳动物均有效。因此， 可用常规方式使所述化合物转变为适合于用于宠物和 家畜的药物的剂型。此外， 可将所述化合物转变为饲料和宠物食品的形态。 实施例 以下通过实施例来说明本发明， 但本发明的范围并不受这些实施例的限制。
< 实施例 1> 芦柑 ( 又名 : 椪柑 ) 果皮的曲霉菌 ( 泡盛曲霉 ) 发酵 将芦柑 ( 又名 : 椪柑 ) 的果皮用作发酵的原材料。 通过切割将 500 g 芦柑 ( 又名 : 椪 柑 ) 的果皮破碎， 将破碎的果皮均匀散布于用高压釜灭菌的宽底容器 ( 具有底部的圆柱形 容器 ) 上， 以获得良好的空气流， 向其中加入少量水， 接着加热 30 分钟。
将泡盛曲霉 ( 由 Bioc 公司制造 ) 接种于如此获得的芦柑 ( 又名 ： 椪柑 ) 果皮的各 处。 然后， 在有氧条件下在暗处在 30℃培养箱中进行 10 天微生物发酵处理 ( 曲霉菌发酵 )， 由此获得曲霉菌发酵物。
然后， 对该发酵物进行 HPLC 分析。图 1 示出了结果。应当指出的是， 在图 1 中， 图 1A 表示发酵前芦柑 ( 又名 : 椪柑 ) 果皮的分析结果， 图 1B 表示曲霉菌发酵后所获得发酵 物的分析结果。
结果表明发酵前存在的川陈皮素和橘皮素完全消失， 且在发酵后转变为通过一些 类型的官能团消除而获得的多甲氧基黄酮转变化合物 ( 由图 1 中的各峰所表示的转变化合 物 1 和 2)。
亦即， 发现用作原材料的芦柑 ( 又名 : 椪柑 ) 果皮的曲霉菌发酵产生了含有图 1 中所示多甲氧基黄酮转变化合物的组合物。
< 实施例 2>
以高含量含有去甲基多甲氧基黄酮的组合物的制备 通过研磨将上述实施例 1 中获得的曲霉菌发酵物 (1 kg) 破碎， 加入 5 L 的乙醇， 接着 在室温下进行 3 天提取， 由此获得提取液。
随后， 用滤纸对所得提取液进行过滤， 用旋转蒸发器将滤液浓缩至 1 L。 然后， 加入 5 L 水， 由此获得水溶液。
将所得溶液加入预先用水平衡的 DIAION HP20( 多孔性合成吸附树脂柱 ) 中， 用3 L 的水除去未吸附的成分。然后， 用 2 L 的 40% 乙醇除去洗脱成分。随后， 得到用 2 L 的 45% 乙醇洗脱的成分。
然后， 利用蒸发器将所得的洗脱成分浓缩至干， 由此获得以高含量含有上述多甲 氧基黄酮转变化合物 1 和 2 的组合物。
< 实施例 3> 去甲基多甲氧基黄酮的分离及纯化 将上述实施例 2 中获得的组合物 (2 g) 溶解于 20% 甲醇， 进行 ODS 柱层析 ( 用 30 g Wakogel 50C18 填充内径为 20 mm 长度为 30 cm 的柱 )。用 40% 甲醇除去洗脱的成分， 获取 用 60% 甲醇洗脱的组合物。 随后， 在展开溶剂为己烷 / 乙醇 7 ∶ 3 的条件下， 对所得成分进行制备 TLC 层析 ( 硅胶 70PF254Plate Wako， 膜厚 0.75 毫米， 由 Wako Pure Chemical Industries 有限公司 制造 )， 一边用紫外灯确认一边收集含有各转变化合物的馏分。
然后， 将所得的馏分各自加入制备 HPLC 柱 (TSK GEL ODS， 由 TOSOH 公司制造， 4.6 毫米 ×25 厘米 ) 中， 利用 37%(v/v) 乙腈的流动相单独分离出纯的多甲氧基黄酮转变化合 物 1 和 2。
< 实施例 4> 转变化合物 1(4'- 去甲基川陈皮素 ) 的结构分析 对上述实施例 3 中获得的多甲氧基黄酮转变化合物 1 的分离产物进行 FAB 质谱分析 (pos)(JMS-600Y) 以测定分子量。
此外， 利用 1H-NMR 和 13C-NMR 进行结构分析。将 JNM-AL400(NMR)( 由 JEOL 有限公 司制造 ) 用作测定仪器， 通过检测 1H-NMR 的在 400 MHz 处的信号以及 13C-NMR 的在 100 MHz 处的信号来进行测定。分别目标物质的 1H 和 13C 的 δH(ppm) 和 δC(ppm)。
表 1 表示多甲氧基黄酮转变化合物 1 与橘皮素之间的 A 环碳信号 (ppm) 的比较结 果。
同时， 表 2 表示 1H 和 13C 的测定结果。此外， 表 2 集中地表示多甲氧基黄酮转变化 合物 1 的化学位移 (CDCl3) 的结果。应当指出的是， 在表 2 中在 δH(ppm) 的数值右侧的符 号表示信号分裂图形 :“s” 表示单峰 ； “d” 表示双峰 ； “dd” 表示双重双峰 ； “m” 表示多重峰。
[ 表 1]
[ 表 2]a、 b: 信号是可互换的。
质谱分析的结果显示测定分子量 [M-H]+ 为 m/z=389， 因此认为分子量为 388。 1
此外， 川陈皮素的 H-NMR( 氘代氯仿 - 氘代甲醇中 ) 与转变化合物 1 的 1H-NMR 之 间的比较显示 ： 在川陈皮素中观察到可归因于甲氧基的 6 个单峰信号， 而在去甲基川陈皮 素中观察到可归属于甲氧基的 5 个单峰信号。结果表明转变化合物 1 可能是通过川陈皮素 结构中一个部分的去甲基化而获得的 “去甲基川陈皮素” ， 并推测具有分子式 C20H20O8。 1 13
接着， 利用 H-NMR、 C-NMR、 HMQC 谱来进行特征性甲氧基质子的归属， 并且基于该 结果进行 HMBC 分析， 由此确定与甲氧基基体相对应的碳原子。
这些碳原子中， 如表 1 中所示， C-5、 C-6、 C-7 和 C-8 与构成橘皮素 A 环的碳原子的 信号高度地对应， 甲氧基的信号也与橘皮素相对应。
因此， 推测去甲基川陈皮素的 A 环具有与川陈皮素和橘皮素共同的结构。此外， 结 果提示去甲基川陈皮素在 B 环中被去甲基化。
此外， COSY 谱显示在 7.53 ppm 处的质子与在 7.04 ppm 处的相邻质子偶合 (J=8.29 Hz) 并且与在 7.40 ppm 处的质子远距离偶合 (J=2.20 Hz)。质子的 HMBC 谱分析显示 7.40 ppm 和 7.53 ppm 处的质子在 C-2(161.2 ppm) 处具 有信号， 因此确定质子的位置分别为 2' 位和 6' 位。
此外， 相对于构成 B 环的 147.0 ppm 和 149.0 ppm 处的各碳原子， 观察到 2'-H 和 5'-H 对这两者的 HMBC， 但仅在 149.0 ppm 处观察到 6'-H 的 HMBC。
根据上述结果， 在 147.0 ppm 和 149.0 ppm 处的各碳原子分别归属于 C-3' 和 C-4'。 这里， C-3'(147.0 ppm) 是由甲氧基质子 (3.99 s) 观察到 HMBC 的碳原子， 因此确定剩余的 4' 位是去甲基部位。
上述结果显示， 实施例 3 中分离的经转变化合物 1 是 “4'- 去甲基川陈皮素” 。此 1 13 外， 将 H 和 C 的结果集中示于表 2。此外， 将由上述分析的总的结果所确定的分子结构式、 1 1 H- HCOSY 和 HMBC 信号集中示于图 2。
< 实施例 5> 转变化合物 2(4'- 去甲基橘皮素 ) 的结构分析 对上述实施例 3 中获得的多甲氧基黄酮转变化合物 2 的分离产物进行 FAB 质谱分析 (pos)(JMS-600Y)， 从而测定分子量。
此外， 利用 1H-NMR 和 13C-NMR 进行结构分析。将 JNM-AL400(NMR)( 由 JEOL 有限公 司制造 ) 用作测定装置， 通过检测在 1H-NMR 的 400 MHz 处的和在 13C-NMR 的 100 MHz 处的 信号而进行测定。分别对目标物质的 1H 和 13C 的 δH(ppm) 和 δC(ppm) 进行测定。
表 3 表示多甲氧基黄酮转变化合物 2 和橘皮素之间的 A 环碳信号 (ppm) 的比较结 果。
同时， 表 4 表示 1H 和 13C 的测定结果。此外， 表 4 集中地表示多甲氧基黄酮转变化 合物 2 的化学位移 (CDCl3) 的结果。应当指出的是， 在表 4 中 δH(ppm) 的数值右侧的符号 表示信号分裂图形 “ ；s” 表示单峰 ； “d” 表示双峰 ； “dd” 表示双重双峰 ； “m” 表示多重峰。
[ 表 3][ 表 4]a、 b: 信号是可互换的。
质谱分析的结果显示测定分子量 [M-H]+ 为 m/z=359， 因此认为分子量为 358。 1
此外， 橘皮素的 H-NMR( 氘代 DMSO 中 ) 与转变化合物 2 的 1H-NMR 之间的比较显示 ： 在橘皮素中观察到了可归属于甲氧基的 5 个单峰信号， 而在去甲基橘皮素中观察到了可归 属于甲氧基的 4 个单峰信号。结果表明转变化合物 2 可能是通过橘皮素结构中一个部分的 去甲基化而获得的 “去甲基橘皮素” ， 并推测具有分子式 C19H18O7。 1 13
接着， 利用 H-NMR、 C-NMR 和 HMQC 谱来确定去甲基橘皮素中的特征性甲氧基质子 的归属， 并基于该结果进行 HMBC 分析， 由此确定与甲氧基的基体相对应的碳原子。
这些碳原子中， 如表 3 中所示， C-5、 C-6、 C-7 和 C-8 与构成橘皮素 A 环的碳原子的 信号高度对应， 甲氧基的信号也与橘皮素相对应。
结果， 推测去甲基橘皮素的 A 环具有与川陈皮素和橘皮素共同的结构。此外， 该结 果提示去甲基橘皮素在 B 环中被去甲基化。
此 外， 在 6.60 ppm 处 的 质 子 (3-H) 的 HMBC 分 析 中， 除 了 构 成 C 环 的 162.1 ppm(C-2)、 178.1 ppm(C-4)、 和 114.6 ppm(C-10) 以外， 还在 123.0 ppm 处观察到了 HMBC。 结果表明 123.0 ppm 处的碳原子是 B 环中 1' 位的碳。 13
而且， C-NMR 显示 116.4 ppm 和 128.1 ppm 处的碳原子分别具有相当于两个碳原 子的信号强度， 提示有酚基的存在。根据 HMQC 谱， 与 116.4 ppm 和 128.1 ppm 处的碳原子 键合的氢原子的信号分别归属于 7.04 ppm 和 7.80 ppm， 在所述氢信号之间确认了相互偶合 (J=8.78 Hz)。 这里， 在对 7.80 ppm 处质子的 HMBC 谱分析中， 确认了与 C-2(161.1 ppm) 相对应 的信号， 该位置归属于 2'-H， 而相邻的 7.80 ppm 处的质子则归属于 3'-H。因此， 根据 2'-H 和 3'-H 两者可知观察到 HMBC 的 160.1 ppm 处的碳原子归属于 4' 位， 并确定该部位是去甲 基部位。
上述结果表明， 实施例 3 中所分离的转变化合物 2 是 “4'- 去甲基橘皮素” 。此外， 1 13 1 1 将 H 和 C 的结果集中地示于表 4。此外， 将分子结构式和 H- HCOSY 以及由上述分析的总 的结果所确定的 HMBC 信号集中地示于图 3。
< 实施例 6> 对神经突起伸长活性的研究 将上述实施例 3 中获得的转变化合物 1( 即 4'- 去甲基川陈皮素的分离产物 ) 和转变 化合物 2( 即 4'- 去甲基橘皮素的分离产物 ) 用于研究神经突起伸长活性。将 Neuro2a 用 作神经细胞。
首先， 在具有 5% CO2 的 37℃培养箱中， 将 Neuro2a 细胞在含 10% 胎牛血清 (FBS) 的 DMEM 培养基中进行培养。每 3 天对这些细胞进行传代培养。
然后， 使用含 5%FBS 的 DMEM 培养基， 以 2×104/ 孔的量将所述细胞接种于 24 孔细 胞培养板中。在传代培养 3 小时后， 以 20 μM 的浓度分别加入各种试样。将溶解于乙醇中 的 4'- 去甲基川陈皮素 ( 实施例 3 中的产物 )、 4'- 去甲基橘皮素 ( 实施例 3 中的产物 )、 川 陈皮素 ( 比较性对照 )、 和橘皮素 ( 比较性对照 ) 用作试样。作为对照， 仅使用乙醇。
然后， 在加入各种试样 2 天之后， 在显微镜下观察神经突起伸长活性。图 4 表示对 培养物中各试样所发挥的神经突起伸长活性进行比较的图像。
如图像中所示， 发现与比较性对照 ( 即川陈皮素和橘皮素 ) 相比， 一去甲基化产物 ( 即 4'- 去甲基川陈皮素和 4'- 去甲基橘皮素 ) 具有更显著的神经突起伸长活性。
此外， Gu H. 等人 (Neurosci Lett.2009,453,204) 揭示了用具有神经突起伸长活 性的神经营养因子进行给药的痴呆症模型具有记忆改善活性和抗阿尔茨海默氏症活性。 因 此， 本实施例的结果提示 4'- 去甲基川陈皮素和 4'- 去甲基橘皮素具有记忆改善活性和抗 阿尔茨海默氏症活性。
< 实施例 7> 芦柑 ( 又名 : 椪柑 ) 果皮的曲霉菌 ( 白曲霉 ) 发酵 除了使用白曲霉 ( 由 Bioc 公司制造 ) 作为曲霉菌进行发酵 ( 应当指出的是， 发酵期为 4 天 ) 外， 其余以与实施例 1 同样的方式获得曲霉菌发酵物。
然后， 对所得的发酵物进行 HPLC 分析， 结果显示发酵前存在的川陈皮素和橘皮素 完全消失， 且发酵后显示出被改变成 4'- 去甲基川陈皮素和 4'- 去甲基橘皮素的化合物的 峰。
< 实施例 8> 芦柑 ( 又名 : 椪柑 ) 果皮的曲霉菌 ( 米曲霉 ) 发酵 除了将米曲霉 ( 由 Bioc 公司制造 ) 用作曲霉菌进行发酵 ( 发酵期 ： 10 天 ) 外， 其余以 与实施例 1 相同的方式获得曲霉菌发酵物。
然后， 对所得的发酵物进行 HPLC 分析， 结果显示发酵前存在的川陈皮素和橘皮素 完全消失， 且发酵后显示出被改变成 4'- 去甲基川陈皮素和 4'- 去甲基橘皮素的化合物的 峰。
< 实施例 9> 对记忆改善活性的研究 (1) 试样的制备 首先， 以与实施例 2 同样的方式制备以高含量含有去甲基多甲氧基黄酮类的组合物。
将 2 g 该组合物溶解于 20% 甲醇， 进行 ODS 柱层析 ( 用 30 g 的 Wakogel 50C18a 填充内径为 20 mm 且长度为 30 cm 的柱 ) 处理， 除去用 40% 甲醇洗脱的成分， 接着用 60% 甲醇进行洗脱， 由此获得 250 mg 4'- 去甲基川陈皮素和 4'- 去甲基橘皮素的混合物。将该混 合物用于研究记忆改善效果。
(2) 动物试验 作为记忆改善的评价系统， 利用 Y 形迷宫装置进行东莨菪碱诱发空间记忆损害的空间 记忆试验。该试验是基于动物会避开上次进入的臂而进入另一个臂的行为特征 ( 变换行 为 ) 而被频繁用于研究空间工作记忆能力的试验。
在该试验中， 将丙烯酸酯制的黑色梯形的臂 ( 底部宽度 : 3 cm， 侧壁高度 ： 12 cm， 开放天井宽度 ： 10 cm， 长度 ： 40 cm) 用作小鼠 Y 形迷宫装置。将该装置中的 3 个臂命名为 A、 B 和 C， 首先将小鼠置于 A 的端部并让小鼠在 Y 形迷宫自由行动 8 分钟。按顺序记录小鼠 所进入的臂。对小鼠进入各臂的次数 (“总臂进入次数” ) 和小鼠连续地选择不同的 3 个臂 ( 变换行为的数量 ) 的事件数进行计数， 基于以下方程式计算出变换行为 (%) 的值 ： 变换行 为的数量 ÷( 总臂进入次数 -2)×100= 变换行为 (%)， 将该值用作自发变换行为的指标。
在该试验中， 使用 ddY 小鼠 ( 雄性， 体重 25 至 30 克， n=6)。首先， 在试验开始时进 行 Y 形迷宫试验， 将小鼠分成两组 ( 试样给药组和对照组 ) 使得这两组之间变换行为几乎 是均等的。 此外， 以 30 mg/kg 体重 / 日的比例， 将以上方式获得的 4'- 去甲基川陈皮素和 4'- 去甲基橘皮素 ( 悬浮于含 0.5%Tween 20 的生理盐水中 ) 重复地对试样给药组中的小鼠 口服给药。应当指出的是， 将含 0.5% Tween 20 的生理盐水重复地对对照组中的小鼠口服 给药。
然后， 在反复给药 1 周后， 以 0.6 mg/kg 的剂量 ( 溶解于生理盐水 ) 对各小鼠皮下 给药东莨菪碱， 给药 30 分钟后再次进行 Y 形迷宫试验。
图 5 表示试验结果。( 应当指出的是， 图 5 中由 “**” 所示的显著性差异表示显著 性水平为 1% 以下 )。
结果， 在对照组 ( 仅给予含 0.5% Tween 20 的生理盐水 ) 的情况下， 与试验开始前 相比， 变换行为由于东莨菪碱的给药而显著减小。
另一方面， 在试样给药组 ( 给予 4'- 去甲基川陈皮素和 4'- 去甲基橘皮素 ) 的情 形中， 与试验开始前相比， 变换行为显著增高。
结果强烈提示 4'- 去甲基川陈皮素和 4'- 去甲基橘皮素具有东莨菪碱诱发的空间 记忆损害的改善活性并且具有记忆改善活性和抗阿尔茨海默氏症活性。
产业实用性 本发明可利用高度安全的原材料、 通过高度安全方法而简单且大规模地生产作为极有 用的功能成分的 4'- 去甲基川陈皮素和 4'- 去甲基橘皮素。
因此， 本发明有望应用于食品或饮料及药物制剂领域。 此外， 在随着人口老龄化而 患痴呆症或记忆损害的人的比率不断增加、 且癌症所致死因占很大比例的现代社会中， 预 计受到大量的需求。