技术领域
本发明涉及一种支架的制备方法及其复合体系，属于再生医学领域，特别涉及一种多孔微支架的制备方法及其复合体系。
背景技术
生物支架通过模拟人体天然微环境的理化特性，能有效促进干细胞的自我更新、增殖以及定向分化等，近年来被广泛应用于再生医学领域。一般地，以干细胞为基础的生物支架按其状态主要分为多孔支架和水凝胶支架。其中，多孔支架具有大量相互连通的三维多孔结构，相比于水凝胶等，更利于细胞在支架内的迁移和营养物质的供给。一般认为，100-300μm的三维多孔结构比较适宜细胞和组织的长入，因此多孔支架被大量应用在组织再生和肿瘤免疫治疗研究领域。
然而，目前传统的多孔支架具有较大的物理尺寸，阻碍了营养物质和细胞进入支架内部，严重影响了支架上细胞的存活和扩增。
针对这一问题，国内外有研究团队制备出了具有更小物理尺寸的“微支架”。由于微支架的物理尺寸很小(约800-2,000μm)，营养物质和细胞能够顺利进入支架内部，从而促进细胞在支架上存活、增殖和后期的定向分化等。例如，Y.N.Du等曾报道，他们利用明胶和聚乙二醇分别制备出微支架以增强肝细胞的存活和扩增。
但是目前几乎所有的传统多孔支架都不能以简单注射的方式进行体内移植，仍然需要通过创伤性较大的传统外科手术方式进行植入。
可注射生物支架使用简便且能有效充分填充组织缺损，具有较大的临床应用前景，近年来成为了生物材料的前沿研究方向。目前的可注射支架大都为凝胶状，这类支架结构致密，阻碍了营养物质/代谢产物的交换，同时也不利于细胞的迁移。而常见的多孔支架由于其结构特点，难于通过注射的方式植入体内。因此，近年来有许多研究人员致力于开发可注射的多孔支架。D.J.Mooney等人制备出一种可注射的复合海藻酸钠水凝胶支架，该支架能够在体内原位形成多孔结构，从而有效促进包被在凝胶中的干细胞迁移至缺损部位。MilicaRadisic等人通过结构单元设计，制备出可注射的血管可降解生物芯片(单层网状结构)。
然而，目前仍未开发出能有效促进干细胞存活、扩增、定向分化的可注射三维多孔微支架。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明目的是提供一种多孔微支架的制备方法，该方法操作简便，所得海藻酸钠三维多孔微支架能够促进组织再生，能够高效促干细胞扩增和定向分化，可注射，临床实用性强。
本发明的另一目的是提供一种多孔微支架复合体系，该复合体系含有海藻酸钠三维多孔微支架，可应用于组织再生。
为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种多孔微支架的制备方法，所述多孔微支架为海藻酸钠三维多孔微支架；所述制备方法包括以下步骤：
(1)海藻酸钠三维多孔支架的制备：
将改性海藻酸钠溶解于去离子水中，置于4℃后置于-20℃，冷冻干燥；加入氯化钙溶液，PBS浸洗后再次冷冻干燥，密封干燥低温保存；
(2)海藻酸钠三维多孔微支架的制备：
将海藻酸钠三维多孔支架置于离心管中，加入液氮，快速用均质仪将支架破碎；待液氮挥发完全后，加入氯化钙溶液，反应后进行过滤，将所得颗粒进行冷冻干燥，即得海藻酸钠三维多孔微支架。
进一步地，所述海藻酸钠三维多孔微支架具有三维多孔结构，支架为球状，最小能做成直径为1mm的微球，孔径可根据具体组织特性需求调整，孔径范围为50～300μm。
进一步地，步骤(1)中，所述改性海藻酸钠为RGD多肽共价接枝修饰海藻酸钠，其改性方法包括如下步骤：
将EDC/NHS加入海藻酸钠溶液，于室温搅拌4h后，加入RGD多肽搅匀后于4℃静止过夜；接着将该溶液转入透析袋(3.5kDa)透析3d后冷冻干燥24h；密封，-20℃储藏。
进一步地，步骤(1)的具体操作为：将改性海藻酸钠充分溶解于去离子水中，使其终浓度为1.5％(w/v)，转移至模具(如试剂板、玻璃皿等)，置于4℃放置1～4h，后置于-20℃放置8～20h，冷冻干燥24～48h；加入终浓度为2％(w/v)的氯化钙溶液，交联15min，PBS浸洗3次后再次冷冻干燥12h，密封干燥4℃保存。
进一步地，步骤(2)中，液氮加入量为离心管容积(15mL或50mL)的10％～45％；氯化钙溶液的终浓度为2％(w/v)，交联反应2～15min。
进一步地，步骤(2)中，采用均质仪高速破碎支架所用转速为20,000～40,000rpm，高速破碎30s～2min。
进一步地，步骤(2)中，所述过滤采用孔径1.2～1.5mm的标准筛。
一种如上所述的多孔微支架的制备方法制得的多孔微支架。
一种多孔微支架复合体系，含有如上所述的多孔微支架。
进一步地，转移至注射器前还包括在微支架中滴加少许低浓度海藻酸钠溶液充分混匀的步骤；所述复合体系的制备方法包括以下步骤：将制备好的海藻酸钠三维多孔微支架浸泡于PBS中，4℃，48h；然后过滤掉PBS，将海藻酸钠三维多孔微支架复合体系转移至1mL注射器中，塞上注射活塞，冷冻干燥后4℃密封保存。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明所制备得到的海藻酸钠三维多孔微支架，具有高连通率的三维多孔结构，具有更小的物理尺寸，利于营养物质的进入，有利于细胞及组织的长入，促进了细胞的贴壁、存活和增殖；
(2)本发明所制备得到的海藻酸钠三维多孔微支架及其复合体系，一，可以不包埋任何组织细胞直接注射，注射到某种组织后，微支架内会生长相应的组织细胞；二，微支架中包埋某一组织的组织细胞，然后注射到相应的部位，加快相应的组织细胞生长；三，微支架中包埋具有治疗作用的蛋白、多肽或小分子，直接注射到相应的组织，可以缓慢释放在病患处，减少用药量；四，以上三种可以混合使用；
(3)本发明所制备得到的海藻酸钠三维多孔微支架及其复合体系，利用液氮速冻高速破碎法，开发出一种可注射生物支架及复合体系，改变了通过创伤性较大的传统外科手术方式进行植入的方式，使用简便且能有效充分填充组织缺损，具有巨大的临床应用前景。
附图说明
图1A为实施例2中可注射AMS的实物图和SEM图；
图1B为实施例2中AMS支架的物理尺寸；
图1C为实施例2中AMS支架的孔径表征结果；
图2为实施例2中AMS支架的弹性模量测试结果；
图3为实施例2中可注射AMS在致密软组织中可注射性验证结果；
图4A为实施例4中hMSCs增殖速率测定结果(CCK-8)；
图4B为实施例4中hMSCs在AMS支架上的生长形貌SEM图(3天)；
图4C为实施例4中hMSCs在AMS支架上生长的分布和数量定性测定；
图4D为实施例4中hMSCs在AMS支架上生长的整合素-β1表达情况(7天)；
图4E为实施例4中hMSCs在AMS支架上生长的明场照片(7天)；
图5A为实施例4中体外ALP活性检测结果；
图5B为实施例4中成骨相关基因检测结果；
图5C为实施例4中相关蛋白表达Western blot检测结果。
具体实施方式
现结合附图与具体实施例对本发明作进一步说明。
本发明旨在开发出一种海藻酸钠复合微支架体系，以高效促干细胞扩增和定向分化效率，快速实现组织再生修复。我们利用液氮速冻破碎法，开发出三维多孔微支架体系。为了验证该复合体系的生物学效果，我们以骨再生修复为范例，促进hMSCs成骨分化和成熟。研究结果表明，我们开发的可注射AMS制备方法简单，使用操作简便，具有极大的临床实用价值，该体系还具有应用于肝组织再生和心肌修复等领域的潜力。
本发明利用海藻酸钠多孔支架，通过液氮速冻破碎法，开发出一种海藻酸钠复合微支架体系，该体系具有能高效促干细胞扩增和定向分化，操作简便，临床实用性强等特点。
本发明具体内容如下：
一、可注射海藻酸钠三维多孔微支架(AMS)的制备及表征：
将液氮加入离心管，浸没未交联的海藻酸钠三维多孔支架(AS)，韧性较大的支架将变得十分的脆性，均质仪高速旋转将产生较大的剪切力，最终将尺寸较大的支架破碎成尺寸非常小的多孔颗粒，再经过氯化钙交联和冻干后这些颗粒就是制得的三维多孔微支架(AMS)。
相比制备该微支架的其他方式(比如用剪子、刀片剪切)，本方法中液氮瞬时超低温能快速将AS的多孔结构固定，以致不会被后续剪切力破坏。
为了使微支架具可注射性，我们将冻干的微支架浸泡在PBS中，目的是去除微支架表面残留的多余Ca2+，待其充分吸水溶胀后，滤掉PBS后在微支架中滴加少许低浓度海藻酸钠溶液充分混匀，再转移至注射器(1mL规格)中冷冻干燥。体内实验时，只需将细胞悬液加至微支架中充分混匀即可进行注射。滴加的海藻酸钠溶液起一定的“润滑”作用，能使微支架颗粒顺利通过注射针。由于海藻酸钠溶液的浓度较低，注射进动物体内后将很快被进一步稀释掉，不会影响支架内接种的细胞活性。
本发明所得纳米载体-海藻酸钠三维多孔微支架具有三维多孔结构，支架为球状，最小能做成直径为1mm的微球，孔径可根据具体组织特性需求调整，具体孔径大小根据某组织生长所需最适孔径进行调整，可调控范围为50～300μm。
本发明所制备得到的海藻酸钠三维多孔微支架及其复合体系，一，可以不包埋任何组织细胞直接注射，注射到某种组织后，微支架内会生长相应的组织细胞；二，微支架中包埋某一组织的组织细胞，然后注射到相应的部位，加快相应的组织细胞生长；三，微支架中包埋具有治疗作用的蛋白、多肽或小分子，直接注射到相应的组织，可以缓慢释放在病患处，减少用药量；四，以上三种可以混合使用。
所述具有治疗作用的蛋白、多肽或小分子括但不限于骨形成蛋白家族系列、血管内皮生长因子、载氧蛋白、阿司匹林、不同类型细胞因子、促胰岛细胞生长因子、促肝脏细胞生长因子以及促心肌细胞生长因子
二、可注射海藻酸钠三维多孔微支架(AMS)骨组织工程的应用：
作为验证和示范，我们将AMS体系应用于骨组织工程。
研究结果表明，以AMS为支架，能够促进骨细胞增殖和成骨分化。AMS能明显促进hMSCs的ALP活性。进一步地，成骨相关基因和蛋白表达测试结果显示，AMS能有效上调hMSCs各成骨相关基因(包括Runx2、OCN、Col1a1、OPN和ALP)的表达；Western blotting结果显示OCN、Col1a1蛋白的表达水平同样支持了基因和ALP活性检测的结论。
本发明验证了AMS对hMSCs存活和增殖的影响。促进干细胞增殖是AMS设计的重要功能之一，我们旨在通过制备比传统普通多孔支架尺寸更小的微支架，让营养物质和细胞能更充分地进入支架内部，并以此促进干细胞在多孔支架内的存活和增殖率。
以下通过具体较佳实施例结合附图进一步说明本发明，但本发明并不仅限于以下的实施例。
实施例1海藻酸钠三维多孔微支架的制备
1.1.海藻酸钠多孔支架(AS)的制备
本研究所使用的海藻酸钠(alginate)为RGD多肽(GGGGRGDASSP，购自上海强耀)。
RGD-alginate(RA)的改性方法：
将EDC/NHS加入海藻酸钠溶液，于室温搅拌4h后，加入RGD多肽搅匀后于4℃静止过夜；接着将该溶液转入透析袋(3.5kDa)透析3d后冷冻干燥24h；密封，-20℃储藏。
将2.0g RA溶于100mL去离子水中，待其充分溶解后转移至24孔板中，0.5mL/孔，然后依次将孔板放置于4℃冰箱2h，-20℃冰箱8h后，冷冻干燥24h。冷冻干燥完成后，将氯化钙(2％，w/v)溶液加入孔板中，1mL/孔，交联15min。然后用PBS浸洗3遍，再次冷冻干燥12h，密封干燥置于4℃保存。
1.2.海藻酸钠三维多孔微支架(AMS)的制备
利用液氮速冻多孔支架并用均质仪高速破碎的方法制备AMS：
在50mL离心管中放1片AS，然后加入10mL液氮，快速用均质仪将支架破碎(35,000rpm，1min)。待液氮挥发完全后，向离心管内加入10mL氯化钙溶液(2％，w/v)，交联5min，然后用孔径1.2～1.5mm的标准筛进行过滤，截留直径在1.0mm左右的颗粒。然后将所得颗粒置于-20℃冷冻4～8h后再冷冻干燥8～24h，即制得AMS。
实施例2海藻酸钠三维多孔微支架的表征
扫描电子显微镜(SEM；S-4800；Hitachi，Japan)用于表征AS、AMS的微观结构(孔径、多孔形态等)以及微支架尺寸；压缩弹性模量测试仪(ElectroForce 3100；Bose，USA)用于测定各支架的弹性模量。
将冻干的微支架浸泡在PBS中，待其充分吸水溶胀后，滤掉PBS后在微支架中滴加少许低浓度海藻酸钠溶液充分混匀，再转移至注射器(1mL规格)中冷冻干燥。体内实验时，只需将细胞悬液加至微支架中充分混匀即可进行注射。以致密的组织验证其可注射性。
实验结果：
如图1A所示，SEM结果显示AMS具有高连通率的三维多孔结构，其孔结构也未受损坏；如图1B-C所示，其支架尺寸约为1mm的微球，孔径约为110μm，该孔径有利于细胞及组织的长入。
如图2所示，AMS的降解速率在第三周后明显高于AS，Ca2+交联支架降解的原因是因为Ca2+与溶液中的单价阳离子交换所致。AMS的比表面积要远大于AS，因此AMS中的Ca2+交换速率要快于AS，而这差异在第三周后被明显地表现出来了。
如图3所示，该可注射支架能被轻松地注射进致密的组织内，如牛肉。
实施例3可注射AMS制备
将制备好的AMS浸泡于PBS中，4℃，48h；然后过滤掉PBS，将AMS转移至1ml注射器中，塞上注射活塞，冷冻干燥后4℃密封保存。
实施例4人骨髓间充质干细胞(hMSCs)在支架上的增殖
4.1.细胞培养和接种
人骨髓间充质干细胞(hMSCs；ScienCell，CA，USA)在高糖DMEM(Hyclone，USA)培养基(添加10％体积胎牛血清，1％体积双抗)中扩增，并将该培养基称为增殖培养基。
当hMSCs传代至第4代(P4)后，用胰酶(0.05％trypsin/EDTA，Gibco)消化、离心、重悬后接种至AS、AMS支架，接种数量为1x105cells/孔。
当于培养箱孵育2h后，补加增殖培养基至每孔1.5mL。
接种后第二天，换加成骨诱导培养基，其组成为低糖DMEM，并添加胎牛血清(10％体积)、双抗(1％体积)、β-甘油磷酸(10mM)、抗坏血酸(50ug/mL)、地塞米松(0.1uM)。所有细胞每两天换一次液。
4.2.hMSCs的增殖
使用细胞计数试剂盒(CCK-8；Dojindo，Japan)分别于细胞接种后的第1、3、7和14天测定各支架上细胞的增殖速率。
4.3.hMSCs的形貌分析
使用SEM观察各支架上细胞的形貌；用鬼笔环肽标记细胞骨架并用共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)观察。
4.4.体外成骨相关标志物检测
使用碱性磷酸酶(ALP)活性检测试剂盒(南京建成)测定各组细胞内的ALP活性；通过real-time PCR仪测定各组细胞内的成骨相关基因表达水平，包括一型胶原(Col1a1)、骨钙素(OCN)、骨桥素(OPN)、ALP、Runx2，内参为β-actin；进一步结合Western Blotting分析方法对成骨相关蛋白表达水平进行检测，包括Col1a1、OCN和Runx2。
实验结果：
如图4A所示，CCK-8测试结果表明在AMS中的hMSCs具有较高的增殖速率，且在培养3天后，其增殖速率要远高于AS支架中的hMSCs。原因是，相较于AS，AMS具有更小的物理尺寸，正如前面所述，小物理尺寸的多孔支架更利于营养物质的进入，促进了hMSCs的快速增殖；而AS中的细胞由于得不到足够的营养供给，在细胞接种后的第三天即表现出了较低的增殖速率。
另外，我们还对细胞贴壁形态、分布和数量等进行了分析。如图4B所示，AMS中的hMSCs表现出较宽平的铺展形态，而AS中的hMSCs则显得更瘦小。而这样的结果这主要是由细胞贴壁性的高低所决定的，贴壁效果越好，细胞将铺展得越宽平。
为了进一步验证该结论，我们对各支架中与hMSCs贴壁性能相关的整合素β1(integrinβ1)表达情况进行了分析。
图4C为整合素β1表达量的免疫荧光分析结果，从图中可以看到接种在AMS中的hMSCs比在AS中有更多的整合素β1表达。从细胞分布和数量分析结果(图4C-E)可以看出，AMS中的hMSCs分布均匀，然而AS中的hMSCs仅在边缘分布较多，中心部位几乎无细胞存活(我们称之为“边缘效应”)。
以上结果证实了我们制备的微支架能够有效促进hMSCs的贴壁、存活和增殖。
ALP是干细胞成骨分化前期非常重要的标志物，其活性越高表明成骨分化程度越高。图5A显示，AMS能明显促进hMSCs的ALP活性。
为了进一步探究和验证各组中hMSCs成骨分化程度，我们进一步对成骨相关基因和蛋白进行了检测(图5B-C)，结果显示AMS能有效上调hMSCs各成骨相关基因(包括Runx2、OCN、Col1a1、OPN和ALP)的表达；Western blotting结果显示OCN、Col1a1蛋白的表达水平同样支持了基因和ALP活性检测的结论。
本发明并不局限于上述实施方式，如果对本发明的各种改动或变型不脱离本发明的精神和范围，倘若这些改动和变型属于本发明的权利要求和等同技术范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变动。