技术领域
本发明涉及一种生物医用可降解表面改性镁合金及其方法，具体说是涉及一种先通过微弧氧化在材料表面构建微米级氧化镁结构，然后进一步利用水热处理在表面构建纳米级的Mg-Zn-Al层状双氢氧化物的改性方法，属于金属材料表面改性技术领域。
背景技术
目前，临床上使用的骨组织修复材料大部分为不可降解金属，例如钛合金、镍钛合金、不锈钢等。如果不可降解植入体一直留在体内，可能会对人体组织产生排异反应，且病变部位再次出现问题，会直接影响再次治疗。如果二次手术取出，又会给患者带来经济压力和精神负担。目前市场上的可降解的高分子材料的弹性模量过低，力学强度不够，很难完美地替代骨组织。镁合金具有良好的机械性能、弹性模量与骨组织非常接近，而且镁合金具有生物降解性，在体内能够完全降解，且降解产物可以随着人体的新陈代谢排出体内。因此，镁合金被视为下一代生物医用金属材料。综上，发展适合作为骨组织修复的医用镁合金材料具有很重要的前景与社会意义。
镁合金作为医用材料的缺点为电化学势太低，腐蚀速率过快。快速的腐蚀一方面会导致镁合金过早地失去机械性能，另外一方面也会引起植入体周围组织液pH值的剧烈变化以及炎症反应等。目前，常用的Ti合金骨植入体常面临的两大问题是：成骨诱导性差和易感染。被视为下一代生物医用金属材料的镁合金如果进入临床应用，同样也可能面对这两个问题。因此，设计具有良好抗腐蚀性，同时又兼具促成骨分化和抗菌性的镁合金表面具有重要的现实意义，而这也是医用镁合金表面改性研究的重点与难点。
发明内容
为了解决现有的医用可降解镁合金作为骨组织修复材料其降解速率过快，可能存在的成骨诱导性差和易感染等问题，本发明提供了一种兼具抗腐蚀性、促成骨分化和抗菌性的表面改性镁合金材料及其制备方法，以满足临床对镁合金降解速率、成骨分化和抗菌性的需求。
第一发明提供一种可用于骨组织修复的表面改性镁合金材料，所述表面改性镁合金材料的表面具有：原位生成的带有微米级孔洞的氧化镁层、以及原位生成于所述氧化镁层的孔洞内和表面的纳米级的Mg-Zn-Al层状双金属氢氧化物层。
根据第一发明，氧化镁层覆盖了镁合金表面，且与基体材料(镁合金)结合牢固，能够有效地提高镁合金的抗腐蚀性，Mg-Zn-Al层状双金属氢氧化物层能够对氧化镁层进行封孔，进一步提高镁合金的耐腐蚀，同时在材料的表面引入功能元素Zn，可以赋予材料表面促成骨分化和抗菌性等功能。由于Mg-Zn-Al层状双金属氢氧化物结构较于Mg-Al层状双金属氢氧化物更加稳定，且层间可储存的氯离子量更多，可以通过离子交换机制更好地降低涂层周围的氯离子浓度，从而进一步提高涂层的耐腐蚀性。
第一发明的具有微纳结构表面的镁合金表现出良好的抗腐蚀性，有利于小鼠骨髓间质干细胞在材料表面的粘附和增殖。此外，小鼠骨髓间质干细胞在改性后的材料表面的ALP活性明显升高，而且改性后的材料表面对金黄色葡萄球菌表现出抗菌性。本发明可被广泛应用于与骨组织修复有关的镁合金医疗器械。
较佳地，所述氧化镁层是通过微弧氧化技术将镁合金表面进行氧化而得到的。通过微弧氧化技术可以简单便捷的在镁合金表面构建微米级的氧化镁涂层。微弧氧化制备的氧化镁属于电化学原位制备，可以使得涂层更为坚硬，且与基体材料结合更为牢固，从而能够更有效地提高镁合金的抗腐蚀性。
较佳地，所述氧化镁层中含有氟元素。引入氟元素后，氧化镁层的整体抗腐蚀性和涂层稳定性更好。基于该微弧氧化涂层具有更好的稳定性，更有利于在微弧氧化的镁合金表面经过水热处理原位制备Mg-Zn-Al层状双金属氢氧化物层。
较佳地，所述Mg-Zn-Al层状双金属氢氧化物层是通过将原位生成有所述氧化镁层的镁合金在含有铝源和锌源的碱性溶液中进行水热处理而得到的。
第二发明提供一种表面改性镁合金材料的制备方法，其包括以下步骤：(1)采用微弧氧化技术在镁合金表面构建微米级的氧化镁层；以及(2)将步骤(1)得到的产物在含有铝源和锌源的碱性溶液中在进行水热处理，从而在微米级的氧化镁层表面构建纳米级的Mg-Zn-Al层状双金属氢氧化物层。
根据第二发明，通过微弧氧化技术可以简单便捷的在镁合金表面构建微米级的氧化镁涂层。微弧氧化制备的氧化镁属于电化学原位制备，涂层较为坚硬，与基体材料结合牢固，能够有效的提高镁合金的抗腐蚀性。该氧化镁涂层由于弧光放电的原因，具有多孔的结构。为了进一步提高其抗腐蚀性并赋予其特殊的生物学性能，再利用水热法在氧化镁表面构建纳米级Mg-Zn-Al LDH对氧化镁层进行封孔，同时在材料的表面引入功能元素Zn。水热法制备的Mg-Zn-Al LDH属于化学原位制备，能够填充氧化镁的孔洞结构，进一步提高镁合金的耐腐蚀，同时，由于Mg-Zn-Al LDH能够释放Zn离子，因此可以进一步赋予材料表面促成骨分化和抗菌性等功能，并且进一步提高耐腐蚀性。
较佳地，所述微弧氧化的电解液为0.1～0.5M的氢氧化钠或氢氧化钾、0.02～0.08M的硅酸钠或甘油磷酸钠、以及0.1～0.2M的氟化钾或氟化铵。采用该电解液，能够在氧化镁层中引入氟元素。
较佳地，所述微弧氧化的电流为1～1.5A，正负频比为2～3，占空比为5～15％，频率为600～800，反应截止电压为330～400V。
较佳地，所述水热处理中，所述含有铝源和锌源的碱性溶液的pH值为10～13。
较佳地，所述铝源为可溶性铝盐，优选为硝酸铝、硫酸铝、醋酸铝中的至少一种。
较佳地，所述锌源为可溶性锌源，优选为硝酸锌、氯化锌、醋酸锌中的至少一种。
较佳地，所述含有铝源和锌源的碱性溶液中，铝离子浓度为0.02～0.06M，铝离子浓度与锌离子浓度比为1：(0.0025～0.025)。
较佳地，水热处理的处理温度为100～150℃，处理时间为10～24小时。
第三发明提供上述任一种表面改性镁合金材料在制备骨组织修复材料中的应用。
附图说明
图1中(a)、(b)、(c)分别是经实施例1、2、3处理后得到的样品扫描电镜形貌图。
图2是经实施例1、2、3处理后的样品的XRD图谱。
图3是镁合金及经实施例1、2、3处理后得到的样品在0.35wt％的NaCl溶液中的析氢量。
图4是小鼠骨髓间质干细胞在镁合金及经实施例1、2、3处理后的样品上的粘附。
图5是小鼠骨髓间质干细胞在经实施例1、2、3处理后的样品上增殖速率。
图6是小鼠骨髓间质干细胞在经实施例1、2、3处理后的样品表面培育7天后的碱性磷酸酶活性。
图7是金黄色葡萄球菌在样品表面培育1天后的涂板结果(a)以及由涂板经过计算而得的细菌抑制率(b)。
具体实施方式
以下结合附图和下述实施方式进一步说明本发明，应理解，附图和下述实施方式仅用于说明本发明，而非限制本发明。
针对医用可降解镁合金在骨组织修复材料领域应用的需求，在此公开了一种兼具抗腐蚀性、促成骨分化和抗菌性的表面改性镁合金及其制备方法。
本发明一实施方式的表面改性镁合金材料的表面具有微纳复合结构，包括：原位生成的带有微米级孔洞的氧化镁层、以及原位生成于所述氧化镁层的孔洞内和表面的纳米级的Mg-Zn-Al层状双金属氢氧化物层。
镁合金是指以镁为基体加入其他元素组成的合金。所述其他元素包括但不限于铝、锌、锆等。由于本发明主要针对临床上使用的镁合金抗腐蚀性较差的问题，因此本发明中镁合金优选为医用镁合金，包括但不限于型号为ZK60、JDBM、AZ31、AZ61、AZ91的镁合金中的任意一种。
氧化镁层可起到抗腐蚀作用。优选地，所述氧化镁层是通过微弧氧化技术将镁合金表面进行氧化而得到的。微弧氧化制备的氧化镁属于电化学原位制备，这样制得的氧化镁层较为坚硬，与基体材料结合牢固，能够有效地提高镁合金的抗腐蚀性。
氧化镁层的孔洞的孔径可为0.4～1.2μm。氧化镁层的厚度可为4～6μm。
Mg-Zn-Al层状双金属氢氧化物(简称Mg-Zn-Al LDH)是指由带正电的镁锌铝氢氧化层和带负电的阴离子层组成的类水滑石结构，其化学组成可表示为[M2+1-xM3+x(OH)2][An-]x/n·zH2O，其中，M2+为Mg2+和Zn2+，M3+为Al3+，An-可为CO32-、Cl-、SO42-等。x可为0.17～0.34。Mg2+和Zn2+的摩尔比可为1：(0.5～3)，优选为1：2.8。Zn在Mg-Zn-Al LDH中的原子比可为3.62～9.12％。Zn含量过低的话难以发挥其抗菌作用，而一旦过高，又容易引起细胞毒性。
Mg-Zn-Al层状双金属氢氧化物层可通过将原位生成有所述氧化镁层的镁合金在含有铝源和锌源的碱性溶液中进行水热处理而得到的。
Mg-Zn-Al层状双金属氢氧化物层可由多个纳米片构成。纳米片的径向尺寸可为800～1400nm，厚度可为100～150nm。Mg-Zn-Al层状双金属氢氧化物层可基本覆盖整个氧化镁层。整个Mg-Zn-Al层状双金属氢氧化物的厚度可为2～5μm。
以下，作为示例，说明本发明的表面改性镁合金材料的制备方法(镁合金表面改性方法)。
镁合金材料(例如镁合金片)在改性前可以先进行清洁预处理，例如用砂纸去掉表面氧化层，用无水乙醇超声干净并室温干燥。
采用微弧氧化技术在镁合金材料表面构建微米级的抗腐蚀氧化镁涂层。采用微弧氧化技术将镁合金表面进行氧化，得到均匀分布有微米级孔洞的氧化镁涂层。微弧氧化后，可再用大量去离子水将经过微弧氧化处理后的材料表面清洗干净。
微弧氧化的电解液可为0.1～0.5M的氢氧化钠或氢氧化钾、0.02～0.08M的硅酸钠或甘油磷酸钠、以及0.1～0.2M的氟化钾或氟化铵。微弧氧化的电流可为0.8～1.5A，正负频比可为2～3，占空比可为5～15％，频率可为600～800。反应截止电压可为330～400V。
然后，采用水热法在微米级的抗腐蚀涂层表面构建纳米级的Mg-Zn-Al LDH，进一步提高涂层的抗腐蚀性，同时赋予材料表面促成骨分化和抗菌性等功能。
水热处理中，水热液可为含有铝源和锌源的碱性溶液。水热液中的铝源可为可溶性铝盐，优选为硝酸铝、硫酸铝、醋酸铝等中的至少一种。水热液中的锌源可为可溶性锌源，优选为硝酸锌、氯化锌、醋酸锌中的至少一种。
水热液中，铝源的浓度可为0.02～0.06M。水热液中，铝离子摩尔浓度与锌离子摩尔浓度比可为1：(0.0025～0.025)。在该范围内，锌离子摩尔浓度越大，制得的涂层中Zn含量越高，对抗腐蚀性、促成骨分化和抗菌性越有利。当水热液中Zn浓度超过该范围(即Zn浓度再增加)时，也不能继续提高涂层中的锌含量。这是由于水热液是一个碱性环境，当锌离子浓度过高时，其会以氢氧化锌或者氧化锌的形式沉淀，因此，无法为碱热环境提供一个更高的锌离子浓度环境。一个示例中，将0.02～0.06M的铝源溶液(例如硝酸铝溶液)与0.5～5M的锌源溶液(例如硝酸锌溶液)混合并调至碱性，得到含有铝源和锌源的碱性溶液。其中铝源溶液与锌源溶液的体积比可为(30～70)：(0.01～1)，优选为(30～70)：(0.01～0.1)。
水热液的pH值可为10～13，可通过加入碱例如氢氧化钠和/或氢氧化钾等得到。
水热反应温度可为100～150℃。水热反应时间可为10～24小时。
采用水热技术在经过微弧氧化处理的镁合金表面构建纳米级的层状双氢氧化物后，可以用大量去离子水冲洗并干燥。
经上述方法得到的镁合金表面由带有孔洞结构的氧化镁和片状的Mg-Zn-Al LDH构成。孔洞形的氧化镁为微米级，片状的Mg-Zn-Al LDH为纳米级。微弧氧化制备的氧化镁属于电化学原位制备，涂层较为坚硬，与基体材料结合牢固，能够有效的提高镁合金的抗腐蚀性。水热法制备的Mg-Zn-Al LDH属于化学原位制备，能够填充氧化镁的孔洞结构，进一步提高镁合金的耐腐蚀。同时，由于Mg-Zn-Al LDH能够释放Zn离子，因此可以进一步赋予材料表面促成骨分化和抗菌性等功能。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果。
1)经本发明在镁合金表面改性之后，合金的抗腐蚀性有明显的提高；2)由于Mg-Zn-Al LDH的存在，使得小鼠骨髓干细胞更容易在材料表面粘附和增殖；3)小鼠骨髓干细胞在材料表面的碱性磷酸酶活性有所提高；4)掺Zn改性后的材料对金黄色葡萄球菌的抑制率达到了80％以上。
下面进一步例举实施例以详细说明本发明。同样应理解，以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。下述示例具体的工艺参数等也仅是合适范围中的一个示例，即本领域技术人员可以通过本文的说明做合适的范围内选择，而并非要限定于下文示例的具体数值。
实施例1
将厚度为2mm，直径为10mm的AZ31镁合金片，用1000目的SiC砂纸去掉表面氧化层，再用酒精超声干净。之后进行微弧氧化处理，电解液为0.1M氢氧化钾，0.04M的硅酸钠，0.2M的氟化钾，电流为0.8A，正负频比为2，占空比为10％，频率为800。反应截止电压为360V。之后进行水热处理，反应温度为120℃，水热液为50mL的0.02M的硝酸铝溶液，并使用氢氧化钠或氢氧化钾将其pH值调到12.8，反应时间为12h。所得样品标记为PEO/LDH。
图1中的(a)是经本实施例改性处理得到的镁合金表面形貌的扫描电镜图。从图中可以看出，处理后表面为一层致密的纳米片状的结构，而且微弧氧化过程中生成的孔洞基本被纳米片状的结构所填充。图2给出了经本实施例处理后样品表面的XRD图。从图中可以看出，经过处理后材料表面的结构为纯Mg-Al LDH，由于片状的镁铝层状双金属氢氧化层属于纳米级，被其覆盖的氧化镁也被检测到。
实施例2
将厚度为2mm，直径为10mm的AZ31镁合金片，用1000目的SiC砂纸去掉表面氧化层，再用酒精超声干净。之后进行微弧氧化处理，电解液为0.1M氢氧化钾，0.04M的硅酸钠，0.2M的氟化钾，电流为0.8A，正负频比为2，占空比为10％，频率为800。反应截止电压为360V。之后进行水热处理，反应温度为120℃，水热液为50mL的0.02M的硝酸铝溶液，并加入10μL硝酸锌(5M)，然后使用氢氧化钠或氢氧化钾将其pH值调到12.8，反应时间为12h。所得样品标记为Zn-1#。
图1中的(b)是经本实施例改性处理得到的镁合金表面形貌的扫描电镜图。从图中可以看出，处理后表面为一层致密的纳米片状的结构，而且微弧氧化过程中生成的孔洞基本被纳米片状的结构所填充。图2给出了经本实施例处理后样品表面的XRD图。从图中可以看出，经过处理后材料表面的结构为纯Mg-Zn-Al LDH，且经X-射线光电子能谱测试(XPS,PHI-5000C ESCA system PerkinElmer,USA)测得Zn的原子比为3.62％。由于片状的镁锌铝层状双金属氢氧化层比较薄，被其覆盖的氧化镁也被检测到。
实施例3
将厚度为2mm，直径为10mm的AZ31镁合金片，用1000目的SiC砂纸去掉表面氧化层，再用酒精超声干净。之后进行微弧氧化处理，电解液为0.1M氢氧化钾，0.04M的硅酸钠，0.2M的氟化钾，电流为0.8A，正负频比为2，占空比为10％，频率为800。反应截止电压为360V。之后进行水热处理，反应温度为120℃，水热液为50mL的0.02M的硝酸铝溶液，并加入100μL硝酸锌(5M)，然后使用氢氧化钠或氢氧化钾将其pH值调到12.8，反应时间为12h。所得样品标记为Zn-2#。
图1中的(c)是经本实施例改性处理得到的镁合金表面形貌的扫描电镜图。从图中可以看出，处理后表面为一层致密的纳米片状的结构，而且微弧氧化过程中生成的孔洞基本被纳米片状的结构所填充。图2给出了经本实施例处理后样品表面的XRD图。从图中可以看出，经过处理后材料表面的结构为纯Mg-Zn-Al LDH，且Zn的原子比为9.12％。由于片状的镁锌铝层状双金属氢氧化层比较薄，被其覆盖的氧化镁也被检测到。
实施例4析氢
对未改性样品及上述实施例1、2、3得到的样品进行析氢实验测试。将样品浸泡在0.35wt％NaCl溶液(400mL)中，每组4个样品，利用倒置漏斗收集样品降解过程中的氢气释放量。整个测试过程在37℃恒温下进行。
图3是上述实施例改性处理得到的析氢结果图。从图中可以看出经过实施1、2、3处理后得到的样品较AZ31镁合金而言，析氢量都降低很多。与实施例1样品相比，经实施例2和3处理后得到的样品析氢量进一步降低了。上述结果说明Mg-Zn-Al LDH的耐腐蚀性要好于Mg-Al LDH。
实施例5粘附
采用小鼠骨髓间质干细胞体外培养和荧光染色实验评估上述实施例1、2和3改性处理所得镁合金材料对小鼠骨髓干细胞粘附铺展的影响。具体方法如下。
1)将经过12h紫外灭菌的样品放入24孔培养板中，每孔滴加1mL密度为5×104cell/mL细胞悬液。
2)将细胞培养板放入5％CO2饱和湿度的细胞培养箱中36.5℃孵化。
3)培养1、4和24小时后，用罗丹明和DAPI对细胞进行染色，并用激光共聚焦显微镜(CLSM)观察。
图4是经上述改性实施例1、2、3改性的镁合金和未改性的镁合金对小鼠骨髓干细胞的粘附测试结果。从图中可以看到24小时培养后，细胞在AZ31上面都没有任何铺展。经过4小时培养后，细胞在Zn-1#和Zn-2#样品表面已经开始出现多边形的伪足(图中箭头所指细胞))，而在PEO/LDH样品表面依然呈圆形。经过24小时的培养后，细胞在PEO/LDH样品表面主要为长条形，而在Zn-1#和Zn-2#样品表面则铺展的更宽，且铺展面积更大。上述结果说明掺锌后的LDH涂层，更有利于小鼠骨髓干细胞的早期粘附和铺展。
实施例6增殖
采用小鼠骨髓干细胞体外培养实验评估经上述实施例1、2和3处理后得到的样品对干细胞活性的影响。利用阿尔玛蓝(AlamarBlueTM，AbD serotec Ltd，UK)试剂盒检测细胞在材料表面的增殖情况。方法如下。
1)将经过12小时紫外灭菌的样品放入24孔培养板中，每孔滴加1mL密度为5×104cell/mL细胞悬液。
2)将细胞培养板放入36.5℃、5％CO2、饱和湿度的细胞培养箱中孵化。
3)细胞分别培养1、3及5天后，吸去原培养液，换新的培养板，并加入含有10％阿尔玛蓝(AlamarBlueTM)染液的新培养液，将培养板置于培养箱中培养2h后，从每孔取出100μL培养液放入96孔板中。
5)利用酶标仪(BIO-TEK，ELX800)测量各孔在波长为560nm的激发光下，590nm处的发射光强度。其光强与细胞数量呈正相关。
图5为本实施例实验结果。如图所示，在1和3天时，干细胞在三组样品表面的增殖速率没有显著性差异。而培养5天后，干细胞在Zn-2#样品表面的增殖速率明显高于其他两组。上述结果说明锌离子的释放并不会影响干细胞活性，而到第五天时，由于Zn-2#样品的抗腐蚀性最好，因而材料表面更有利于干细胞的增殖。
实施例7
采用小鼠骨髓干细胞体外培养实验评估经上述实施例1、2和3处理后得到的样品对干细胞的碱性磷酸酶活性的影响。方法如下。
1)将经过12小时紫外灭菌的样品放入24孔培养板中，每孔滴加1mL密度为5×104cell/mL细胞悬液。
2)将细胞培养板放入36.5℃、5％CO2、饱和湿度的细胞培养箱中孵化。
3)培育7天后，用碱性磷酸酶试剂盒检测干细胞的碱性磷酸酶活性。
本实施例的实验结果如图6所示，由于Zn离子的释放，在Zn-1#、Zn-2#样品表面的干细胞的碱性磷酸酶活性高于在PEO/LDH样品表面。
实施例8
采用革兰氏阳性的金黄色葡萄球菌评价经上述实施例1、2和3处理后得到的样品的抗菌性。方法如下。
1)将经过12小时紫外灭菌的样品放入24孔培养板中，每孔滴加0.8mL密度为107cfu/mL菌液，置于37℃培养24小时。
2)将样品转移至5mL离心管，并加入4mL生理盐水，在振荡器上剧烈震荡60s将样品表面的细胞震落。
3)用生理盐水将菌液稀释10倍，取100μL稀释后的菌液均匀涂于标准琼脂板上继续培养18小时。
4)利用凝胶成像系统对琼脂板进行拍照，并通过对琼脂板上的菌落进行计数，计算样品的抗菌率。
本实施例的实验结果如图7所示。从图7中的(a)可以看出掺锌后的样品对金黄色葡萄球菌表现出明显的抑制作用。由图7中的(b)可知，相比不掺锌的样品，掺锌后的样品对金黄色葡萄球菌的抑制率达到了80％以上。
综合上述实施例4-8的结果可以看出，Mg-Zn-Al LDH复合涂层的抗腐蚀性明显提升，而且材料表面更有利于干细胞的早期粘附和后期增殖。此外，Mg-Zn-Al LDH复合涂层更有利于干细胞的成骨分化，以及赋予材料良好的抗菌性。