一种可吸收复合界面的螺钉及制备方法.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 103893836 A (43)申请公布日 2014.07.02 CN 103893836 A (21)申请号 201410128124.8 (22)申请日 2014.04.01 A61L 31/16(2006.01) A61L 31/14(2006.01) A61L 31/08(2006.01) A61L 31/10(2006.01) A61B 17/68(2006.01) (71)申请人 浙江大学 地址 310027 浙江省杭州市西湖区浙大路 38 号 (72)发明人 严世贵 吴浩波 师钟丽 刘安 (74)专利代理机构 杭州求是专利事务所有限公 司 33200 代。

2、理人 张法高 赵杭丽 (54) 发明名称 一种可吸收复合界面的螺钉及制备方法 (57) 摘要 本发明提供一种可吸收复合界面的螺钉， 由 螺钉帽、 螺杆、 螺钉头连接件、 基因薄层构成， 螺杆 外缘设有自攻螺纹， 基因薄层覆盖在螺纹表面。 基 因薄层由壳聚糖的基底层及由内向外依次间隔覆 有透明质酸层和脂质体-2000包裹的pEGFP-COMP 质粒层形成的活化层。 本发明利用壳聚糖、 透明质 酸、 脂质体的静电作用使质粒 pEGFP-COMP 在界面 螺钉表面逐层沉积。本发明具有良好的生物相容 性和骨诱导性， 能有效调控 COMP 基因的释放以增 强促钙化纤维软骨效应， 提高宿主细胞转染率， 诱。

3、 导韧带植入后骨 - 韧带界面良好愈合， 可实现关 节内韧带重建手术联合基因治疗。本发明设计合 理， 操作便捷且成本低廉， 具有极强的可行性， 适 合用于产业化应用。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 5 页 附图 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书5页 附图3页 (10)申请公布号 CN 103893836 A CN 103893836 A 1/1 页 2 1. 一种可吸收复合界面的螺钉， 其特征在于， 由螺钉帽 （1） 、 螺杆 （2） 、 螺钉头 （3） 、 连接 件 （4） 、 基因薄层 （5） 构成， 螺钉帽 。

4、（1） 与螺杆 （2） 通过连接件 （4） 固定连接， 螺钉头 （3） 设 置在螺杆 （2） 头端， 螺钉帽 （1） 上端设有与安装螺钉扭力扳手相对应的凹槽 （6） ， 螺杆 （2） 外 缘设有自攻螺纹 （7） ， 基因薄层 （5） 覆盖在螺杆螺纹表面。 2. 根据权利要求 1 所述的一种可吸收复合界面的螺钉， 其特征在于， 基因薄层 （5） 由壳 聚糖的基底层及由内向外依次间隔覆有透明质酸层和脂质体 -2000 包裹的 pEGFP-COMP 质 粒层形成的活化层， 壳聚糖基底层为 1 层， 所述活化层中脂质体包裹的 pEGFP-COMP 质粒层 和透明质酸层总层数为 4-24 层。 3. 根。

5、据权利要求 1 所述的一种可吸收复合界面的螺钉的制备方法， 其特征在于， 通过 以下步骤 ： （1） 左旋聚乳酸以 0.2g ml-1的浓度溶解于 1， 4- 环氧六环溶液中， 然后加入 20HAP 粉 末， 上述两者质量比为 2:8 进行混合 ； （2） 将直径为 280-450um 的 NaCl 颗粒加入直径为 4mm 的螺钉模型中紧密填充， 置于 70饱和水蒸气的环境中 1.5h， 室温冷却后， 将步骤 （1） 所得的 PLLA/20HAP 混合物缓慢加 入其中， 在 0.07-0.08Mpa 条件下抽真空除去气泡， 在 -40冰箱中预冻 3 小时后进行冷冻 24h， 作为样品 ； （3。

6、）将步骤 （2）中制得的样品浸泡在蒸馏水中 24h， 除去 NaCl， 再次冷冻干燥制得 PLLA/20HAP 可吸收复合界面螺钉 ； （4） 将步骤 （3） 中制得的 PLLA/20HAP 可吸收复合界面螺钉浸于壳聚糖溶液中 30 分钟 后， 用 opti-DMEM 培养液浸洗 2-3 次， 每次 1-2 分钟 ； （5） 将步骤 （4） 中制得的 PLLA/20HAP 可吸收复合界面螺钉浸于透明质酸溶液中 10-15 分钟后， 用去离子水浸洗 2-3 次， 每次 1-2 分钟 ； （6）将步骤 （5）中制得的 PLLA/20HAP 可吸收复合界面螺钉浸于脂质体包裹的 pEGFP-COMP质。

7、粒的opti-DMEM培养液中10-15分钟后， 用去离子水浸洗2-3次， 每次1-2分 钟 ； （7） 依次重复步骤 （5） 和步骤 （6） ， 直至得到所需的 COMP 基因薄层组装的可吸收复合界 面螺钉。 4. 根据权利要求 3 所述的一种可吸收复合界面的螺钉的制备方法， 其特征在于， 壳聚 糖溶液的浓度为 5mg/ml， 透明质酸溶液浓度为 0.5mg/ml。 5. 根据权利要求 3 所述的一种可吸收复合界面的螺钉的制备方法， 其特征在于， 脂质 体包裹的 pEGFP-COMP 质粒的 opti-DMEM 培养液中， 将 200ul 脂质体 -2000 与 100ug 质粒混 合， 培。

8、养液的 pH 值为 7.4。 权 利 要 求 书 CN 103893836 A 2 1/5 页 3 一种可吸收复合界面的螺钉及制备方法 技术领域 0001 本发明属关节内韧带重建术中界面螺钉的制造， 具体涉及一种 COMP 基因薄层组 装的可吸收复合界面螺钉及其制备方法。 背景技术 0002 关节镜下韧带重建术是目前治疗关节内韧带损伤、 恢复关节稳定性及功能有效的 外科治疗手段， 据美国骨科运动医学学会 （AOSSM） 统计， 全球每年至少 60 万人进行关节内 韧带重建术， 占关节手术的 21.6%。尽管该技术临床上取得了巨大的疗效， 但是骨 - 韧带界 面愈合难题仍然困扰着广大临床工作者，。

9、 一旦韧带 - 骨界面愈合不良， 很有可能导致整个 手术失败。因此如何提高韧带 - 骨愈合是决定手术远期疗效和预防术后并发症的关键因 素。 0003 目前， 临床常用的韧带固定方法是经骨髓道可吸收界面螺钉固定。界面螺钉多由 左旋聚乳酸 （poly L-lactic acid, PLLA） 构成。PLLA 具有良好的生物相容性和适宜的降 解速度， 随着自身材料的吸收， 骨组织同步的填充整个隧道， 使植入韧带与隧道形成良好的 愈合。 0004 然而， 单纯的PLLA没有骨诱导功能， 可因隧道内成骨速度与PLLA吸收程度不匹配 而使隧道扩大， 韧带固定不稳。临床上当前运用复合羟基磷灰石 （hydro。

10、xyapatite, HAP） 的可吸收螺钉在诱导成骨方面有一定程度改善， 然而， 由于人工合成 HAP 与人体骨骼中 HAP 存在尺寸差异， 导致成骨效果依旧不佳。因此， 通过构建近似于人体 HAP 的 20 纳米 HAP 与 PLLA 制备可吸收界面螺钉可改进其诱导成骨活性。 0005 同时， 相关研究指出， 人体正常韧带 - 骨连接结构中的钙化纤维软骨层是连接 韧带和骨组织的主要过渡结构。钙化纤维软骨主要由大量细胞外基质 （extracellular matrix, ECM） 包绕少量肥大软骨细胞构成。非胶原蛋白作为 ECM 中的主要组成部分， 其中 软骨寡聚基质蛋白 （cartilag。

11、e oligomeric matrix protein, COMP） 具有诱导基质干细胞 粘附、 软骨分化、 参与调控 ECM 与骨组织见的构建， 维持钙化软骨过渡结构的作用。 0006 壳聚糖、 透明质酸均具有良好的生物相容性和可降解性， 广泛应用于组织工程领 域。脂质体因其良好的脂溶性常作为细胞转染的工具， 通过构建 pEGFP-COMP 重组质粒， 并 利用脂质体进行包裹可以有效提高重组质粒的转染效率， 并方便借助绿色荧光蛋白监控转 染效率。借助层层静电自组装技术， 利用壳聚糖、 透明质酸、 脂质体所带电荷的正负性， 将 pEGFP-COMP 组装至可吸收界面螺钉表面， 在生理条件下促使。

12、基因薄层降解并长时间释放质 粒 DNA， 利用基因治疗手段促进钙化纤维软骨形成以促进骨 - 韧带愈合。 发明内容 0007 本发明的目的之一是提供一种可吸收复合界面的螺钉， 是一种软骨寡聚基质蛋白 （COMP） 基因薄层组装的可吸收复合界面螺钉， 该界面螺钉具有良好的生物相容性和骨诱导 性， 最重要的是能够有效的调控 COMP 基因的释放以增强促钙化纤维软骨效应， 提高宿主细 说 明 书 CN 103893836 A 3 2/5 页 4 胞转染率， 诱导韧带植入后骨 - 韧带界面良好愈合， 为关节内韧带重建手术联合基因治疗 提供全新思路。 0008 本发明所述的一种可吸收复合界面的螺钉， 由螺。

13、钉帽 1、 螺杆 2、 螺钉头 3、 连接件 4、 基因薄层5构成， 螺钉帽1与螺杆2通过连接件4固定连接， 螺钉头3设置在螺杆2头端， 螺钉帽 1 上端设有与安装螺钉扭力扳手相对应的凹槽 6， 螺杆 2 外缘设有自攻螺纹 7， 基因 薄层 5 覆盖在螺杆螺纹表面。 0009 所述基因薄层 5 由壳聚糖的基底层及由内向外依次间隔覆有透明质酸层和脂质 体 -2000 包裹的 pEGFP-COMP 质粒层形成的活化层。壳聚糖基底层为 1 层， 所述活化层中脂 质体包裹的 pEGFP-COMP 质粒层和透明质酸层总层数为 4-24 层。 0010 本发明的目的之二是提供所述的可吸收复合界面的螺钉的制。

14、备方法， 通过以下步 骤 ： （1） 左旋聚乳酸 （PLLA） 以 0.2g ml-1的浓度溶解于 1， 4- 环氧六环溶液中， 然后加入 20 羟基磷灰石 （HAP） 粉末， 上述两者质量比为 2:8 进行混合 ； （2） 将直径为 280-450um 的 NaCl 颗粒加入直径为 4mm 的螺钉模型中紧密填充， 置于 70饱和水蒸气的环境中 1.5h， 室温冷却后， 将步骤 （1） 所得的 PLLA/20HAP 混合物缓慢加 入其中， 在 0.07-0.08Mpa 条件下抽真空除去气泡， 在 -40冰箱中预冻 3 小时后进行冷冻 24h， 作为样品 ； （3）将步骤 （2）中制得的样品浸泡。

15、在蒸馏水中 24h， 除去 NaCl， 再次冷冻干燥制得 PLLA/20HAP 可吸收复合界面螺钉 ； （4） 将步骤 （3） 中制得的 PLLA/20HAP 可吸收复合界面螺钉浸于壳聚糖溶液中 30 分钟 后， 用 opti-DMEM 培养液浸洗 2-3 次， 每次 1-2 分钟 ； （5） 将步骤 （4） 中制得的 PLLA/20HAP 可吸收复合界面螺钉浸于透明质酸溶液中 10-15 分钟后， 用去离子水浸洗 2-3 次， 每次 1-2 分钟 ； （6）将步骤 （5）中制得的 PLLA/20HAP 可吸收复合界面螺钉浸于脂质体包裹的 pEGFP-COMP质粒的opti-DMEM培养液中1。

16、0-15分钟后， 用去离子水浸洗2-3次， 每次1-2分 钟 ； （7） 依次重复步骤 （5） 和步骤 （6） ， 直至得到所需的 COMP 基因薄层组装的可吸收复合界 面螺钉。 0011 所述的壳聚糖溶液的浓度为 5mg/ml ； 所述的透明质酸溶液浓度为 0.5mg/ml。 0012 所述的脂质体包裹的 pEGFP-COMP 质粒的 opti-DMEM 培养液中， 将 200ul 脂质 体 -2000 与 100ug 质粒混合， 培养液的 pH 值为 7.4。 0013 本发明的有益效果是 ： 1、 本发明具有良好的生物相容性和骨诱导性， 最重要的是能够有效的调控 COMP 基因 的释放以。

17、增强促钙化纤维软骨效应， 提高宿主细胞转染率， 诱导韧带植入后骨 - 韧带界面 良好愈合， 具有广阔的临床运用前景。 0014 2、 本发明突破了传统手术治疗关节内韧带损伤的模式， 运用手术治疗结合基因治 疗， 将促进钙化纤维软骨形成的 COMP 基因直接组装在螺钉表面并有效控制其释放到局部 组织发挥效应， 为关节内韧带损伤的治疗提供全新思路。 0015 3、 本发明所述的制造方法中利用脂质体包裹 pEGFP-COMP， 充分发挥脂质体的脂溶 说 明 书 CN 103893836 A 4 3/5 页 5 性及其与细胞膜的亲和力， 可有效的增加单一质粒层的细胞转染效率， 更好地发挥基因治 疗的效。

18、力。 0016 4、 本发明所述的制造方法利用壳聚糖、 透明质酸、 脂质体的静电作用使质粒 pEGFP-COMP 在界面螺钉表面逐层沉积， 不仅操作便捷而且成本低廉， 具有极强的可行性， 适 合用于产业化应用。 附图说明 0017 图 1 为本发明主视结构示意图。 0018 图 2 为本发明横断面基因薄层组装示意图。 0019 图 3 为本发明基因薄层表面样貌的扫描电镜照片。 0020 图 4 为本发明随组装基因薄层层数增加表面接触角变化趋势。 0021 图 5 为本发明随组装基因薄层层数增加 260nm 紫外吸光度变化趋势。 0022 图 6 为不同层数的基因薄层转染间充质干细胞共培养 48。

19、h 荧光显微镜照片。 0023 图7为不同层数的基因薄层转染间充质干细胞共培养48hGFP荧光强度变化趋势。 具体实施方式 0024 本发明结合附图和实施例作进一步的说明。 0025 实施例 1 参见图 1、 图 2， 本发明所述的一种可吸收复合界面的螺钉， 由螺钉帽 1、 螺杆 2、 螺钉头 3、 连接件 4、 基因薄层 5 构成， 螺钉帽 1 与螺杆 2 通过连接件 4 固定连接， 螺钉头 3 设置在螺 杆 2 头端， 螺钉帽 1 上端设有与安装螺钉扭力扳手相对应的凹槽 6， 螺杆 2 外缘设有自攻螺 纹 7， 基因薄层 5 覆盖在螺杆螺纹表面。 0026 实施例 2COMP 基因薄层组装。

20、的可吸收复合界面螺钉制造并表征检测 （1） PLLA 以 0.2g ml-1的浓度溶解于 1， 4- 环氧六环溶液中， 然后加入 20HAP 粉末， 上述 两者质量比为 2:8 进行混合 ； （2） 将直径为 280-450um 的 NaCl 颗粒加入直径为 4mm 的螺钉模型中紧密填充， 置于 70饱和水蒸气的环境中 1.5h， 室温冷却后， 将步骤 （1） 所得的 PLLA/20HAP 混合物缓慢加 入其中， 在 0.07-0.08Mpa 条件下抽真空除去气泡。在 -40冰箱中预冻 3 小时后进行冷冻 24h ； （3）将步骤 （2）中制得的样品浸泡在蒸馏水中 24h， 除去 NaCl， 。

21、再次冷冻干燥制得 PLLA/20HAP 可吸收复合界面螺钉 ； （4） 将步骤 （3） 中制得的 PLLA/20HAP 可吸收复合界面螺钉浸于 5mg/ml 壳聚糖溶液中 30 分钟后， 用 opti-DMEM 培养液浸洗 2 次， 每次 1 分钟 ； （5） 将步骤 （4） 中制得的 PLLA/20HAP 可吸收复合界面螺钉浸于 0.5mg/ml 透明质酸溶 液中 10 分钟后， 用去离子水浸洗 2 次， 每次 1 分钟 ； （6）将步骤 （5）中制得的 PLLA/20HAP 可吸收复合界面螺钉浸于脂质体包裹的 pEGFP-COMP 质粒的 pH 为 7.4 的 opti-DMEM 培养液中。

22、 10 分钟后， 用去离子水浸洗 2 次， 每次 1-2 分钟 ； （7） 依次重复步骤 （5） 和步骤 （6） ， 直至得到所需的 COMP 基因薄层组装的可吸收复合界 说 明 书 CN 103893836 A 5 4/5 页 6 面螺钉。 0027 所述的脂质体包裹的 pEGFP-COMP 质粒的 opti-DMEM 培养液中， 将 200ul 脂质 体 -2000 与 100ug 质粒混合， 培养液的 pH 值为 7.4。 0028 通过场发射扫描电子显微镜检测本发明基因薄层表面样貌。 通过静滴接触角测量 仪检测基因薄层组装过程中依次组装各层的表面接触角。 通过紫外分光光度计检测基因薄 。

23、层组装过程中依次组装一组透明质酸 +pEGFP-COMP 质粒层的 260nm 紫外吸光度。 0029 本实例中， 透明质酸层和 pEGFP-COMP 质粒层总层数不低于 4 层可维持界面螺钉 表面较稳定的基因薄层结构， 通过增加基因薄层层数以达到调控界面螺钉转载基因量的目 的。总层数以 4-24 层最佳， 从而实现特定时间内质粒 DNA 保证一定浓度持续释放， 同时避 免过多层数所导致质粒 DNA 短时间释放难以控制或过量。 0030 本实例中， 界面螺钉在壳聚糖溶液中可浸泡 30 分钟， 但并不代表本发明将其局限 于 30 分钟， 浸泡的目的在于使壳聚糖层能够借助其所带的正电荷充分吸附界面。

24、螺钉表面， 浸泡时间长壳聚糖聚阳离子层的充分形成， 为随后的基因薄层组装打下聚阳离子薄层基 础。因此浸泡时间以壳聚糖层充分形成为宜。 0031 本实例中， 界面螺钉在透明质酸及opti-DMEM培养液中可浸泡10-15分钟， 但并不 代表本发明将其局限于 10-15 分钟， 浸泡的目的在于使透明质酸层及脂质体包裹质粒层能 够借助层层静电自组装的原理依次间隔附于界面螺钉表面， 浸泡时间长更利于聚阴离子或 聚阳离子层的充分形成， 使其在界面螺钉覆盖更完整， 单层更加平整。 因此浸泡时间以各层 达到最佳覆盖效果为宜。 0032 本实例中， 界面螺钉在各溶液中浸泡结束后， 均需要用去离子水进行浸泡洗涤。

25、， 各 个过程中去离子水浸洗次数为 2-3 次， 每次 1-2 分钟为宜。原因在于浸洗的主要目的是去 除在同一层中可能形成的双层或多层聚阴、 阳离子， 以免导致随后的组装结构失去稳定， 同 时浸洗时间过长易导致已组装的多层结构发生解离。 0033 参见图 3， 结果显示， 随组装基因薄层层数增加表面粗糙程度逐渐增加， 说明组装 过程中界面螺钉表面活性物质持续增加。 0034 参见图 4， 结果显示， 随组装基因薄层层数增加表面接触角呈波动性变化。说明组 装过程中界面螺钉表面呈两种物质交替性组装。 0035 参见图 5， 结果显示， 随组装基因薄层质粒层数增加 260nm 紫外吸光度增加。说明 。

26、随组装层数的增加， 基因数量逐渐增加。 0036 实施例 3 不同层数的基因薄层对间充质干细胞转染的效率探究。 0037 采用例1的制造方法， 分别制造0、 4、 8和12层的COMP基因薄层组装的可吸收复合 界面螺钉。采用密度梯度离心法和差时贴壁法培养 SD 大鼠间充质干细胞 , 将间充质干细 胞接种到六孔板与不同层数的界面螺钉共培养， 细胞接种密度为 40000cells/cm2。用 DMEM 培养基加 10% 胎牛血清进行培养。48h 后用荧光显微镜观察不同层数的各组中 GFP 荧光以 检测细胞转染情况， 通过 IPP6.0 软件计算各组中 GFP 荧光强度。 0038 参见图 6、 7。

27、， 结果显示， 随界面螺钉基因薄层层数增加， GFP 荧光强度增加。说明界 面螺钉上的基因薄层有效释放基因， 并随基因数量增加转染效率逐渐提高。 0039 实施例 4 不同层数的基因薄层对间充质干细胞成纤维软骨影响 采用例 1 的制造方法， 分别制造 0、 4、 8 和 12 层的 COMP 基因薄层组装的可吸收复合界 说 明 书 CN 103893836 A 6 5/5 页 7 面螺钉。采用密度梯度离心法和差时贴壁法培养 SD 大鼠间充质干细胞 , 将间充质干细胞 接种到六孔板与不同层数的界面螺钉共培养， 细胞接种密度为 20000cells/cm2。用 DMEM 培 养基加 10% 胎牛血。

28、清进行培养， 每隔 2 天换液一次。5d 后以 0.25% 胰酶消化， 收集细胞， 用 TRIzol 裂解细胞， 提 RNA 后行 RT-PCR， 检测不同层数的各组中型胶原纤维的表达量。 0040 无需进一步详细阐述， 相信采用前面所公开的内容， 本领域的技术人员可最大限 度地应用本发明。 因此， 前面的实施方案应理解为仅是举例说明， 而并非以任何方式限制本 发明的应用范围。所以本发明的主要范围将由附属的权利要求及其等同体来确定。 说 明 书 CN 103893836 A 7 1/3 页 8 图 1 图 2 图 3 说 明 书 附 图 CN 103893836 A 8 2/3 页 9 图 4 图 5 说 明 书 附 图 CN 103893836 A 9 3/3 页 10 图 6 图 7 说 明 书 附 图 CN 103893836 A 10 。