骨替代物及其制备方法.pdf

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1、(10)授权公告号 CN 102105179 B (45)授权公告日 2014.10.15 CN 102105179 B (21)申请号 200980125269.X (22)申请日 2009.06.26 0803663 2008.06.30 FR A61L 27/12(2006.01) (73)专利权人 皮埃尔-玛丽-居里大学(巴黎第 六大学 ) 地址 法国巴黎 专利权人 高等研究实践学院 国立科学研究中心 (72)发明人 N纳西夫 F戈博 MM吉罗吉耶 G莫瑟 (74)专利代理机构 永新专利商标代理有限公司 72002 代理人 过晓东 Anna Tampirei et alDesign o。

2、f graded biomimetic osteochondral composite scaffolds.Biomaterials .2008, 第 29 卷 3539-3546. (54) 发明名称 骨替代物及其制备方法 (57) 摘要 本发明涉及可以用作骨替代物的材料及其 制备方法。所述材料包含有机相 (I)， 其包含由 胶原 I 三螺旋构成的条纹胶原原纤维， 以及它们 未有序化的各向同性结构域， 所述原纤维是根据 联合了排列成行的结构域和胆甾型结构域的 3D 几何形状在一大段距离上有序化的 ； 以及矿物相 (II)， 其包含具有六方晶体结构的磷灰石晶体， 空 间群 6/m， 所述晶体包。

3、含至少钙离子和磷酸根离 子 ； 所述矿物相的磷灰石晶体的 c 轴与所述有机 相的条纹胶原原纤维的纵轴共排列 ； 并且所述材 料的胶原含量为至少 75mg/cm3。制备所述材料的 方法包括制备所述有机相 (I) 的前体的胶原的初 始酸性水溶液， 以及至少一种所述矿物相 (II) 的 前体的水溶液 ； 并且通过将 pH 升高到至少 7 来沉 淀所述胶原。根据该方法 ： 胶原在所述酸性水溶 液中的浓度为至少 75mg/ml， 并且在所述 pH 升高 时保持恒定 ； 所述矿物相前体包含至少一种钙盐 和至少一种磷酸盐 ； 所述矿物相 (II) 的沉淀通过 使所述矿物相前体溶液与所述有机相 (I) 接触来。

4、 进行 ； 所述接触在所述有机相 (I) 沉淀之前或之 后进行。 (30)优先权数据 (85)PCT国际申请进入国家阶段日 2010.12.30 (86)PCT国际申请的申请数据 PCT/FR2009/051233 2009.06.26 (87)PCT国际申请的公布数据 WO2010/004182 FR 2010.01.14 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 夏瑞临 权利要求书 2 页 说明书 7 页 附图 4 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书2页 说明书7页 附图4页 (10)授权公告号 CN 102105179 B CN 1021051。

5、79 B 1/2 页 2 1. 一种包含有机相 (I) 和矿物相 (II) 的合成材料， 其特征在于 ： - 所述有机相 (I) 包含由胶原 I 三螺旋构成的条纹胶原原纤维， 其中所述条纹的周期 为 67nm， 所述原纤维是根据联合了排列成行的结构域和胆甾型结构域以及它们未有序化的 各向同性结构域的 3D 几何形状在一大段距离上有序化的 ； -所述矿物相(II)包含具有六方晶体结构的磷灰石晶体， 空间群6/m， 所述晶体包含至 少钙离子和至少磷酸根离子 ； - 所述矿物相的磷灰石晶体的 c 轴与所述有机相的条纹胶原原纤维的纵轴共排列 ； - 所述材料的胶原含量为至少 75mg/cm3。 2. 。

6、如权利要求 1 所述的材料， 其特征在于所述矿物相由纯羟基磷灰石晶体组成。 3. 如权利要求 1 或 2 所述的材料， 其特征在于所述矿物相由化学计量的下式 (I) 的羟 基磷灰石晶体组成 ： Ca10(PO4)6(OH)2 (I)。 4. 如权利要求 1 所述的材料， 其特征在于所述矿物相包含磷灰石晶体， 所述晶体还包 含至少氢氧根离子， 其中磷酸根离子和 / 或氢氧根离子部分地由碳酸根离子代替。 5. 如权利要求 1 所述的材料， 其特征在于所述矿物相包含磷灰石晶体， 所述晶体包含 Ca2+离子、 PO43-离子和 OH- 离子， 其中 Ca2+、 PO43-或 OH-离子的至少一种部分地。

7、由其他离子 代替， 其条件是 ： 能够部分地代替 Ca2+离子的离子选自 Mg2+、 Cu2+、 Sr2+、 Ba2+、 Zn2+、 Cd2+、 Pb2+、 Na+、 K+和 Eu3+ 离子 ； 能够部分地代替 PO43-离子的离子选自 CO32-、 SiO42-、 AsO43-、 MnO43-、 VO43-、 CrO43-和 HPO42-离子 ； 以及 能够部分地代替 OH- 离子的离子选自 CO32-、 F-、 Cl-、 Br-、 I-、 S2-和 O2-离子。 6. 如权利要求 1 或 2 所述的材料， 其特征在于其还含有少于 2的量的蛋白聚糖、 糖胺 聚糖和 / 或促进矿化的有机分子。。

8、 7. 一种制备如权利要求 1 所述的材料的方法， 所述方法在于制备作为所述有机相 (I) 的前体的胶原的初始酸性水溶液， 以及至少一种所述矿物相 (II) 的前体的水溶液 ； 并且通 过将 pH 升高到至少 7 来沉淀所述胶原， 其特征在于 ： - 胶原在所述酸性水溶液中的浓度为至少 75mg/ml， 并且在所述 pH 升高时保持恒定， - 所述矿物相前体包含至少一种钙盐和至少一种磷酸盐， - 所述矿物相 (II) 的沉淀通过使所述矿物相前体溶液与所述有机相 (I) 接触来进行， 所述接触在所述有机相 (I) 沉淀之前或之后进行。 8. 如权利要求 7 所述的方法， 其特征在于将所述有机相 。

9、(I) 的胶原在使其与所述矿物 相 (II) 的前体的中性溶液接触前沉淀， 所述中性溶液含有至少所述钙盐和至少所述磷酸 盐。 9. 如权利要求 7 所述的方法， 其特征在于使所述有机相 (I) 的前体的酸性溶液与所述 矿物相 (II) 的前体的酸性溶液接触， 并升高所得混合物的 pH， 这导致所述胶原与所述磷灰 石的共沉淀。 10. 如权利要求 9 所述的方法， 其特征在于在封入渗析膜中的模具中含有所述有机相 (I) 的前体的浓酸性溶液， 然后将整体浸入所述矿物相 (II) 的前体的溶液中。 权 利 要 求 书 CN 102105179 B 2 2/2 页 3 11. 如权利要求 9 所述的方。

10、法， 其特征在于将浓胶原溶液引入由渗析膜构成的柔性包 膜中， 然后将所述包膜浸入所述矿物相 (II) 的前体的溶液中。 12. 如权利要求 7 所述的方法， 其用于制备其中所述矿物相 (II) 由纯羟基磷灰石晶体 组成并且如权利要求 2 所定义的材料， 其特征在于所述方法在密闭室中进行， 所述密闭室 中放置了 ： - 至少一个第一容器， 其含有至少一种磷酸盐和至少一种钙盐的水溶液， 其是所述矿物 相 (II) 的前体， 将至少一个渗析袋浸入其中， 所述渗析袋含有作为所述有机相 (I) 的前体 的胶原的初始酸性水溶液， - 至少一个第二容器， 其含有氨水溶液或 (NH4)2CO3粉末 ； 其条件。

11、是 ： -( 矿物相 (II) 前体溶液的体积 )/( 密闭室内部体积 ) 比为 210-3， - 包含于所述第一容器中的矿物相 (II) 前体溶液的高度为 3cm 至 5cm， 所述容器的直 径为 2cm 至 5cm ； -(氨水溶液的体积)/(密闭室内部体积)比为810-3， 或者(NH4)2CO3粉末的体积)/ ( 密闭室内部体积 ) 比为 610-3。 13. 如权利要求 7 所述的方法， 其特征在于所述胶原的初始酸性水溶液具有下列特征 ： - 其胶原浓度为 75mg/mL 至 1000mg/mL ； - 在酸的存在下， 其 pH 小于 4。 14. 如权利要求 7 所述的方法， 其特。

12、征在于所述矿物相 (II) 的前体的溶液具有下列特 征 ： - 钙前体的浓度小于溶度极限 ； - 磷酸盐前体的浓度小于溶度极限 ； - 前体的量是这样的 ： Ca/P 摩尔比为 1.5 至 1.8。 15. 如权利要求 7 所述的方法， 其用于制备如权利要求 6 所述的材料， 其特征在于所述 矿物相的前体的溶液还含有一种或多种其阳离子用于至少部分地代替 Ca2+的盐 ； 和 / 或含 有一种或多种其阴离子用于至少部分地代替 PO43-和 / 或 OH- 的盐。 16. 如权利要求 7 所述的方法， 其用于制备如权利要求 7 所述的材料， 其特征在于所述 矿物相 (II) 的前体的溶液还含有蛋白。

13、聚糖、 糖胺聚糖和 / 或促进矿化的有机分子。 17. 如权利要求 7 所述的方法， 其特征在于 pH 的升高借助于碱性气氛进行。 权 利 要 求 书 CN 102105179 B 3 1/7 页 4 骨替代物及其制备方法 技术领域 0001 本发明涉及骨替代物及其制备方法。 背景技术 0002 骨是主要由细胞 ； 构成有机蛋白网络的 I 型胶原 ； 以及由纳米大小的羟基磷灰石 晶体所组成的矿物相构成的混杂材料。这种三维的大规模有机 / 矿物的结合赋予骨组织弹 性和硬度， 使得其经受住施加于其上的力。因此， 骨是坚硬的、 致密的和非常强壮的。 0003 Weiner & Wagner(Ann.。

14、Rev.Mater.Sci.28， 271-298， 1998)提供了各个尺度下分级 结构的描述， 其可以分成下文所述并由附图 1 示例的七个级别 ： 0004 -级别1(图1a) ： 骨的两个主要构成基本组分， 即羟基磷灰石小板和条纹胶原原纤 维构成结构的第一等级。在纳米尺度内， 这是结构的最低级别。特别地， 磷灰石相的特征在 于存在特征晶面 (plans inter rticulaires)， 如 (002) 和 (300)。在该结构级别上， 磷灰 石晶体不具有特定的取向。胶原原纤维的特征在于电子显微镜可见的周期性条纹， 其来自 胶原 I 分子组装， 从而诱导 67nm 的周期位移 ； 0。

15、005 -级别2(图1b) ： 羟基磷灰石小板根据它们的c轴， 沿条纹胶原原纤维主轴的共排 列 (coalignement) 构成第二级别， 即磷灰石的晶面 (002) 与原纤维的主轴垂直， 并因此根 据胶原原纤维 ( 条纹 67nm) 的轴向周期 ( 即根据条纹 ) 取向。使用了术语矿化的胶原原 纤维 ( 宽度 100 至 300 纳米 )。级别 2 也在纳米尺度内 ； 0006 -级别3(图1c) ： 一些矿化的胶原原纤维在平行束中并排组装， 从而形成矿化的胶 原纤维 ( 宽度 1 至 3 微米 )。结构级别 3 达到微米尺度 ； 0007 - 级别 4( 图 1d) ： 其是复杂的， 因。

16、为矿化的胶原原纤维或纤维可以在三维上有序 化。特别地， 在该级别中， 可以区分结构域的共存， 其中原纤维 / 纤维在优选方向上在一大 段距离上排列成行和 / 或根据 “胆甾型” 几何结构形成它们堆叠的拱形结构特征。也可以 区分原纤维 / 纤维未有序化的结构域 (“各向同性” 结构域 )。该尺度从微米到毫米变化 ； 0008 -级别5(图1e) ： 密质骨具有毫米大小的平行圆柱结构排列， 表示为 “骨单位” 。 在 截面中， 这些骨单位表现为由同心胶原薄片组成 ； 0009 -级别6(图1f) ： 长骨的富细胞中心部分称为 “松质骨” 。 在这种骨中， 骨片形成薄 且不规则行的大孔网络。密质骨 。

17、/ 松质骨组合构成结构级别 6。该尺度大于一毫米 ； 0010 - 级别 7( 图 1g) ： 最终级别很明显是全骨。 0011 现有技术提出了几类合成材料 ( 表示为 “植入材料” ) 或天然材料 ( 表示为 “移植 物” )。植入材料通常为生物惰性的， 即被有机体容易耐受 ； 或生物相容的， 即它们完美地整 合入宿主有机体。移植物为取自其用于本人的人 ( 同体移植 ) 或第三者 ( 异源移植 ) 的骨 组织， 并且其通常为骨传导的 (osto-conducteur)， 即其能够引导骨再生长。 0012 然而， 能够诱导骨重建的骨诱导性骨替代物构成了理想的替代物。这样的材料的 开发是复杂的。。

18、 使用这样的材料要求使用具有特殊晶相和化学性质的组分以优化其在人体 或动物体中的完美整合， 并且因而避免排斥。必须重建该材料的三维结构以提供适， 首先， 说 明 书 CN 102105179 B 4 2/7 页 5 机械性质 ； 以及其次， 适合于宿主组织对所述替代物定植 (colonisation) 的多孔性。使有 机骨网络 (20质量比 ) 有序化的方法及其与组织中矿物相 (70质量比 ) 的结合在体外 非常难再现。 0013 已经进行了许多研究以合成骨替代物， 特别是涉及胶原矿化的研究。W.Traub et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1989， 86， 9822。

19、-9826 研究了火鸡骨腱胶原的矿化， 但获 得的材料没有表现出类似于骨的结构。已经进行了使用体外纯化胶原的其他测试， 但在 进行测试的强稀释条件未能获得具有在活骨组织中发现的骨密度和三维胶原结构的材料 参见 D.Lickorish et al.(J.Biomed.Mat.Res.2004， 68A， 19-27) ； S.Yunoki et al.(Mat. Lett.， 2006， 60， 999-1002) ； D.A.Wahl et al.(Eur.Cell.Mat.2006， 11， 43-56)。 0014 L.Addadi et al.(Proc.Natl.Acad.Sci.US。

20、A 1987， 84， 2732-2736) 描述了来自在 由(NH4)CO3粉末于环境温度下热分解所产生的氨气氛下的CaCl2溶液的方解石CaCO3结晶。 0015 同样已知的是通过升高pH从酸溶液沉淀胶原。 R.L.Ehrman et al.(J.Nat.Cancer Inst.1956， 16， 1375-1403) 描述了使胶原在乙酸中的溶液与 NH3蒸气接触的方法。其转化 为含有细粒的凝胶。没有描述所得材料的结构。 0016 M.M.Giraud-Guille et al.(J.Mol.Biol.1995， 251， 197-202) 和 (J.Mol. Biol.1992， 224。

21、， 861-873) 描述了利用胶原的浓溶液而获得的 “液晶” 结构和通过从酸到碱 升高 pH 而获得的溶胶 - 凝胶转变。 0017 G.Mosser， M.M.Giraud-Guille et al.(Matrix Biol.2006， 25， 3-13) 描述了这样 的方法， 其中将胶原的酸性溶液 (5mg/mL) 在玻璃微室中逐渐浓缩以获得胶原分子的长久 螺旋结构以及浓度梯度。然后使溶液与氨蒸气接触， 以形成胶原原纤维并实现液相中的稳 定结构。 0018 B.A.Harley et al.(Biomaterials 2006， 27， 866-874) 描述了也含有糖胺聚糖的 胶原结构。

22、基质的生产。将胶原微原纤维与硫酸软骨素在 4下均匀混合。然后将溶液在模 具中离心分离， 超速冷冻， 冷冻干燥 ； 然后于105下， 在50mTorr的真空下交联24小时。 没 有描述胶原的纤维状性质。 0019 C.Guo et al.(Biomaterials 2007， 28， 1105-1114) 描述了磁性小珠在排列胶原原 纤维溶液中的用途。使维持于 4下、 在磷酸盐缓冲液中制备的浓度为 2.5mg/ml 的胶原溶 液与磁性小珠接触。还在细胞的存在下制备了最终胶原浓度为 1.2mg/ml 的相同样品。在 两种情况下， 在通过将温度升高至 37以诱导原纤维生成期间， 将样品置于小于 1G。

23、 的磁场 中。当将细胞整合入基质时还使用 CO2气氛。基质是非常松散的， 并且没有提及胶原的纤 维性质。 M.J.Olsza et al.(Calcif.Tissue Int.2003， 72， 583-591)描述了存在或不存在聚 ( 天冬氨酸 ) 型聚合物的条件下的胶原海绵的钙化作用。胶原海绵由获得自牛腱的 I 型胶 原构成。矿物为碳酸钙而不是磷酸钙， 因此没有获得磷灰石相。没有证明条纹纤维的存在， 并且胶原纤维是无取向的。J.H.Bradt et al.(Chem.Mater.1999， 11， 2694-2701) 描述了在 4下制备两种溶液的方法， 第一种为用 HCl 酸化并含有 C。

24、aCl2的 1mg/mL 胶原溶液 ( 小牛 真皮 I 型胶原 )， 第二种为含有磷酸根离子的缓冲溶液。然后将磷酸盐溶液与胶原溶液混 合， 使得可以实现 6.8 的 pH， 并将整体混合物加热到 30。共沉淀得到含有磷酸钙、 羟基磷 灰石和磷酸八钙的混合物相。另外， 胶原纤维为分离的无取向纤维， 并且不构成致密基质。 N.Gehrke， N.Nassif et al.(Chem.Mater.2005， 17， 6514-6516) 描述了在存在或不存在聚 说 明 书 CN 102105179 B 5 3/7 页 6 ( 天冬氨酸 ) 型聚合物的条件下， 用碳酸钙将预先去矿化的珍珠母的有机网络再。

25、矿化。 0020 目前没有已知的合成方法使得可以获得这样的骨替代物， 其再现在天然骨中所观 察到的与磷灰石晶体矿物相结合的胶原的级别 4 的三维结构。 发明内容 0021 本发明的目的是提供合成材料及其制备方法， 所述合成材料可以用作结构非常接 近活骨 ( 级别 4) 结构的生物相容性骨替代物。 0022 本发明的合成材料包含有机相 (I) 和矿物相 (II)。 0023 所述有机相 (I) 包含由胶原 I 三螺旋构成的条纹胶原原纤维， 以及它们未有序化 的各向同性结构域， 其中所述条纹的周期为约 67nm， 所述原纤维是根据联合了排列成行的 结构域和胆甾型结构域的 3D 几何形状在一大段距离。

26、上有序化的。 0024 所述矿物相 (II) 包含具有六方晶体结构的磷灰石晶体， 空间群 6/m， 所述晶体包 含至少钙离子和至少磷酸根离子。 0025 在本发明的材料中， 所述矿物相的磷灰石晶体的 c 轴与所述有机相的条纹胶原原 纤维的纵轴共排列。 0026 所述材料的胶原含量为至少 75mg/cm3。 0027 在所述材料中， 各种结构域 ( 胆甾型、 线型和各向同性 ) 的数量级为约 50 微米。 0028 根据一具体实施方案， 矿物相由纯羟基磷灰石晶体组成。 对本申请的目的而言， 术 语 “纯羟基磷灰石” 旨在表示不含诸如透钙磷石的其他结晶磷酸盐相的羟基磷灰石。 0029 在本发明的一。

27、具体实施方案中， 矿物相由化学计量的下式 (I) 的羟基磷灰石晶体 组成 ： 0030 Ca10(PO4)6(OH)2 (I) 0031 根据本发明的一具体实施方案， 式 (I) 的羟基磷灰石晶体的 Ca/P 原子比为 1.67。 0032 根据本发明的另一实施方案， 矿物相包含磷灰石晶体， 其还包含至少氢氧根离子， 其中磷酸根离子 (B 型 ) 和 / 或氢氧根离子 (A 型 ) 部分地由碳酸根离子代替。 0033 在这些羟基磷灰石中， 晶体结构的一个或多个位置可以不含离子。 在这种情况下， 它们为包含称为一个或多个离子间隙的非化学计量羟基磷灰石。 0034 在另一实施方案中， 矿物相包含磷。

28、灰石晶体， 其包含 Ca2+离子、 PO43-离子和 OH-离 子， 其中 Ca2+、 PO43-或 OH-离子的至少一种部分地由其他离子代替。 0035 在能够部分地代替 Ca2+离子的离子中， 可以提及 Mg2+、 Cu2+、 Sr2+、 Ba2+、 Zn2+、 Cd2+、 Pb2+、 Na+、 K+和 Eu3+离子。 0036 在能够部分地代替 PO43-离子的离子中， 可以提及 CO32-、 SiO43-、 AsO43-、 MnO43-、 VO43-、 CrO43-和 HPO42-离子。 0037 在能够部分地代替 OH-离子的离子中， 可以提及 CO32-、 F-、 Cl-、 Br-。

29、、 I-、 S2-和 O2-离 子。 0038 本发明的材料还可以含有少量的蛋白聚糖、 糖胺聚糖和 / 或促进矿化的有机分 子。术语 “少量” 意图表示小于 2的比例。 0039 本发明材料的特征可以通过光学显微镜分析、 扫描电子显微镜 SEM 分析、 透射电 子显微镜 TEM 分析和 X- 射线衍射分析确定。 说 明 书 CN 102105179 B 6 4/7 页 7 0040 通过偏振光光学显微镜观察到本发明材料的半薄部分显示出双折射的性质。 在理 想的情况下， 在显微平台旋转期间， 对与这些条纹的运动有关的交替亮带和暗带的观察表 明了螺旋结构。 0041 通过 SEM 分析， 本发明材。

30、料的样品显示出包埋于矿化层中的定向原纤维， 并且无 约一毫米的单独晶体聚集。 0042 对本发明材料所拍的小角 X- 射线散射照片显示出胶原原纤维的各向异性信号和 D 67nm 的谐波周期。广角 X- 射线散射照片显示出磷灰石相的主峰。原纤维信号与矿物 信号之间存在的共排列表征了本发明的材料。 更特别地在原纤维排列成行的区域中局部地 证实这一共排列。 0043 本发明的材料可以通过以下方法获得 ： 制备作为有机相 (I) 的前体的胶原的初始 酸性水溶液， 以及至少一种矿物相(II)的前体的水溶液 ； 并且通过将pH升高到至少7来沉 淀该胶原。其特征在于 ： 0044 - 胶原在酸性水溶液中的浓。

31、度为至少 75mg/ml， 并且在所述 pH 升高时保持恒定 ； 0045 - 矿物相前体包含至少一种钙盐和至少一种磷酸盐， 0046 - 矿物相 (II) 的沉淀通过使矿物相前体溶液与有机相 (I) 接触来进行， 所述接触 在所述有机相 (I) 沉淀之前或之后进行。接触的持续时间根据沉淀速度和最终材料中预想 的矿物填充物水平而设置。 0047 在所述方法的第一实施方案中， 将有机相(I)的胶原在使其与矿物相(II)的前体 的中性溶液接触前沉淀。在这种情况下， 矿物相 (II) 的前体的溶液包含至少所述钙盐和至 少所述磷酸盐。最终材料中矿物相的比例通过引入溶液的离子的量来调节。在该实施方案 中。

32、， 胶原在使其与矿物相接触前要求其纤维结构。 0048 在所述方法的第二实施方案中， 使有机相(I)的前体的酸性溶液与(II)的前体的 酸性溶液接触。 然后升高混合物的pH， 这导致胶原与磷灰石的共沉淀。 在该实施方案中， 特 别重要的是保持胶原的初始浓度恒定。避免稀释的第一种方法是在模具中含有有机相 (I) 的前体的浓酸性溶液， 该模具的形状适合于期望的用途， 并且封入渗析膜中。 第二种方法是 将浓胶原溶液引入由渗析膜构成的柔性包膜 (enveloppe) 中。然后将模具或所述包膜浸入 矿物相 (II) 的前体的溶液中。 0049 当本发明的材料的矿物相 II 由纯羟基磷灰石的晶体组成时， 。

33、所述方法优选在密 闭室中进行， 该密闭室中放置了 ： 0050 - 至少一个第一容器， 其含有至少一种磷酸盐和至少一种钙盐的水溶液， 其是矿物 相 II 的前体， 其中将至少一个渗析袋浸入该溶液中， 所述渗析袋含有作为有机相 (I) 的前 体的胶原的初始酸性水溶液， 0051 - 至少一个第二容器， 其含有氨水溶液或 (NH4)2CO3粉末 ； 0052 应当理解 ： 0053 -( 矿物相 I 前体溶液的体积 )/( 密闭室内部体积 ) 比为约 210-3， 0054 - 包含于第一容器中的矿物相 I 前体溶液的高度为约 3cm 至 5cm， 所述容器的直径 为约 2cm 至 5cm ； 0。

34、055 -( 氨水溶液的体积 )/( 密闭室内部体积 ) 比为 810-3， 或者 (NH4)2CO3粉末的体 积 )/( 密闭室内部体积 ) 比为约 610-3。 说 明 书 CN 102105179 B 7 5/7 页 8 0056 当具备这些条件时， 获得了其中矿物相 II 由纯磷灰石组成、 不含任何其他类型磷 酸钙相的材料。 0057 胶原的初始酸性水溶液优选具有下列特征 ： 0058 - 其胶原浓度为 75mg/mL 至 1000mg/mL， 优选 100mg/mL 至 400mg/mL， 0059 - 在酸的存在下， 其 pH 小于 4， 优选小于 3， 优选 0.5M 乙酸。 0。

35、060 矿物相 (II) 的前体的溶液优选具有下列特征 ： 0061 - 诸如 CaCl2的钙前体的浓度小于溶度极限， 优选 2.5mM 至 1.5M， 更优选 11mM 至 550mM ； 0062 - 诸如 NaH2PO4的磷酸盐前体的浓度小于溶度极限， 优选 1.5mM 至 900mM， 更优选 66mM 至 330mM ； 0063 - 前体的量是这样的 ： Ca/P 摩尔比为 1.5 至 1.8， 优选约 1.67。 0064 作为示例， 在 20下， NaH2PO4的溶度极限为 7.08M， 而 CaCl2的溶度极限为 3.83M。 0065 当期望材料的矿物相包含磷灰石晶体， 其。

36、含有 Ca2+离子、 PO43-离子和 OH-离子， 并 且其中 Ca2+、 PO43-或 OH-离子的至少一种部分地由其他离子代替时， 矿物相前体溶液还含有 一种或多种盐， 该盐的阳离子用于至少部分地代替 Ca2+； 和 / 或含有一种或多种盐， 该盐的 阴离子用于至少部分地代替 PO43-和 / 或 OH-。 0066 意图代替 Ca2+的阳离子的盐有利地选自含有单价或二价阳离子的盐， 例如 MgCl2、 BaCl2、 SrCl2、 NaCl、 KCl 和 NH4Cl。CO32-前体可以为 NaHCO3。CO32-前体的量优选为这样的 ： NaH2PO4/NaHCO3比等于 1。在碳酸盐的。

37、存在下， Ca/(P+C) 的摩尔比为 1.5 至 1.8， 优选约 1.67。 0067 矿物相 (II) 前体溶液还可以含有蛋白聚糖、 糖胺聚糖和 / 或促进矿化的有机分 子， 例如酸性氨基酸聚合物链， 优选这样的聚 ( 天冬氨酸 )， 其链长为 5 至 150 个氨基酸单 元、 优选约 15 个氨基酸单元， 并且浓度为 0.01g/mL 至 1.5mg/mL， 优选 10g/mL。 0068 在一具体实施方案中， 其中 PO43-或 OH- 部分地由 CO32-代替， pH 的升高有利地借助 于碱性气氛进行， 特别是 NH3气氛 ； 或者 (NH4)2CO3气氛。 0069 在一具体实施。

38、方案中， 所述方法包括额外的步骤， 其中将通过共沉淀获得的材料 用类似于生物体液的 “SBF” (“模拟体液” ) 溶液浸渍， 并且将介质的 pH 调节到 7.4。 0070 NaCl 137mM 至 213mM( 例如 213.0mM) 0071 NaHCO3 1.2mM 至 6.3mM( 例如 6.3mM) 0072 KCl 3mM 至 4.5mM( 例如 4.5mM) 0073 K2HPO43H2O 1mM 至 1.5mM( 例如 1.5mM) 0074 CaCl2 2.6mM 至 3.8mM( 例如 3.8mM) 0075 Na2SO3Na2SO4 0.5mM 至 0.75mM( 例如。

39、 0.75mM) 0076 MgCl26H2O 1.5mM 至 2.3mM( 例如 2.3mM)。 0077 该 SBF 溶液的浓度为生物体液实际测量浓度的约 1.5 倍 ( 参见 Zhang L.-J.et al.， Mater.Lett.2004， 58， 719-722)。 0078 在 37下， pH 可以用 0.01mol/L 三 ( 羟甲基 ) 氨基甲烷与 0.01mol/L HCL 的混合 物调节至 7.4。 说 明 书 CN 102105179 B 8 6/7 页 9 具体实施方式 0079 通过下列实施例更详细地描述本发明， 然而本发明并不受下列实施例的限制。 0080 在实。

40、施例中， 使用了I型胶原， 其根据下列方法制备自年幼Wistar大鼠尾。 将大鼠 尾腱在无菌层流罩超净台中切下， 并在含有137mM的NaCl、 2.68mM的KCl、 8.07mM的Na2HPO4 和 1.47mM 的 NaH2PO4的磷酸缓冲盐溶液中洗涤， 以除去细胞和痕量的血。然后将腱浸入 4M NaCl 溶液以除去残留的完整细胞并沉淀部分高分子量蛋白。用缓冲盐溶液再次洗涤后， 将 腱溶于含有 500mM 乙酸的水溶液中。通过以 41000g 离心 2h 使所得溶液澄清。将除了 I 型 胶原以外的蛋白选择性地从 300mM NaCl 水溶液沉淀， 随后通过以 41000g 离心 3h 除。

41、去。通 过从 600mM NaCl 水溶液沉淀， 随后以 3000g 离心 45min 从上清液回收胶原。将所得的团 (culot) 溶于 500mM 乙酸水溶液， 然后在相同溶剂中小心地渗析以完全除去 NaCl。 0081 将溶液保持在 4下， 并在使用前以 41000g 离心 4h。通过对高达 50 (m/v)、 溶 于 500mM 乙酸水溶液中的聚乙二醇 (35kDa， Fluka) 进行反渗析， 或者通过在层流罩超净台 中缓慢地蒸发来制备各种浓度的胶原溶液。 在原纤维生成之前通过测定羟脯氨酸的量来确 定酸性溶液的胶原浓度。当然， 也可以使用其他胶原来源。 0082 实施例 1 0083。

42、 通过在40mL的水中溶解110mM的NaH2PO4、 66mM的CaCl2、 500mM的乙酸和0.40g 的聚 ( 天冬氨酸 ) 来制备矿物相前体溶液。将溶液在 pH2.2 下平衡。 0084 用于该实施例的胶原溶液所含的胶原的量为约300mg/mL。 其为部分纤维弹性凝胶 的形式。 0085 将胶原溶液引入渗析袋 (MW 3500Da)， 该将袋置于敞口容器中的无机相前体溶 液中。然后在 20下， 将所述容器置于氨气氛下直到盐完全沉淀。 0086 氨气氛引起胶原与羟基磷灰石的共沉淀， 这从 3 小时开始可见。可以将反应介质 保留 8 天以熟化。 0087 通过浸入溶液， 有利地浸入 PB。

43、S 磷酸盐缓冲溶液来洗涤样品。 0088 图 2 示出通过 X- 射线散射的材料分析。图 2a 表示 SAXS 照片， 图 2b 表示 WAXS 照 片。SAXS 照片表示胶原原纤维的各向异性信号以及 D 67nm 的谐波周期 ； 这证明了沿原 纤维主轴每 67nm 的条纹周期性。WAXS 照片显示 (002) 反射面， 其在与 (a) 中所观察到的原 纤维信号相同的方向上增强， 表征了磷灰石的存在。因此， 这表明磷灰石晶体的 c 轴沿胶原 原纤维的主轴取向。对应于原纤维中胶原分子的间距 d侧面的信号与磷灰石的 (002) 反射面 垂直， 并与磷灰石的 (300) 反射面平行。因此， 这些晶面。

44、优选地根据胶原分子的方向取向。 这样的 X- 射线散射特征与在骨上发现的相当。 0089 图 3 表示 SEM 显微图。其表示矿化的取向原纤维 ( 排列成行的结构域 ) 的存在。 0090 图4表示通过偏正光光学显微镜在正交偏振棱镜(A， B)之间所观察的用充当材料 的造影剂的甲苯胺蓝染色的半薄部分。 4B表示与4A相同的区域， 其也在正交偏振棱镜之间 观察到， 但相对于 4A 旋转了 45。在一方面， 双折射是由于有机相的结构， 而在另一方面， 双折射是由于其用矿物相浸渍。 偏振棱镜两个位置之间双折射带的变化表明下列不同结构 域的共存 ： (i) 排列成行的结构域， 其特征在于 4A 与 4。

45、B 之间由于矿化的胶原原纤维相互排 列成行而消失的双折射区域 ； 以及 (ii) 胆甾型结构域， 其特征在于 4A 与 4B 之间由于矿化 的胶原原纤维规律地从一个平面朝另一平面旋转的朝向而亮与暗带反转交替的双折射区 说 明 书 CN 102105179 B 9 7/7 页 10 域。第三结构域与前两个共存， 这是 “各向同性” 结构域， 其中矿化的胶原原纤维在材料中 随机地分布 ； 因此， 该结构域在 4A 与 4B 中未显示出双折射区域。 0091 因此， 根据纳米压痕 (nanoindentation) 技术还进行了材料的机械性质， 特别是 弹性模量的测量。该测量使用 Ubi 1 纳米机。

46、械压痕系统 (Hysitron Inc.， Minneapolis， MN， USA) 和 Berkovich 压头 (indenter tip)， 10m2进行。据发现， 相对于胶原原纤维纵轴 0和 90的弹性模量的比率为 1.431.18。该比率的数量级与天然密质骨所获得的比率 相当， 即 1.500.315， 这表明本发明材料的各向异性程度以及由此的其纤维结构与在骨中 发现的类似。 0092 实施例 2 0093 将胶原的稀释溶液 (1mg/L) 以这样的方式注入 15L 玻璃微室中， 从而抵消水蒸 发。 持续注射直到获得致密的液晶胶原相。 将胶原在氨气氛下沉淀， 然后将微室浸入调节至 。

47、pH 7.4 的矿物前体的溶液 ( 所述溶液含有 ： 213.0mM NaCl、 6.3mM NaHCO3、 4.5mM KCl、 1.5mM K2HPO4 3H2O、 3.8mMCaCl2、 0.75mM Na2SO3Na2SO4和 2.3mM MgCl26H2O)， 并将该溶液在 37下 保持 6 个月的时间段。 0094 然后通过浸入磷酸盐缓冲溶液 (PBS) 来洗涤沉淀的材料。 0095 图 5 示出通过 X- 射线散射的材料分析。5a 表示 SAXS 照片， 5b 表示 WAXS 照片。两 张照片与实施例 1 的照片类似。 0096 实施例 3 0097 将稀释至 5mg/mL 的胶。

48、原溶液以这样的方式注入 15L 玻璃微室， 从而抵消水蒸 发， 该胶原溶液预先对NaH2PO4(66mM)和CaCl2(110mM)的溶液进行渗析。 持续注射直到获得 致密的液晶胶原相。在敞口容器中， 将微室浸入类似于实施例 1 的无机相前体的溶液。然 后在 20下， 将所述容器放置于碳酸铵气氛下， 直到盐完全沉淀。 0098 氨和二氧化碳的气氛引起胶原与羟基磷灰石的共沉淀， 这从 3 小时开始可见。可 以将反应介质保留 8 天以熟化。 0099 通过浸入磷酸盐缓冲溶液 PBS 来洗涤样品。 0100 图 6 表示 SEM 显微图。其表示表现出螺旋结构 ( 胆甾型结构域 ) 的矿化纤维的存 在。 说 明 书 CN 102105179 B 10 1/4 页 11 图 1 说 明 书 附 图 CN 102105179 B 11 2/4 页 12 图 2 图 3 说 明 书 附 图 CN 102105179 B 12 3/4 页 13 图 4 说 明 书 附 图 CN 102105179 B 13 4/4 页 14 图 5 图 6 说 明 书 附 图 CN 102105179 B 14 。