一种具有孔隙大小自适应调节能力的胶原海绵制备方法及胶原海绵.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710652011.1 (22)申请日 2017.08.02 (71)申请人 武汉轻工大学 地址 430023 湖北省武汉市汉口常青花园 学府南路68号 (72)发明人 汪海波 张军涛 南捷 (74)专利代理机构 北京思创大成知识产权代理 有限公司 11614 代理人 高爽 (51)Int.Cl. A61L 15/32(2006.01) A61L 15/42(2006.01) A61L 15/62(2006.01) A61L 27/24(2006.01) A61L 27/5。

2、0(2006.01) A61L 27/56(2006.01) A61L 27/58(2006.01) A61L 27/60(2006.01) (54)发明名称 一种具有孔隙大小自适应调节能力的胶原 海绵制备方法及胶原海绵 (57)摘要 本发明公开了一种具有孔隙大小自适应调 节能力的胶原海绵制备方法及胶原海绵， 包括在 冰浴条件下， 用第一醋酸水溶液溶解天然胶原蛋 白， 调节胶原溶液pH值至6-8， 得第一胶原溶液； 向第一胶原溶液中添戊二醛水溶液， 恒温培养， 静置得胶原胶； 将胶原胶转移至蒸馏水溶液中漂 洗， 去除戊二醛， 冷冻干燥得大孔胶原海绵框架； 用第二醋酸水溶液溶解天然胶原蛋白， 得。

3、第二胶 原溶液； 将大孔胶原海绵框架置第二胶原溶液 中， 抽真空下浸润， 随后沥干并冷冻干燥， 得初级 胶原海绵， 将初级胶原海绵再次置第二胶原溶液 中， 抽真空下浸润， 随后沥干并冷冻干燥， 得到胶 原海绵； 本发明胶原海绵能智能化适应不同应用 阶段对材料机械性能、 致密性和空隙大小的需 求。 权利要求书1页 说明书6页 附图3页 CN 107349456 A 2017.11.17 CN 107349456 A 1.一种具有孔隙大小自适应调节能力的胶原海绵制备方法， 其特征在于， 该制备方法 包括： (1)在冰浴条件下， 用第一醋酸水溶液溶解天然胶原蛋白， 并调节胶原溶液pH值至6-8， 得。

4、到第一胶原溶液； (2)向所述第一胶原溶液中添加戊二醛水溶液， 混合均匀后恒温培养， 静置得到纤维化 并化学交联的胶原胶； (3)将所述胶原胶转移至蒸馏水溶液中反复漂洗， 去除未参与反应的戊二醛， 随后冷冻 干燥后得到大孔胶原海绵框架； (4)用第二醋酸水溶液溶解天然胶原蛋白， 得到第二胶原溶液； (5)将所述大孔胶原海绵框架置入所述第二胶原溶液中， 在抽真空条件下浸润， 随后沥 干并冷冻干燥， 得到初级胶原海绵， 将所述初级胶原海绵再次置入所述第二胶原溶液中， 在 抽真空条件下浸润， 随后沥干并冷冻干燥， 得到胶原海绵。 2.根据权利要求1所述的具有孔隙大小自适应调节能力的胶原海绵制备方法，。

5、 其中， 所 述第一胶原溶液的浓度为1-5mg/mL。 3.根据权利要求1所述的具有孔隙大小自适应调节能力的胶原海绵制备方法， 其中， 调 节胶原溶液pH值的方法为用磷酸盐缓冲溶液进行透析。 4.根据权利要求1所述的具有孔隙大小自适应调节能力的胶原海绵制备方法， 其中， 步 骤(2)中， 添加戊二醛水溶液至所述第一胶原溶液中的戊二醛的浓度为0.05-0.20wt。 5.根据权利要求1所述的具有孔隙大小自适应调节能力的胶原海绵制备方法， 其中， 所 述恒温培养的温度为25-40， 静置的时间为12-48h。 6.根据权利要求1所述的具有孔隙大小自适应调节能力的胶原海绵制备方法， 其中， 所 述第。

6、二胶原溶液的浓度为8-15mg/mL。 7.根据权利要求1所述的具有孔隙大小自适应调节能力的胶原海绵制备方法， 其中， 所 述步骤(5)条件包括： 真空度为0.08-0.1MPa， 浸润时间为0.5-2h。 8.根据权利要求1所述的具有孔隙大小自适应调节能力的胶原海绵制备方法， 其中， 所 述天然胶原蛋白为 型胶原蛋白。 9.根据权利要求1所述的具有孔隙大小自适应调节能力的胶原海绵制备方法， 其中， 所 述第一醋酸水溶液的浓度为0.05-0.3mol/L， 所述第二醋酸水溶液的浓度为0.4-0.6mol/L。 10.采用权利要求1-9中任一项所述的具有孔隙大小自适应调节能力的胶原海绵制备 方法。

7、制备的胶原海绵。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 107349456 A 2 一种具有孔隙大小自适应调节能力的胶原海绵制备方法及胶 原海绵 技术领域 0001 本发明属于医学生物材料技术领域， 更具体地， 涉及一种具有孔隙大小自适应调 节能力的胶原海绵制备方法及胶原海绵。 背景技术 0002 胶原是哺乳动物中含量最高、 分布最广泛的结构性蛋白。 作为细胞外基质的主要 成分， 胶原与聚多糖等成分一起组成具有高度细胞亲和力和适度承力能力的细胞外微环境 (细胞外基质)， 为细胞的增殖、 迁移和代谢提供不可或缺的生物场所。 同时， 胶原还以纤维、 纤维束等形式参与皮肤、 跟腱、 角膜、 血管。

8、等器官的构建并发挥重要生物功能。 由于胶原具 有优异的生物相容性、 可降解性和良好的生物力学性能， 近年来在生物医学材料、 医学组织 工程和医学美容等领域得以广泛应用。 在这些领域中， 胶原通常作为生物支架材料、 空腔填 充材料、 药物载体材料或细胞外基质补充材料， 用于创面覆盖促愈合、 人造器官构建、 药物 缓释、 皮肤美容除皱等。 其中， 胶原海绵是应用最为广泛的胶原类医用产品， 主要用于创面 止血、 空腔填充、 促伤口愈合、 烧烫伤创面覆盖和促进缺失皮肤组织再生等临床领域。 通常， 胶原海绵的制造工艺包括胶原提取、 纯化、 浓缩、 交联和冻干成型、 灭菌和包装等步骤。 0003 胶原海绵。

9、的性能与制造工艺密切相关。 胶原溶液浓度越高， 则干燥后的胶原海绵 空隙越致密、 孔径越小， 海绵材料的形状稳定性和抗拉伸能力越强。 化学交联或纤维重组技 术经常用于提高胶原海绵的生物稳定性(热稳定性、 耐酶降解性能)， 以适应海绵产品应用 的需要。 其中， 化学交联方法可以在胶原分子内或分子间形成共价键交联， 从而大幅提高胶 原的生物稳定性； 而纤维重组技术是利用胶原特有的分子自组装性能， 通过在适宜条件下 促进胶原分子纤维化的方法提高胶原产品的生物稳定性能。 0004 在临床应用中， 对胶原海绵类产品的性能指标除了要求生物安全性、 功能有效性 外， 还要求产品具有良好的形状稳定性、 机械力。

10、学性和可降解性。 为保证产品功能的持续 性， 往往还要求胶原海绵具有适宜的耐降解性。 在促创面愈合和皮肤组织再生的应用中， 特 别强调胶原海绵应具有良好的促细胞增殖和组织再生能力。 大量研究证实， 组织创面的愈 合和再生与细胞增殖密切相关， 而细胞附着微环境的空隙构造与细胞增殖能力密切相关。 皮肤组织中最主要的成纤维细胞呈纺锤形， 长度约50-80 m， 直径5-15 m。 因此， 理想的促细 胞增殖生物敷料空隙物理尺寸应大于100 m方能为成纤维细胞提供适宜的增殖、 迁移和代 谢空间。 但是， 过大的空隙尺度往往导致材料比表面积变小， 细胞附着空间不足， 同时直接 导致材料机械强度大幅降低，。

11、 材料形状稳定性和易操作性变差。 目前， 胶原海绵制造往往采 用高浓度胶原溶液经化学交联和冻干致孔的方式制备。 这种制备工艺通过提高胶原浓度和 引入化学交联的方法能有效增强材料的机械力学性能、 形状稳定性能和耐降解性能。 但是， 由于过高的胶原浓度和化学交联导致的分子聚集和收缩效应， 使材料空隙致密， 且空隙尺 度过小(一般小于50 m)， 不能很好满足细胞增殖、 迁移所需的空隙尺度。 说 明 书 1/6 页 3 CN 107349456 A 3 发明内容 0005 本发明的目的是提供一种能兼顾材料机械力学性能、 适度耐降解性能和适宜空隙 构造的胶原海绵材料制备方法， 以满足医用敷料、 烧烫伤。

12、皮肤替代等医用材料对产品各项 性能的要求。 0006 为了实现上述目的， 本发明的一方面提供一种具有孔隙大小自适应调节能力的胶 原海绵制备方法， 其特征在于， 该制备方法包括： 0007 (1)在冰浴条件下， 用第一醋酸水溶液溶解天然胶原蛋白， 并调节胶原溶液pH值至 6-8， 得到第一胶原溶液； 0008 (2)向所述第一胶原溶液中添加戊二醛水溶液， 混合均匀后恒温培养， 静置得到纤 维化并化学交联的胶原胶； 0009 (3)将所述胶原胶转移至蒸馏水溶液中反复漂洗， 去除未参与反应的戊二醛， 随后 冷冻干燥后得到大孔胶原海绵框架； 0010 (4)用第二醋酸水溶液溶解天然胶原蛋白， 得到第二。

13、胶原溶液； 0011 (5)将所述大孔胶原海绵框架置入所述第二胶原溶液中， 在抽真空条件下浸润， 随 后沥干并冷冻干燥， 得到初级胶原海绵， 将所述初级胶原海绵再次置入所述第二胶原溶液 中， 在抽真空条件下浸润， 随后沥干并冷冻干燥， 得到胶原海绵。 0012 本发明的另一方面提供一种所述的具有孔隙大小自适应调节能力的胶原海绵制 备方法制备的胶原海绵。 0013 本发明的技术方案具有如下优点： 0014 (1)本发明通过两次向大孔胶原海绵框架中导入高浓度胶原， 增强了海绵材料密 实性， 提高了材料的机械强度、 形态稳定性和应用操作性， 有利于在使用初期为创面提供良 好的隔绝效果和较大的细胞附着。

14、面积； 另一方面， 在产品使用的中后期， 随着内源性酶的作 用， 导入的未经化学交联的胶原能快速降解， 而原始的交联的大孔胶原海绵框架依然留存， 形成的大孔隙构造能为后续细胞的增殖、 迁移继续提供适宜的生物空间； 0015 (2)通过成纤维细胞的体外增殖实验结果表明， 细胞培养7天时， 与普通胶原海绵 相比， 成纤维细胞在本发明的方法制备的胶原海绵材料中细胞增值率提高显著； 0016 (3)与普通胶原海绵相比， 本发明的胶原海绵可以智能化的适应不同应用阶段对 材料机械性能、 致密性和空隙大小的需求， 能较好的满足临床医学的产品技术要求， 具有良 好的应用前景。 0017 本发明的其它特征和优点。

15、将在随后具体实施方式部分予以详细说明。 附图说明 0018 通过结合附图对本发明示例性实施方式进行更详细的描述， 本发明的上述以及其 它目的、 特征和优势将变得更加明显。 0019 图1a示出了本发明的一个实施例的大孔胶原海绵框架的微观结构的扫描电镜观 察图。 0020 图1b示出了本发明的一个实施例的胶原海绵的微观结构的扫描电镜观察图。 0021 图1c示出了对比例1的海绵产品的微观结构的扫描电镜观察图。 说 明 书 2/6 页 4 CN 107349456 A 4 0022 图1d示出了对比例2的海绵产品的微观结构的扫描电镜观察图。 0023 图2示出了根据本发明的实施例和对比例的胶原海绵。

16、产品抗拉伸实验数据图。 0024 图3示出了根据本发明的实施例1和对比例的胶原海绵产品在胶原酶溶液中的体 外酶降解实验数据图。 0025 图4示出了根据本发明的实施例和对比例胶原海绵产品的MTT细胞增殖实验数据 图。 具体实施方式 0026 下面将更详细地描述本发明的优选实施方式。 虽然以下描述了本发明的优选实施 方式， 然而应该理解， 可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施方式所限制。 相 反， 提供这些实施方式是为了使本发明更加透彻和完整， 并且能够将本发明的范围完整地 传达给本领域的技术人员。 0027 本发明的一方面提供一种具有孔隙大小自适应调节能力的胶原海绵制备方法， 该 制。

17、备方法包括： 0028 (1)在冰浴条件下， 用第一醋酸水溶液溶解天然胶原蛋白， 并调节胶原溶液pH值至 6-8， 得到第一胶原溶液； 0029 (2)向所述第一胶原溶液中添加戊二醛水溶液， 混合均匀后恒温培养， 静置得到纤 维化并化学交联的胶原胶； 0030 (3)将所述胶原胶转移至蒸馏水溶液中反复漂洗， 去除未参与反应的戊二醛， 随后 冷冻干燥后得到大孔胶原海绵框架； 0031 (4)用第二醋酸水溶液溶解天然胶原蛋白， 得到第二胶原溶液； 0032 (5)将所述大孔胶原海绵框架置入所述第二胶原溶液中， 在抽真空条件下浸润， 随 后沥干并冷冻干燥， 得到初级胶原海绵， 将所述初级胶原海绵再次。

18、置入所述第二胶原溶液 中， 在抽真空条件下浸润， 随后沥干并冷冻干燥， 得到胶原海绵。 0033 区别于现有的胶原海绵制造工艺， 本发明采用两步法制备胶原海绵。 首先， 利用较 低浓度的胶原溶液为原料， 结合胶原纤维化和化学交联步骤， 得到具有较大空隙构造且具 有良好耐降解性能的大孔胶原海绵框架； 随后， 向该大孔胶原海绵框架中导入高浓度胶原， 填充原有大孔隙， 形成致密、 具有较大比表面积和良好机械强度的胶原海绵材料。 0034 作为优选方案， 本发明所述的大孔胶原海绵框架的孔径大于100 m。 0035 作为优选方案， 步骤(3)和步骤(5)中的冷冻干燥的工艺条件包括： 将胶原胶或浸 润后。

19、的大孔胶原海绵框架置于-60条件下预冻12-24小时， 随后抽真空至绝对压强2-20Pa 条件下干燥48-96小时， 完成水分子的升华。 0036 根据本发明， 优选地， 所述第一胶原溶液的浓度为1-5mg/mL。 0037 根据本发明， 优选地， 调节胶原溶液pH值的方法为用磷酸盐缓冲溶液进行透析。 调 节胶原溶液pH值时的温度为2-6。 0038 根据本发明， 优选地， 步骤(2)中， 添加戊二醛水溶液至所述第一胶原溶液中的戊 二醛的浓度为0.05-0.20wt。 所述戊二醛水溶液的浓度优选为5wt。 0039 根据本发明， 优选地， 所述恒温培养的温度为25-40， 静置的时间为12-4。

20、8h。 0040 作为优选方案， 所述恒温培养在水浴或恒温培养箱中进行。 说 明 书 3/6 页 5 CN 107349456 A 5 0041 根据本发明， 优选地， 所述第二胶原溶液的浓度为8-15mg/mL。 0042 根据本发明， 优选地， 所述步骤(5)条件包括： 真空度为0.08-0.1MPa， 浸润时间为 0.5-2h。 0043 根据本发明， 优选地， 所述天然胶原蛋白为 型胶原蛋白。 0044 所述天然胶原蛋白包括从哺乳动物、 鱼类、 两栖动物、 家禽中提取、 分离纯化的胶 原蛋白。 所述天然胶原蛋白优选为草鱼鱼皮的 型胶原蛋白、 牛跟腱的 型胶原蛋白、 猪皮 型胶原蛋白、 。

21、牛蛙 型胶原蛋白等。 0045 根据本发明， 优选地， 所述第一醋酸水溶液的浓度为0.05-0.3mol/L， 所述第二醋 酸水溶液的浓度为0.4-0.6mol/L。 0046 本发明的另一方面提供一种所述的具有孔隙大小自适应调节能力的胶原海绵制 备方法制备的胶原海绵。 0047 与普通胶原海绵相比， 本发明的胶原海绵可以智能化的适应不同应用阶段对材料 机械性能、 致密性和空隙大小的需求， 能较好的满足临床医学的产品技术要求， 具有良好的 应用前景。 0048 以下通过实施例进一步说明本发明： 0049 实施例1 0050 在冰浴条件下， 用0.1mol/L的醋酸水溶液溶解提取自草鱼鱼皮的 型。

22、胶原蛋白， 在 4条件下对磷酸盐缓冲溶液透析使胶原溶液的pH调整为7.0， 得到浓度为2mg/mL的第一胶 原溶液； 向第一胶原溶液中添加浓度5wt的戊二醛水溶液至所述第一胶原溶液中的戊二 醛的浓度为0.1， 混合均匀后置于25恒温培养箱中， 静置12小时得到纤维化并化学交联 的胶原胶； 将上述胶原胶转移至蒸馏水溶液中反复漂洗， 去除未参与反应的戊二醛， 随后冷 冻干燥后得到大孔胶原海绵框架， 备用(如图1a所示)， 所述大孔胶原海绵框架的孔径大于 100 m； 用0.5mol/L醋酸水溶液溶解草鱼胶原蛋白， 得到浓度为8mg/mL的第二胶原溶液； 在 真空干燥器中， 将大孔胶原海绵框架浸入8。

23、mg/mL的第二胶原溶液中浸润1小时， 同时抽真 空， 真空度为0.09MPa， 脱出大孔胶原海绵框架空隙中的空气并促进胶原溶液导入， 沥干并 冷冻干燥， 得到初级胶原海绵； 将所述初级胶原海绵再次浸入8mg/mL的第二胶原溶液中浸 润1小时， 同时抽真空， 真空度为0.09MPa， 沥干并冷冻干燥， 得到胶原海绵(如图1b所示)； 其 中， 所述冷冻干燥为将胶原胶或浸润后的大孔胶原海绵框架置于-60条件下预冻18小时， 随后抽真空至绝对压强10Pa条件下干燥72小时， 完成水分子的升华。 0051 实施例2 0052 在冰浴条件下， 用0.1mol/L的醋酸水溶液溶解提取自牛跟腱的 型胶原蛋。

24、白， 在4 条件下对磷酸盐缓冲溶液透析使胶原溶液的pH调整为7.0， 得到浓度为5mg/mL的第一胶 原溶液； 向第一胶原溶液中添加浓度5wt的戊二醛水溶液至所述第一胶原溶液中的戊二 醛的浓度为0.1wt， 混合均匀后置于35水浴中， 静置48小时得到纤维化并化学交联的胶 原胶； 将上述胶原胶转移至蒸馏水溶液中反复漂洗， 去除未参与反应的戊二醛， 随后冷冻干 燥后得到大孔胶原海绵框架， 备用， 所述大孔胶原海绵框架的孔径大于100 m； 用0.5mol/L 醋酸水溶液溶解牛跟腱胶原蛋白， 得到浓度为13mg/mL的第二胶原溶液； 在真空干燥器中， 将大孔胶原海绵框架浸入13mg/mL的第二胶原。

25、溶液中， 浸润1小时， 同时抽真空， 真空度为 0.09MPa， 脱出大孔胶原海绵框架空隙中的空气并促进胶原溶液导入， 沥干并冷冻干燥， 得 说 明 书 4/6 页 6 CN 107349456 A 6 到初级胶原海绵； 所述初级胶原海绵再次浸入13mg/mL的第二胶原溶液中， 浸润1小时， 同时 抽真空， 真空度为0.09MPa， 沥干并冷冻干燥， 得到胶原海绵； 其中， 所述冷冻干燥为将胶原 胶或浸润后的大孔胶原海绵框架置于-60条件下预冻18小时， 随后抽真空至绝对压强 10Pa条件下干燥72小时， 完成水分子的升华。 0053 对比例1 0054 用0.5mol/L的醋酸水溶液溶解提取。

26、自牛跟腱的 型胶原蛋白， 得到胶原浓度为 13mg/mL的胶原溶液， 冷冻干燥后得到未经化学交联处理胶原海绵(如图1c所示)。 0055 对比例2 0056 用0.5mol/L的醋酸水溶液溶解提取自牛跟腱的 型胶原蛋白， 得到胶原浓度为 13mg/mL的胶原溶液， 向胶原溶液中添加浓度为5wt的戊二醛水溶液至所述胶原溶液中的 戊二醛的浓度为0.1， 混合均匀后将胶原溶液静置交联12小时。 得到的交联胶原胶用蒸馏 水反复漂洗去除残留的戊二醛后冷冻干燥得到化学交联处理的胶原海绵(如图1d所示)。 0057 测试例1 0058 对实施例1、 对比例1、 对比例2的胶原海绵产品和实施例1的大孔胶原海绵。

27、框架， 进 行电镜扫描， 获得各胶原海绵产品的微观结构的扫描电镜观察图。 0059 如图1a-图1d所示， 实施例1中采用低浓度制备得到的胶原海绵框架具有大且宽松 的空隙结构， 经过导入高浓度胶原溶液后， 制得的胶原海绵产品的空隙明显变小、 致密且分 布均匀， 其孔隙构造与对比例1和对比例2比较接近。 0060 测试例2 0061 图2示出了根据本发明的实施例和对比例的胶原海绵产品抗拉伸实验数据图， 其 中， 每组测定材料样品数n3。 0062 对实施例和对比例的胶原海绵产品进行拉伸实验。 0063 如图2所示， 未经化学交联处理的对比例1样品抗拉伸强度最低， 而戊二醛交联处 理后的对比例2胶。

28、原样品抗拉伸强度明显提高。 采用本发明方法制备得到的实施例1和实施 例2胶原海绵抗拉伸强度接近于对比例2。 0064 测试例3 0065 对实施例1、 对比例1和对比例2制得的胶原海绵产品进行体外酶降解测试实验。 0066 如图3所示， 由于未经过戊二醛交联处理， 对比例1在胶原酶溶液中水解速度快而 且呈现持续水解状态； 而对比例2由于经过戊二醛交联处理， 虽然水解仍然呈现持续状态， 但水解速率明显降低； 与对比例不同， 实施例1样品呈现明显的分步水解行为， 在初期， 水解 速率较快， 这是导入的、 未交联胶原的降解现象， 而在后期降解速率明显降低， 这是胶原海 绵框架中交联胶原的降解行为。 。

29、0067 测试例4 0068 对实施例和对比例进行成纤维细胞增殖实验， 其中， 成纤维细胞为鼠尾NIH3T3细 胞， 培养7天， 样品数n8。 0069 如图4所示， 与对比例相比， 实施例1和实施例2的促细胞增殖能力均明显增强(p 0.01)， 说明该制备方法具有明显的效果。 0070 以上已经描述了本发明的各实施例， 上述说明是示例性的， 并非穷尽性的， 并且也 不限于所披露的各实施例。 在不偏离所说明的各实施例的范围和精神的情况下， 对于本技 说 明 书 5/6 页 7 CN 107349456 A 7 术领域的普通技术人员来说许多修改和变更都是显而易见的。 说 明 书 6/6 页 8 CN 107349456 A 8 图1a 图1b 图1c 说 明 书 附 图 1/3 页 9 CN 107349456 A 9 图1d 图2 说 明 书 附 图 2/3 页 10 CN 107349456 A 10 图3 图4 说 明 书 附 图 3/3 页 11 CN 107349456 A 11 。