技术领域
本发明涉及的是一种用于生物医药技术领域的蛋白基质及其制备方法，特别 是一种用于预防形成由内置血管引起的急性血栓的具有药物缓释作用的植物源性 醇溶蛋白基质及其制备方法。
背景技术
血管内支架置入技术与放疗和化疗已成为心血管疾病治疗的主要手段。随着 血管内支架置入技术的日益成熟，人们开发了多种支架材料。但生物相容性始终 是其难以克服的首要问题。在应用时，往往会引起急性血管阻塞，导致血管再狭 窄和血栓形成，临床显示这一几率为20％-40％。所以，需要持续数天给病人注射 抗凝血剂，来预防急性血栓的形成；甚至需要再次进行内置血管手术治疗再狭窄 血管。这无论在身体还是心理上都给病人带来了很大痛苦。目前针对支架材料引 发的心血管继发性病变主要有四种解决方法。一是给病人连续服用(或注射)抗 凝血药。虽然它可以实现抑制血栓形成的目的，但引起大出血的几率增高，而且 通过口服给药时，如果没有合适的药物载体或药物剂型，则很难达到预期的血药 浓度；第二种方法是对支架材料表面进行化学修饰，使其具有良好的生物相容性， 尤其是血液相容性。虽然这种方法减少了手术后血管再狭窄的几率，但是这一数 值仍然高达40％。第三种方法是在支架材料表面涂一层抗凝血药物[2Jeffrey F. W.Keuren，Simone J.H.Wielders，George M.Willems，Marco Morra，Linda Cahalan，Patrick Cahalan，Theo Lindhout.Thrombogenicity of polysaccharide-coated surfaces.Biomaterials 2003；24：1917-1924.多糖涂 层表面的血栓形成性。Biomaterials 2003；24：1917-1924。]。这种方法已经取得 了一定的进展，但由于抗凝血药物与材料表面键合弱，涂层很容易被血流剥离， 难以达到预期目的；第四种方法是在材料表面种植由病人自身分离的内皮细胞， 形成单细胞层后可阻止血液与材料接触，抑制凝血因子的活化[3van der Giessen WJ，Serruys PW，Visser WJ：Endothelialization of intravascular stents. J Interv Cardiol 1988；1：109-120。血管内支架的内皮化。J Interv Cardiol 1988； 1：109-120]。这种方法是最理想选择，但是由于内皮细胞来源和数量的限制至今 仍没有得到推广使用。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的不足和缺陷，提供一种植物源性醇溶蛋 白基质及其制备方法。使其由包含有肝素的醇溶蛋白微球通过常规的溶剂挥发的 方法制备而成，该法简便易行，药物仍保持较高生物活性；利用具有肝素缓释效 果，作为涂层材料用于预防由内置血管引起的急性血栓的形成。
本发明是通过以下技术方案实现的：
本发明的植物源性醇溶蛋白基质由醇溶蛋白微球或者是包含有肝素的醇溶 蛋白微球制备而成的。
所述的植物源性醇溶蛋白是小麦、大麦、裸麦、燕麦或玉米的醇溶性蛋白。
所述的醇是C1-4的脂肪醇；所述的脂肪醇进一步限定为：乙醇。
本发明的植物源性醇溶蛋白基质的制备方法是通过相分离技术和溶剂挥发 技术来完成的，具体如下：
①由植物源性醇溶蛋白用含50％-90％醇的水溶液溶解，和肝素共溶后，调节 醇浓度为10％-40％。
首先制备成包含有肝素的，直径为40nm-20000nm粒径的微球。由该步骤得 到的药物蛋白微球的药物包封率为5-40％，操作流程简单，材料来源广泛。
②将药物蛋白微球溶液涂在玻璃、金属或者塑料等介质上，再经常温溶剂挥 发形成厚度在0.5μm-2000μm的薄膜。
该步骤得到的缓释药物蛋白基质中药物仍然保持较高的生物活性。
在进行步骤①时，植物源性醇溶蛋白和肝素分别溶解在50％-90％醇的水溶 液，二者混合后，超声波处理1-10分钟；在进行步骤②时，将制备的薄膜加在 玻璃、金属或者塑料上，自然干燥成膜。
本发明微球制备前期将上述的溶液用超声波处理，可以获得粒径均一的微 球。本发明所述的醇溶蛋白降解产物是经胃蛋白酶-柠檬酸缓冲液消化得到的。
本发明提供的醇溶蛋白及其降解产物的生物相容性经MTT(二甲基噻咪二苯 基四唑溴盐)法检测证明具有良好的生物相容性。天然可降解玉米醇溶蛋白及其 降解产物对人脐带静脉内皮细胞具有促增殖作用，有利于血管内支架置入手术后 新内皮的生成。同时，经过加工处理后，形成包含有肝素的蛋白基质，能够以一 定的速度释放肝素，药物释放时间维持20天以上，这可以有效的预防血管内支架 置入后引起的血栓形成，同时血管新内皮的形成将有助于防止血管再狭窄的发生。
附图说明
图1本发明的植物源性玉米醇溶蛋白原料及蛋白微球扫描电镜照片，a：原 料(标尺＝74μm)，b：蛋白微球(标尺＝170nm)。
图2玉米醇溶蛋白基质及其降解产物的生物相容性，细胞培养3天的MTT结 果图，a：对照，b：玉米醇溶蛋白基质，c：降解产物(1mg/ml，相当于蛋白基质的量)。 “*”代表与对照相比存在显著差异(n＝6，p＜0.05)。
图3包含肝素的玉米醇溶蛋白基质扫描电子显微镜照片，a：薄膜厚度(标 尺＝14μm)，b：薄膜微观形态(标尺＝5μm)。
图4包含肝素的玉米醇溶蛋白基质肝素缓释动力学曲线图(n＝3)。
具体实施方式
实施例1：
玉米醇溶蛋白微球及其制备方法
将玉米蛋白溶解在60％的乙醇水溶液中，配制成8mg/mL，室温超声波处理5 分钟，迅速调整乙醇浓度到40％，得到玉米醇溶蛋白微球混悬液，干冰/丙酮溶液 冷冻后，冷冻干燥得蛋白微球粗制粉末。
经喷金处理后，扫描电子显微镜观察微球形态，结果如图1所示，所制备的 蛋白微球直径控制在40nm-100nm之间。
实施例2
玉米醇溶蛋白基质及其制备方法
将所得玉米醇溶蛋白微球混悬液加入24孔培养板(300μl/孔)或相同表面 积的盖玻片，室温干燥，形成颗粒型醇溶蛋白基质。
实施例3
玉米醇溶蛋白基质及其降解产物的生物相容性
玉米醇溶蛋白基质紫外灭菌，降解产物溶于细胞培养液后0.22μm滤膜过滤 灭菌后备用。将人脐带静脉内皮细胞分离培养，进行传代后，种植在玉米醇溶蛋 白基质上；同时种植在细胞培养板上并以相同的培养液培养，作为对照；另外用 添加有降解产物的培养液培养的细胞作为第三组。在培养两天后，MTT检测细胞 生长活力。结果如图2所示，玉米醇溶蛋白基质及其降解产物显示出了对血管内 皮细胞的促增值作用，为作为涂层材料的应用提供了实验数据支持。
实施例4
包含肝素的玉米醇溶蛋白基质及其制备方法
将玉米蛋白和肝素分别溶解在60％的乙醇水溶液中，混合后，迅速调整乙醇 浓度到40％，加入24孔培养板(300μl/孔)或相同表面积的盖玻片，室温干燥， 形成颗粒型醇溶蛋白基质。
样品经过喷金处理后，扫描电子显微镜观察，薄膜形态结果如图3所示，薄 膜厚度控制在20μm-30μm之间，组成薄膜的含肝素蛋白微球直径控制在1000nm -3000nm之间。
实施例5
包含肝素的玉米醇溶蛋白基质中肝素的体外释放动力学
将制备的包含肝素的玉米醇溶蛋白基质浸泡在lmL磷酸缓冲液(PBS，pH7.2， 37℃)中，定期半量更换新鲜PBS溶液，并利用Smith法检测肝素含量，计算肝 素释放速率，结果如图4所示。肝素释放维持20天以上，故可以用于血管内支架 置入手术时急性血栓形成的预防。
实施例6
包含肝素的玉米醇溶蛋白基质的抗凝作用
家兔，清醒状态下心脏采血，用3.8％枸橼酸钠溶液(9∶1)抗凝。离心 (3000rpm)，取上清血浆待用。将含肝素的蛋白基质浸泡在血浆中，同时加入CaCl2(0.1mol/L)和37℃预温的凝血活酶(100units/ml)溶液，混匀后立即放入37 ℃水浴中温育，同时开始计时。每隔2-3秒倾斜液面1次，记录纤维蛋白凝固、 液面不动所需时间，求出每管平均值。结果显示：含肝素的蛋白基质显示了优良 的抗凝血性能，血浆始终保持不凝，基质中的肝素表现出了较高的生物活性。证 明了该用于药物缓释的醇溶蛋白基质制备方法的可行性；进一步肯定了包含肝素 的玉米醇溶蛋白基质在预防血管内支架置入手术时急性血栓形成中的作用。