用于骨组织工程的多孔复合支架及其制备方法.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710956743.X (22)申请日 2017.10.12 (71)申请人 广州贝奥吉因生物科技有限公司 地址 510663 广东省广州市萝岗区高新技 术产业开发区科学城掬泉路3号广州 国际企业孵化器A区A702 (72)发明人 郭瑞 刘玉 毛宇 蓝咏 (74)专利代理机构 广州三环专利商标代理有限 公司 44202 代理人 宋静娜 郝传鑫 (51)Int.Cl. A61L 27/48(2006.01) A61L 27/46(2006.01) A61L 27/50(200。

2、6.01) A61L 27/56(2006.01) A61L 27/58(2006.01) C08B 15/02(2006.01) (54)发明名称 用于骨组织工程的多孔复合支架及其制备 方法 (57)摘要 本发明公开了一种用于骨组织工程的多孔 复合支架， 其制备原料包含以下重量份的组分： 100份的葡聚糖， 17份的纳米微晶纤维素和11 33份的三偏磷酸钠。 本发明多孔复合支架由葡 聚糖和纳米微晶纤维素制得， 纳米微晶纤维素均 匀分布于支架中， 使得支架力学性能优良， 而且 该支架具有良好的生物相容性， 能够支持和促进 髓间充质干细胞的软骨分化； (2)该复合多孔支 架具有孔隙率高、 孔径均。

3、匀的优点， 并且可以在 人体中及时完全降解， 不会长期残留在人体中； (3)本发明将葡聚糖、 纳米微晶纤维素通过多糖 交联以及冷冻干燥的方法， 形成葡聚糖/纳米微 晶纤维素多孔支架， 制备工艺简单、 材料来源广 泛， 生产效率高， 成本低， 可应用于工业化大生 产。 权利要求书1页 说明书6页 附图5页 CN 107875452 A 2018.04.06 CN 107875452 A 1.一种用于骨组织工程的多孔复合支架， 其特征在于， 所述多孔复合支架的制备原料 包含以下重量份的组分： 100份的葡聚糖， 17份的纳米微晶纤维素和1133份的三偏磷酸 钠。 2.根据权利要求1所述的多孔复合支。

4、架， 其特征在于， 所述制备原料的组分中， 所述葡 聚糖和纳米微晶纤维素的质量比为1： 0.030.07。 3.根据权利要求2所述的多孔复合支架， 其特征在于， 所述葡聚糖和纳米微晶纤维素的 质量比为1： 0.05。 4.根据权利要求1所述的多孔复合支架， 其特征在于， 所述多孔复合支架的孔隙率为91 96， 孔径为80223 m。 5.根据权利要求1所述的多孔复合支架， 其特征在于， 所述纳米微晶纤维素为棒状结 构， 所述棒状结构的长度为140360nm， 宽度为2040nm。 6.如权利要求15任一项所述的多孔复合支架的制备方法， 其特征在于， 包括以下步 骤： (1)将葡聚糖溶于去离子水。

5、中加热溶解； (2)将纳米微晶纤维素加入步骤(1)所得葡聚糖溶液中混合均匀， 先后加入碱溶液和三 偏磷酸钠溶液， 反应完全后迅速冷冻， 随后在-80下冻干， 得到所述的多孔复合支架。 7.根据权利要求6所述的制备方法， 其特征在于， 所述步骤(1)中加热温度为4060。 8.根据权利要求6所述的制备方法， 其特征在于， 所述步骤(2)中迅速冷冻的温度为-80 。 9.根据权利要求6所述的制备方法， 其特征在于， 所述纳米微晶纤维素的制备方法包括 如下步骤： 将纤维素加入质量浓度为3570的浓硫酸中， 在3065恒温水浴下磁力搅 拌， 反应16h， 然后加入去离子水以终止反应， 冷却后经超声分散。

6、， 之后使用去离子水透析 至pH稳定， 经-80冷冻干燥后即得到所述的纳米微晶纤维素。 10.根据权利要求9所述的制备方法， 其特征在于， 所述纤维素为植物纤维素。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 107875452 A 2 用于骨组织工程的多孔复合支架及其制备方法 技术领域 0001 本发明涉及高分子材料技术领域， 尤其是一种用于骨组织工程的多孔复合支架及 其制备方法。 背景技术 0002 骨是人体的支架， 对人体起着保护和支持作用， 而在运动中起杠杆作用。 骨膜、 骨 质和骨髓是构成骨的三大部分。 但是由于软骨没有血管的特性， 所以很难有自身愈合的能 力， 但是骨缺损是临床上的常。

7、见病， 据统计， 我国每年因疾病、 创伤、 肿瘤等造成的骨缺损病 人超过100万， 大范围骨缺损的修复目前仍是骨科治疗的难题之一， 目前， 治疗骨缺损的方 法有骨移植、 人工骨移植替代材料和组织工程技术等， 另外， 应用骨组织工程技术治疗骨缺 损可以克服自体骨移植供体不足和异体骨移植免疫排斥等缺点。 因此， 利用骨组织工程学 来进行骨修复是治疗骨缺损的热点。 0003 葡聚糖(Dextran， Dex)， 又称右旋糖酐。 为一种多糖。 存在于某些微生物在生长过 程中分泌的粘液中。 葡聚糖具有较高的分子量， 主要由D-葡萄吡喃糖以 ， 16键连接， 支链 点有12、 13、 14连接的。 随着微。

8、生物种类和生长条件的不同， 其结构也有差别。 除此之 外还有 葡聚糖， 具有免疫激活功能， 保护机体健康， 同时在很多骨组织工程再生的研究中， 葡聚糖常作为一种药物载体， 因其具有良好的生物相容性， 能刺激骨基质的生长， 但是由于 其较差的机械性能， 所以限制了再骨组织工程的应用。 0004 纳米微晶纤维素(Nanocrystal Cellulose,CNCs)， 是由天然纤维素或微晶纤维素 通过化学， 物理或者生化的方法制备而得， 纳米微晶纤维素不但具有纳米微粒的相关性质 例如： 较大的比表面、 高强度和高结晶度； 因此具有很强的机械性能， 具有明显的增强效果， 尝尝作为一种增强剂应用于生物。

9、领域， 除此之外还具备了纤维素的基本结构与特性， 例如： 无毒性、 生物相容性和可降解性等特点； 另外， 纳米纤维素一般在复合物当中充当的角色是 补强填料， 以提高复合物的热稳定性及机械性能。 而且， 纳米微晶纤维素中含有丰富的羟 基， 加入复合物中， 能够改善复合物的亲水性能。 0005 近年来， 虽然葡聚糖较差的机械性能限制了其在骨组织工程的应用， 但是由于其 独特的生物学特征， 研究他潜在的价值一直是人们所关注的问题， 然而纳米纤维素近期常 常被研究作为一种很明显的增强剂， 提高基质的亲水性， 热稳定性及机械性能， 但是由于具 有较差的降解性能， 所以单独的纳米纤维也限制了它自身的应用。。

10、 发明内容 0006 基于此， 本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种力学性能优 良、 具有良好的生物相容性、 可以在人体内及时被降解的多孔复合支架。 0007 为实现上述目的， 本发明采取的技术方案为： 一种用于骨组织工程的多孔复合支 架， 所述多孔复合支架的制备原料包含以下重量份的组分： 100份的葡聚糖， 17份的纳米 微晶纤维素和1133份的三偏磷酸钠。 应当说明的是， 当复合支架中纳米微晶纤维素的含 说 明 书 1/6 页 3 CN 107875452 A 3 量为37时， 复合支架的抗压性能较佳， 细胞毒性较小， 生物相容性较好， 可降解性较高； 当复合支架中纳米微晶。

11、纤维素的含量为5时， 复合支架的细胞毒性最小， 生物相容性最 好， 同时抗压性和可降解性较好。 0008 优选地， 所述制备原料的组分中， 所述葡聚糖和纳米微晶纤维素的质量比为1： 0.030.07。 更优选地， 所述葡聚糖和纳米微晶纤维素的质量比为1： 0.05。 当葡聚糖和纳米 微晶纤维素的质量比为1： 0.05时， 支架的力学性能良好， 成孔率高， 孔的大小接近， 同时， 支 架的硬度和弹性模量合适。 0009 优选地， 所述多孔复合支架的孔隙率为9196， 孔径为80223 m。 0010 优选地， 所述纳米微晶纤维素为棒状结构， 所述棒状结构的长度为140360nm， 宽 度为204。

12、0nm。 0011 作为本发明的另一个方面， 本发明还提供了上述多孔复合支架的制备方法， 包括 以下步骤： 0012 (1)将葡聚糖溶于去离子水中加热溶解； 0013 (2)将纳米微晶纤维素加入步骤(1)所得葡聚糖溶液中混合均匀， 先后加入碱溶液 和三偏磷酸钠溶液， 反应完全后迅速冷冻， 随后在-80下冻干， 得到所述的多孔复合支架。 应当说明的是， 制备支架的交联过程发生于过冷环节， 迅速冷冻能终止交联剂的开环过程， 冻干能保证支架获得较为均一的细孔。 0014 优选地， 所述步骤(1)中加热温度为4060。 0015 优选地， 所述步骤(2)中迅速冷冻的温度为-80。 0016 优选地， 。

13、所述纳米微晶纤维素的制备方法包括如下步骤： 将纤维素加入质量浓度 为3570的浓硫酸中， 在3065恒温水浴下磁力搅拌， 反应16h， 然后加入去离子水 以终止反应， 冷却后经超声分散， 之后使用去离子水透析至pH稳定， 经-80冷冻干燥后即 得到所述的纳米微晶纤维素。 通过上述方法制得的纳米微晶纤维素成棒状， 大小在纳米级 别范围内， 同时表面带有磺酸基， 呈负电效果， 可以阻止了纳米微晶纤维素之间的聚集， 易 于分散于良性溶剂中。 0017 优选地， 所述纤维素为植物纤维素。 0018 综上所述， 本发明的有益效果为： 0019 (1)本发明多孔复合支架由葡聚糖和纳米微晶纤维素制得， 纳米。

14、微晶纤维素均匀 分布于支架中， 使得支架力学性能优良， 而且该支架具有良好的生物相容性， 能够支持和促 进髓间充质干细胞的软骨分化； 0020 (2)该复合多孔支架具有孔隙率高(9196)、 孔径均匀(165-223um)的优点， 并 且可以在人体中及时完全降解， 不会长期残留在人体中； 0021 (3)本发明将葡聚糖、 纳米微晶纤维素通过多糖交联以及冷冻干燥的方法， 形成葡 聚糖/纳米微晶纤维素多孔支架， 制备工艺简单、 材料来源广泛， 生产效率高， 成本低， 可应 用于工业化大生产。 附图说明 0022 图1为纳米微晶纤维素的透射电子显微镜图； 0023 图2中A、 B、 C、 D分别是C。

15、NCs的质量百分含量为1、 3、 5、 7的多孔复合支架的 说 明 书 2/6 页 4 CN 107875452 A 4 200倍扫描电镜图； 0024 图3是CNCs的质量百分含量为5的多孔复合支架的500倍扫描电镜图； 0025 图4为不同多孔复合支架的压缩模量图； 0026 图5为在多孔复合支架上培养的细胞在450nm的吸光值； 0027 图6为细胞在多孔复合支架材料上生长3天时的扫描电镜图。 具体实施方式 0028 为更好的说明本发明的目的、 技术方案和优点， 下面将结合附图和具体实施例对 本发明作进一步说明。 0029 实施例1 0030 本发明的用于骨组织工程的多孔复合支架的一种实。

16、施例， 其制备原料包含以下重 量份的组分： 100份的葡聚糖， 7份的纳米微晶纤维素和11份的三偏磷酸钠。 多孔复合支架的 孔隙率为91， 孔径为80223 m。 其中， 纳米微晶纤维素为棒状结构， 所述棒状结构的长度 为140360nm， 宽度为2040nm。 0031 上述多孔复合支架的制备方法包括以下具体步骤： 0032 称取5g棉花纤维素加入到42ml 70(质量浓度)的浓硫酸中， 在30的恒温水浴 中， 机械搅拌， 反应6小时， 加入大量蒸馏水终止反应， 超声分散后加入去离子水透析3天后， 在-20下冷冻过夜， 然后放入冻干机中， -80冻干48小时即制得纳米微晶纤维素； 0033 。

17、再将2.7g葡聚糖溶于27ml去离子水中， 置于40水浴加热磁力搅拌溶解， 称189mg 纳米微晶纤维素加到葡聚糖溶液中混合搅匀， 滴加1ml 10mol/L的NaOH溶液， 再加入1ml 0.3g/ml的三偏磷酸钠溶液,反应20分钟后迅速置于-80下冷冻， 随后-80下冻干， 7纳 米微晶纤维素增强的葡聚糖/纳米微晶纤维素多孔复合支架。 0034 实施例2 0035 本发明的用于骨组织工程的多孔复合支架的一种实施例， 其制备原料包含以下重 量份的组分： 100份的葡聚糖， 5份的纳米微晶纤维素和22份的三偏磷酸钠。 多孔复合支架的 孔隙率为93， 孔径为80223 m。 其中， 纳米微晶纤维。

18、素为棒状结构， 所述棒状结构的长度 为140360nm， 宽度为2040nm。 0036 上述多孔复合支架的制备方法包括以下具体步骤： 0037 称取5g棉花纤维素加入到45ml 65(质量浓度)的浓硫酸中， 在42的恒温水浴 中， 机械搅拌， 反应3小时， 加入大量蒸馏水终止反应， 超声分散后加入去离子水透析3天后， 在-20下冷冻过夜， 然后放入冻干机中， -80冻干48小时即制得纳米微晶纤维素； 0038 再将2.7g葡聚糖溶于27ml去离子水中， 置于50水浴加热磁力搅拌溶解， 称135mg 纳米微晶纤维素加到葡聚糖溶液中混合搅匀， 滴加1ml 10mol/L的NaOH溶液， 再加入2。

19、ml 0.3g/ml的三偏磷酸钠溶液,反应20分钟后迅速置于-80下冷冻， 随后-80下冻干， 得到 wt5纳米微晶纤维素增强的葡聚糖/纳米微晶纤维素多孔复合支架。 0039 实施例3 0040 本发明的用于骨组织工程的多孔复合支架的一种实施例， 其制备原料包含以下重 量份的组分： 100份的葡聚糖， 3份的纳米微晶纤维素和33份的三偏磷酸钠。 多孔复合支架的 孔隙率为95， 孔径为80223 m。 其中， 纳米微晶纤维素为棒状结构， 所述棒状结构的长度 说 明 书 3/6 页 5 CN 107875452 A 5 为140360nm， 宽度为2040nm。 0041 上述多孔复合支架的制备方。

20、法包括以下具体步骤： 0042 3纳米微晶纤维素增强的葡聚糖/纳米微晶纤维素多孔复合支架的制备步骤： 称 取5g棉花纤维素加入到53ml 55(质量浓度)的浓硫酸中， 在50的恒温水浴中， 机械搅 拌， 反应5小时， 加入大量蒸馏水终止反应， 超声分散后加入去离子水透析3天后， 在-20下 冷冻过夜， 然后放入冻干机中， -80冻干48小时即制得纳米微晶纤维素； 0043 再将2.7g葡聚糖溶于27ml去离子水中， 置于50水浴加热磁力搅拌溶解， 称81mg 纳米微晶纤维素加到葡聚糖溶液中混合搅匀， 滴加1ml 10mol/L的NaOH溶液， 再加入3ml 0.3g/ml的三偏磷酸钠溶液,反应。

21、20分钟后迅速置于-80下冷冻， 随后-80下冻干， 得到 3纳米微晶纤维素增强的葡聚糖/纳米微晶纤维素多孔复合支架。 0044 实施例4 0045 本发明的用于骨组织工程的多孔复合支架的一种实施例， 其制备原料包含以下重 量份的组分： 100份的葡聚糖， 1份的纳米微晶纤维素和11份的三偏磷酸钠。 多孔复合支架的 孔隙率为96， 孔径为80223 m。 其中， 纳米微晶纤维素为棒状结构， 所述棒状结构的长度 为140360nm， 宽度为2040nm。 0046 上述多孔复合支架的制备方法包括以下具体步骤： 0047 1纳米微晶纤维素增强的葡聚糖/纳米微晶纤维素多孔复合支架的制备步骤： 称 取。

22、5g棉花纤维素加入到84ml35(质量浓度)的浓硫酸中， 在65的恒温水浴中， 机械搅拌， 反应1小时， 加入大量蒸馏水终止反应， 超声分散后加入去离子水透析3天后， 在-20下冷 冻过夜， 然后放入冻干机中， -80冻干48小时即制得纳米微晶纤维素； 0048 再将2.7g葡聚糖溶于27ml去离子水中， 置于60水浴加热磁力搅拌溶解， 称27mg 纳米微晶纤维素加到葡聚糖溶液中混合搅匀， 滴加1ml 10mol/L的NaOH溶液， 再加入1ml 0.3g/ml的三偏磷酸钠溶液,反应20分钟后迅速置于-80下冷冻， 随后-80下冻干， 得到 1纳米微晶纤维素增强的葡聚糖/纳米微晶纤维素多孔复合。

23、支架。 0049 实施例5本发明的多孔复合支架的性能测试 0050 (1)本发明的多孔复合支架的抗压性能测试 0051 测试对象： 实施例14的wt1、 3、 5、 7CNCs增强的葡聚糖/纳米微晶纤维素 支架； 0052 测试方法： 一定表面积干态支架室温下在压力测试仪器Instron 4505下以2mm/ min下压速度获得不同样品的抗压性能参数； 0053 测试结果： 0054 如图4所示， 通过上述实施例中的方法分别制备出1、 3、 5、 7CNCs增强的葡 聚糖/纳米微晶纤维素支架， 从图中可以明显的看出， 随着CNCs的含量增加， 支架的抗压模 量增强， 说明CNCs明显的改善了葡。

24、聚糖力学性能弱的缺点。 0055 (2)本发明的多孔复合支架的吸光度 0056 测试对象： 实施例14的wt1、 3、 5、 7CNCs增强的葡聚糖/纳米微晶纤维素 支架； 0057 测试方法： 多孔支架进行紫外灭菌后， 放入96孔培养板中。 用0.25胰酶/PBS溶液 将ATDC5细胞从培养盘消化、 离心条件为： 5min， 1500rpm、 去除上清夜后， 加入浓度为10的 说 明 书 4/6 页 6 CN 107875452 A 6 胎牛血清的新鲜 -MEM培养基， 将细胞悬液浓度调节为2.5106/mL。 然后将10 L细胞悬液 加入多孔支架中， 孵化2h后， 每孔加入100 L培养基。

25、， 在37培养箱中培养至所需时间。 隔天 换液， 以保持细胞的营养供应。 0058 在96孔板中， 每孔加入100 L MTT溶液， 置于37oC培养箱中继续孵育4h。 用镊子取 出上面所得到复合支架放入到2mL离心管中， 加入1mL DMSO， 吹打至结晶物完全溶解。 吸取 200 L加入酶标板中， 在酶标仪(Bio-Rad 550)上测定570nm的吸光度。 0059 测试结果： 0060 在细胞毒性实验中， 如图5所示， 由吸光度的高低可以反映细胞的增殖速度， 1、 3、 5、 7CNCs的复合支架都具有较好的细胞相容性， 但是5CNCs含量的支架中细胞增 殖速度较为明显， 表明过高的C。

26、NCs含量(7CNCs)不适于细胞的生长。 0061 (3)本发明的多孔复合支架的生物相容性 0062 测试对象： 实施例14的wt1、 3、 5、 7CNCs增强的葡聚糖/纳米微晶纤维素 支架； 0063 测试方法： 上述ATDC5细胞传代后种植在不同组分CNCs的支架中， 37。 5CO2环 境培养箱中培养3天， 后用PBS缓冲液冲洗3遍， 再用2.5戊二醛固定液固定2h， 再依次用 30,50,70,80,90and 100乙醇脱水处理， 每次10分钟， 后再超临界CO2干燥， 用 扫描电子显微镜观察。 0064 测试结果： 0065 如图6所示， 扫描电镜下清楚的可以看出细胞在支架上的。

27、生长， 粘附， 增殖， 以及细 胞之间的相互作用， 图A(1CNCs含量的支架)中细胞存活较少， 可能力学强度不足， 培养基 接触过久后不能保持原有的形状， 孔隙率下降， 通透性降低， 图D(7CNCs含量的支架)中细 胞存留较少， 可能较高的CNCs纳米粒子既降低了成孔率， 又扩大了CNCs的毒性协同效应阻 碍了细胞的增殖， 图B(3CNCs含量的支架)、 C(5CNCs含量的支架)中细胞存活的细胞较 多， C更为明显， 这反应的结果和图5一致。 0066 (4)本发明的多孔复合支架的降解性能 0067 测试对象： 实施例14的wt1、 3、 5、 7CNCs增强的葡聚糖/纳米微晶纤维素 复。

28、合支架； 0068 测试方法： 称取一定质量的复合支架置于带有胰蛋白酶的缓冲液中(样品： PBS： 胰 酶10mg:2ml:100 L， pH7.4)， 37摄氏度下动态培养1、 3、 5、 7、 10、 14、 21天， 每隔一天半量 更换新液， 每组做3个平行试样。 0069 测试结果： 几种支架大体上能缓慢降解， 但是随着CNCs含量的增加(例如7)， 残 留支架质量更多， 所以CNCs的量需要控制在一个范围内(比如17)， 能更好的降低它带 来的负面效应。 0070 通过综合上述实施例以及对比实施例分析表明， wt5浓度CNCs的复合支架表现 出最优的生物相容性， 其机械性能也较好， 。

29、并且在人体中可以及时降解， 不会长期残留病人 体内， 适合作为骨质支架材料。 0071 最后所应当说明的是， 以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保 护范围的限制， 尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明， 本领域的普通技术人员应当 理解， 可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换， 而不脱离本发明技术方案的实质 说 明 书 5/6 页 7 CN 107875452 A 7 和范围。 说 明 书 6/6 页 8 CN 107875452 A 8 图1 图2 说 明 书 附 图 1/5 页 9 CN 107875452 A 9 图3 说 明 书 附 图 2/5 页 10 CN 107875452 A 10 图4 说 明 书 附 图 3/5 页 11 CN 107875452 A 11 图5 说 明 书 附 图 4/5 页 12 CN 107875452 A 12 图6 说 明 书 附 图 5/5 页 13 CN 107875452 A 13 。