一种全生物化组织工程血管的构建方法.pdf

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1、(10)授权公告号 CN 102872478 B (45)授权公告日 2014.11.26 CN 102872478 B (21)申请号 201210401734.1 (22)申请日 2012.10.19 A61L 27/36(2006.01) (73)专利权人 陕西正凡科技发展有限公司 地址 710075 陕西省西安市高新技术产业开 发区科技二路 67 号 (72)发明人 张丽 刘毅 张健 康生 胡铸洪 (74)专利代理机构 西安通大专利代理有限责任 公司 61200 代理人 徐文权 CN 102127507 A,2011.07.20, 说明书第 2-4 页， 附图 1-3. WO 2005。

2、/003317 A2,2005.01.13, 全文 . CN 101318032 A,2008.12.10, 全文 . 李宏， 等 . 利用成体干细胞体外小口径血 管的构建 .华东理工大学学报 ( 自然科学 版 ) .2009, 第 35 卷 ( 第 6 期 ), 第 936-941 页 . (54) 发明名称 一种全生物化组织工程血管的构建方法 (57) 摘要 本发明公开了一种全生物化组织工程血管的 构建方法， 其特征在于， 以羊颈动脉为材料， 制备 脱细胞血管基质 ； 以内皮祖细胞、 平滑肌祖细胞 和脂肪干细胞分别作为构建血管内膜、 中膜和外 膜的种子细胞 ； 以生物反应器实现血管构建中的。

3、 壁切应力、 环状张力和轴向拉伸力的动态过程。 该 方法采用优化的血管基质和种子细胞来源， 经过 构建过程中的标准化 3-D 受力和动态调控， 构建 出血管结构、 力学特性和生物学活动都接近天然 血管的组织工程血管。使其具备工业化生产和临 床应用潜力， 将为组织工程血管进入市场奠定基 础。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 赵莉 权利要求书 1 页 说明书 6 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书1页 说明书6页 附图1页 (10)授权公告号 CN 102872478 B CN 102872478 B 1/1 页 2 1. 一种全。

4、生物化组织工程血管的构建方法， 其特征在于， 以羊颈动脉为材料， 制备脱细 胞血管基质 ； 以内皮祖细胞、 平滑肌祖细胞和脂肪干细胞分别作为构建血管内膜、 中膜和外 膜的种子细胞 ； 以生物反应器实现血管构建中的壁切应力、 环状张力和轴向拉伸力的动态 过程 ； 具体按照以下步骤进行 ： (1) 血管支架的制备 将新鲜成年山羊颈动脉， 置于 4含青霉素和链霉素各 180mg/L 的无菌 PBS 液中 ； 去除 血液杂质和附属结缔组织、 脂肪成分以及血管外膜 ； 截取长度为2030mm的动脉作为制备 血管支架的材料， 并进行脱细胞处理 ； (2) 种子细胞的分离培养 内皮祖细胞 ： 取患者全骨髓 。

5、2ml， 以 100U/ml 的肝素溶液冲洗， 密度为 1.020g/ml 的 Percoll 单核细胞分离液上层， 2500rpm 离心 25min， 吸除最上层段液体， 吸取单核细胞层 ； 用无血清培养基洗涤 2 次， 以 DMEM/F12 为基础培养基， 添加终浓度为 10ng/ml 的表皮生长 因子和血管内皮生长因子， 调节细胞终浓度为 5105/ml， 接种到预铺有纤连蛋白的培养 皿， 37、 5 CO2培养箱中进行培养 ； 待可见瓶底细胞呈铺路石状生长， 经传代 3 次后可得 到单纯的内皮祖细胞 ； 平滑肌祖细胞 ： 构建以血管平滑肌细胞特异性序列 SM22 启动的 EGFP 报告。

6、基因系 统， 转染培养的患者骨髓基质细胞， 72h 后消化为单细胞悬液， 上机通过流式活细胞分选的 方法分离出 GFP 阳性细胞， 即为 SPCs ； 以含 20小牛血清的 DMEM 培养液 37， 5 CO2条件 下培养， 7 9d 待细胞融合至 80以上时传代 ； 脂肪干细胞 ： 吸取患者皮下脂肪组织 ； 清洗取出血液、 血管 ； 37下， 使用体积浓度 为 0.25胰蛋白酶消化 30min ； 加入同体积含体积浓度 10 FBS 的 DMEM 培养液， 中和消化 液 ； 1200rpm 离心 10min， 红细胞裂解液消化红细胞 ； 100 目滤器过滤， 离心去除残渣 ； 接种 于预铺小。

7、牛血清的培养瓶中， 以含体积浓度 10 FBS 的 DMEM/F12 培养液培养， 1 周细胞能 够融合 ； (3) 血管构建过程中的反应 将脱细胞血管基质安装入反应腔 ； 种子细胞与相应的培养液混合， 调整细胞密度为 1107/ml， 分别加入到对应的培养罐 ； 接通混合气体， 进气压力为0.01MPa ； 开启蠕动泵， 双 路液体按顺时针方向在系统内循环 ； 首先， 在内外腔均加载构建中膜的种子细胞 SPCs， 培 养液为含25ng/mlPDGF-BB、 体积浓度5FBS的DMEM培养基， 反应28d ； 然后， 外腔种子细胞 替换为 ADSCs， 培养液为体积浓度 10 FBS 的 DM。

8、EM/F12， 并添加 bFGF25ng/ml， 内腔细胞仍 为 SPCs， 反应 7 天 ； 最后， 更换内腔种子细胞为 EPCs， 培养液为体积浓度 10 FBS 的 DMEM/ F12， 含有终浓度各为 10ng/ml 的 bFGF 和 VEGF， 反应 7 天 ； 每隔 5 天或指示剂显示 pH 值在 7.2 7.4 范围外时， 暂停系统， 离心收集细胞后更换培养液。 权 利 要 求 书 CN 102872478 B 2 1/6 页 3 一种全生物化组织工程血管的构建方法 技术领域 0001 本发明属于生物组织工程技术领域， 提供一种全部以生物和自体细胞为原料的组 织工程血管构建方案，。

9、 该组织工程血管具有与天然血管接近的血管结构、 力学特性和生物 学活性， 用于冠状动脉搭桥、 桡动 - 静脉短路、 深静脉置换等需要血管移植手术， 作为天然 血管的替代物。 背景技术 0002 每年全世界开展的冠脉搭桥和血管旁路手术超过 500 万例， 需要大量的血管移植 材料。目前主要采用自体血管移植， 但有些患者本身可供移植的血管已经使用或发生病理 改变， 就只能使用人工材料替代血管， 而人工血管又有弹性差、 通畅率低等弊端， 解决移植 物来源矛盾最终要依靠组织工程血管。从全球第一条组织工程血管诞生到现在的 20 多年 里， 血管构建技术都取得了很大进步， 但直到现在仍然没有开发出一个能达。

10、到临床应用要 求的组织工程血管。现将当前组织工程血管相关技术介绍如下 ： 0003 （1） 支架材料 0004 天然支架材料来源于生物体， 一般是由生物体内提取的胶原经过化学和热处理， 再经过交联制备而成， 具有良好的种子细胞相容性， 能为细胞粘附、 增殖和成熟提供近似于 体内正常血管组织细胞间的基质条件， 但它的力学强度无法天然血管相比， 并且胶原的微 观结构与血管组织有很大区别。 人工合成材料可以大规模批量生产， 来源丰富， 具有很好的 可塑性， 无免疫圆形， 还可以精准地控制其形态、 尺寸、 孔径大小和力学强度等特性， 但其细 胞相容性难以达到天然血管水平， 很大程度上限制了后续的细胞化。

11、过程。 0005 （2） 种子细胞 0006 目前组织工程血管的种子细胞仍以单一来源的成熟细胞或干细胞为主， 还没有理 想的种子细胞出现。 以成熟的血管壁平滑肌细胞作为种子细胞， 其具有收缩性、 调节细胞外 基质分泌和提供生物力学稳定的作用， 但成熟血管壁细胞的获取会造成新的损伤， 而且扩 增能力有限， 多次传代后性状会发生改变， 不能实现组织工程血管的量产。 因此近年来又出 现了以干细胞作为种子细胞的尝试， 最多被研究的有从骨髓中分离的成体干细胞， 它具有 很强的增殖能力和定向分化能力， 可以从自身的骨髓获得进行培养扩增， 多次传代后表型 不会发生改变。 胚胎干细胞可以分化成血管平滑肌细胞和。

12、内皮细胞， 是理想的种子细胞， 但 诱导其定向分化的技术还不成熟， 获取和培养的过程负责， 而且还会牵扯伦理道德方面的 问题。 0007 （3） 构建环境 0008 组织工程血管的培养必须在生物反应器中动态进行， 目的是为组织工程血管提供 稳定的、 与生物体内相似的生长环境， 这是构建人工血管成败的关键因素。培养环境中， 化 学因素条件就是组织工程血管生长必须的营养、 pH 值、 氧气、 代谢产物等条件， 这些在目前 技术条件下都可以解决。物理因素就是组织工程血管构建过程中的力学环境， 当前技术只 考虑了两种力学刺激 ： 一种是沿血管周径分布的由血流压力形成的环状张力， 另一种是平 说 明 书。

13、 CN 102872478 B 3 2/6 页 4 行于血管长轴的血流对血管内表面造成的剪切力。 而另一种血管应力由心脏搏动产生 的对动脉血管的轴向拉伸力却被忽视， 这是可能是导致目前组织工程血管难以临床应用的 重要原因。 而且， 血管构建过程中的力学环境是一个动态过程， 目前还没有对这个动态过程 进行标准化的研究。 0009 综上所述， 在现有的血管构建技术下， 没有一条具有量产和临床应用潜力的组织 工程血管出现， 究其原因， 一是在体外反应过程中难以模拟复杂的血管受力环境， 因此所构 建的工程血管在结构和强度上都无法比肩天然血管 ； 二是采集构建血管的种子细胞受到技 术上和伦理学的诸多限制。

14、。 发明内容 0010 本发明的目的在于克服上述现有技术的缺点， 提供一种全生物化组织工程血管的 构建方法， 该方法采用优化的血管基质和种子细胞来源， 经过构建过程中的标准化 3-D 受 力和动态调控， 构建出血管结构、 力学特性和生物学活动都接近天然血管的组织工程血管。 使其具备工业化生产和临床应用潜力， 将为组织工程血管进入市场奠定基础。 0011 本发明的目的是通过以下技术方案来解决的 ： 0012 这种全生物化组织工程血管的构建方法是以羊颈动脉为材料， 制备脱细胞血管基 质 ； 以内皮祖细胞、 平滑肌祖细胞和脂肪干细胞分别作为构建血管内膜、 中膜和外膜的种子 细胞 ； 以生物反应器实现。

15、血管构建中的壁切应力、 环状张力和轴向拉伸力的动态过程。 0013 进一步， 上述构件方法具体按照以下步骤进行 ： 0014 （1） 血管支架的制备 0015 将新鲜成年山羊颈动脉， 置于 4含青霉素和链霉素各 180mg/L 的无菌 PBS 液中 ； 去除血液杂质和附属结缔组织、 脂肪成分以及血管外膜 ； 截取长度为2030mm的动脉作为 制备血管支架的材料， 并进行脱细胞处理 ； 0016 （2） 种子细胞的分离培养 0017 内皮祖细胞 ： 取患者全骨髓 2ml， 以 100U/ml 的肝素溶液冲洗， 密度为 1.020g/ ml的Percoll单核细胞分离液上层， 2500rpm离心2。

16、5min， 吸除最上层段液体， 吸取单核细胞 层 ； 用无血清培养基洗涤2次， 以DMEM/F12为基础培养基， 添加终浓度为10ng/ml的表皮生 长因子和血管内皮生长因子， 调节细胞终浓度为 5105/ml， 接种到预铺有纤连蛋白的培养 皿， 37、 5%CO2培养箱中进行培养 ； 待可见瓶底细胞呈铺路石状生长， 经传代 3 次后可得到 单纯的内皮祖细胞 ； 0018 平滑肌祖细胞 ： 构建以血管平滑肌细胞特异性序列 SM22 启动的 EGFP 报告基 因系统， 转染培养的患者骨髓基质细胞， 72h 后消化为单细胞悬液， 上机通过流式活细胞分 选的方法分离出 GFP 阳性细胞， 即为 SP。

17、Cs ； 以含 20% 小牛血清的 DMEM 培养液 37， 5%CO2条 件下培养， 7 9d 待细胞融合至 80% 以上时传代 ； 0019 脂肪干细胞 ： 吸取患者皮下脂肪组织 ； 清洗取出血液、 血管 ； 37下， 使用体积 浓度为 0.25% 胰蛋白酶消化 30min ； 加入同体积含体积浓度为 10%FBS 的 DMEM 培养液， 中和 消化液 ； 1200rpm 离心 10min， 红细胞裂解液消化红细胞 ； 100 目滤器过滤， 离心去除残渣 ； 接种于预铺小牛血清的培养瓶中， 以含体积浓度 10%FBS 的 DMEM/F12 培养液培养， 1 周左右 细胞能够融合 ； 说 明。

18、 书 CN 102872478 B 4 3/6 页 5 0020 （3） 血管构建过程中的反应 0021 将脱细胞血管基质安装入反应腔 ； 种子细胞与相应的培养液混合， 调整细胞密 度为 1107/ml， 分别加入到对应的培养罐 ； 接通混合气体， 进气压力为 0.01MPa ； 开启蠕 动泵， 双路液体按顺时针方向在系统内循环 ； 首先， 在内外腔均加载构建中膜的种子细胞 SPCs， 培养液为含 25ng/ml PDGF-BB、 体积浓度 5%FBS 的 DMEM 培养基， 反应 28d ； 然后， 外腔 种子细胞替换为 ADSCs， 培养液为体积浓度 10%FBS 的 DMEM/F12， 。

19、并添加 bFGF25ng/ml， 内腔 细胞仍为 SPCs， 反应 7 天 ； 最后， 更换内腔种子细胞为 EPCs， 培养液为体积浓度 10%FBS 的 DMEM/F12， 含有终浓度各为 10ng/ml 的 bFGF 和 VEGF， 反应 7 天 ； 每隔 5 天或指示剂显示 pH 值在 7.2 7.4 范围外时， 暂停系统， 离心收集细胞后更换培养液。 0022 进一步的， 上述步骤 （1） 中进行脱细胞处理的具体步骤为 ： 0023 反复冻融 ： 将材料分别置于 4预冷、 -80冷冻 2h、 37水浴复温 15min， 上述 冻融过程反复进行 3 次 ； 0024 超高压处理 ： 将材。

20、料以无菌 D-Hank s 液反复冲洗干净后， 密封入塑料袋， 袋中 浸满 D-Hank S 液， 置入超高压舱中， 500MPa、 4条件下处理 20min， 处理结束后无菌条件下 将内层特制塑料袋中的血管取出 ； 0025 化学方法脱细胞处理 ： 将上述步骤处理过的血管在 SDS 中以 37振摇， 100rpm， 12h ； 然后使用 PBS 液振摇漂洗 48h， 彻底去除残留 SDS ； 0026 脱细胞血管基质的冻干及消毒 ： 在 -80低温冰箱中速冻 24h， 再置入 -70、 6.6710-4KPa 的冷冻干燥机内 6h 冷冻干燥， 用包装袋密闭分装后， 60Co 辐照消毒。 00。

21、27 本发明具有以下有益效果 ： 0028 （1） 组织工程血管的结构观察 0029 按照发明内容中描述的方法进行脱细胞血管基质支架制备， 并在上述反应条件 下， 以种子细胞， 经过血管平滑肌层构建、 内皮细胞覆盖和脂肪干细胞的外膜包裹过程， 全 生物化的组织工程血管构建完成。大体上观察， 脱细胞血管基质基本保持管状结构 ； HE 染 色显示胶原纤维和弹性纤维保持天然形态 ； Masson 染色显示血管基质管壁胶原纤维成分 连续性保存良好。构建的组织工程血管内表面光滑， 管腔直径较支架略小， 血管弹性良好 ； HE 染色可见大量核蓝染的细胞存在， 红色胶原纤维平行排列 ； Masson 染色显。

22、示胶原纤维呈 蓝色， 肌纤维呈红色， 细胞核呈蓝褐色。上述大体和组织学观察表明， 本发明构建的组织工 程血管在外观和结构上与天然血管基本相似。 0030 （3） 组织工程血管的力学强度检测 0031 对构建完成组织工程血管立即进行力学强度检测， 在生物力学测试机上进行应变 率的测定， 并将其与天然血管和高分子材料血管进行应力 （Strain） - 应变 （Stress） 曲线的 比较， 结果表明组织工程血管的应变远接近天然血管， 而高分子材料血管应变率最低， 说明 构建的组织工程血管顺应性正。爆破压测定表明， 构建的血管最大爆破压达到天然血管的 88.7%， 因此力学强度可以达到要求 ； 尼龙。

23、血管爆破压远高于天然血管， 说明高分子材料在 力学强度上优势较大。 0032 （4） 组织工程血管的生物学活性检测 0033 构建的组织工程血管放在血环环实验平台， 加入终浓度为 10mol/L 的乙酰胆碱 （Ach） ， 组织工程血管立即表现出持续舒张反应， 舒张率为 46.4%， 天然血管为 54.2% ； 在加 说 明 书 CN 102872478 B 5 4/6 页 6 入终浓度为 10mol/L 的苯肾上腺素 （PE） 后， 组织工程血管呈现出持续收缩反应， 舒张率 为 66.4%， 天然血管为 74.1%。检测说明， 构建的组织工程血管具有血管内皮层和平滑肌层， 呈现出一定的生物学。

24、活性， 已经非常接近天然血管。 0034 （5） 组织工程血管的移植和效果观察 0035 将构建的组织工程血管移植替换新西兰家兔的腹主动脉， 进行移植效果观察。动 物按无菌原则及非接触技术横断肾下腹主动脉， 剪下一段腹主动脉长约 2.0cm， 再将构建好 的组织工程血管以 8/0 聚丙烯线间断外翻吻合到腹主动脉上。血管移植后每个月进行彩色 多普勒检查， 血管替换出血流通畅， 未出现狭窄情况。移植术后 3 个月行数字减影血管造 影， 证实血管通畅情况。 随后麻醉取出移植段标本， 进行大体观察， 未发现明显炎症反应， 说 明构建的组织工程血管具有良好的生物相容性， 未出席免疫排斥。 0036 综上。

25、所述， 本发明这种全生物化的组织工程血管构建方法， 具备工业化生产和临 床应用潜力， 将为组织工程血管进入市场奠定基础， 具有重要的社会和经济价值。 附图说明 0037 图 1 为本发明的组织工程血管反应装置的结构图 ； 0038 图 2 为本发明构建的组织工程血管横截面和血管壁剖面结构图。 具体实施方式 0039 本发明的全生物化组织工程血管的构建方法是 ： 以羊颈动脉为材料， 制备脱细胞 血管基质 ； 以内皮祖细胞 （EPCs） 、 平滑肌祖细胞 （SPCs） 和脂肪干细胞 （ADSCs） 分别作为构 建血管内膜、 中膜和外膜的种子细胞 ； 以生物反应器实现血管构建中的壁切应力、 环状张力。

26、 和轴向拉伸力的的动态过程。 0040 下面结合附图对本发明做进一步详细描述 ： 0041 图 1 是用于实现本发明构建方法的装置， 图中所有反应装置均为市售设备， 按照 图 1 的连接方法进行组合。旋转反应器是血管反应的场所， 内腔、 外腔分别按照反应方案的 要求通过含有种子细胞的培养液。 步进电机提供脉动源， 产生血管的环状张力 ； 蠕动泵分别 驱动内腔和外腔的培养液流动， 产生血管的壁剪切力 ； 旋转反应器内置的线性致动器沿血 管长轴伸缩， 产生轴向拉伸力。以 Powerlab 系统进行全过程的监控。基于该装置， 本发明 的全生物化组织工程血管的构建方法的详细工艺步骤如下 ： 0042 。

27、（1） 血管支架的制备 0043 新鲜成年山羊颈动脉， 置于4含青霉素和链霉素各180mg/L的无菌PBS液中。 去 除血液杂质和附属结缔组织、 脂肪成分以及大部分血管外膜。截取长度为 20 30mm、 无明 显分支、 内径约 5mm 的动脉作为制备血管支架的材料， 按以下步骤进行脱细胞处理 ： 0044 反复冻融 ： 将材料分别置于 4预冷、 -80冷冻 2h、 37水浴复温 15min， 上述 冻融过程反复进行 3 次 ； 0045 超高压处理 ： 将材料以无菌 D-Hank s 液反复冲洗干净后， 密封入特制塑料袋， 袋中浸满 D-Hank S 液， 置入超高压舱中， 500MPa、 4。

28、条件下处理 20min， 处理结束后无菌条 件下将内层特制塑料袋中的血管取出 ； 0046 化学方法脱细胞处理 ： 将经上述步骤处理的血管在 0.125 SDS 中 37振摇， 说 明 书 CN 102872478 B 6 5/6 页 7 100rpm， 12h， 使用 PBS 液振摇漂洗 48h， 彻底去除残留 SDS ； 0047 脱细胞血管基质的冻干及消毒 ： 在 -80低温冰箱中速冻 24h， 再置入 -70、 6.6710-4KPa 的冷冻干燥机内 6h 冷冻干燥， 用包装袋密闭分装后， 60Co 辐照消毒。 0048 （2） 种子细胞的分离培养 0049 内皮祖细胞 ： 取患者全骨。

29、髓 2ml， 以 10ml 肝素溶液 （100U/ml） 冲洗， Percoll 单 核细胞分离液 （密度 1.020g/ml） 上层， 2500rpm 离心 25min， 吸除最上层段液体 （含有血小板 和血浆） ， 吸取单核细胞层 ； 用无血清培养基洗涤 2 次， 以 DMEM/F12 为基础培养基， 添加终 浓度为 10ng/ml 的表皮生长因子 （bFGF） 和血管内皮生长因子 （VEGF） ， 调节细胞终浓度为 5105/ml， 接种到预铺有纤连蛋白的培养皿， 37、 5%CO2培养箱中进行培养 ； 约 9d 可见瓶 底细胞呈铺路石状生长， 经传代 3 次后可得到较为单纯的内皮祖细胞。

30、。 0050 平滑肌祖细胞 ： 构建以血管平滑肌细胞特异性序列 SM22 启动的 EGFP 报告基 因系统， 转染培养的患者骨髓基质细胞 （贴壁的骨髓单核细胞） ， 72h 后消化为单细胞悬液， 上机通过流式活细胞分选的方法分离出 GFP 阳性细胞， 即为 SPCs。以含 20% 小牛血清的 DMEM 培养液 37， 5%CO2条件下培养， 7 9d 待细胞融合至 80% 以上时传代。 0051 脂肪干细胞 ： 吸取患者皮下脂肪组织 ； 清洗取出血液、 血管 ； 37下， 使用体积 浓度为 0.25% 胰蛋白酶消化 30min ； 加入同体积含体积浓度为 10%FBS 的 DMEM 培养液， 。

31、中和 消化液 ； 1200rpm 离心 10min， 红细胞裂解液消化红细胞 ； 100 目滤器过滤， 离心去除残渣 ； 接种于预铺小牛血清的培养瓶中， 以含体积浓度 10%FBS 的 DMEM/F12 培养液培养， 1 周左右 细胞可融合。 0052 （3） 血管构建过程中的反应方案 0053 组织工程血管反应器为市售设备的组合， 其基本组成如图1。 将脱细胞血管基质安 装入反应腔 ； 种子细胞与相应的培养液混合， 调整细胞密度为 1107/ml， 分别加入到对应 的培养罐 ； 接通混合气体， 进气压力为 0.01MPa。开启蠕动泵， 双路液体按顺时针方向在系 统内循环。首先， 在内外腔均加。

32、载构建中膜的种子细胞 SPCs， 培养液为含 25ng/mlPDGF-BB、 体积浓度 5%FBS 的 DMEM 培养基， 反应 28d ； 然后， 外腔种子细胞替换为 ADSCs， 培养液为体 积浓度 10%FBS 的 DMEM/F12， 并添加 bFGF25ng/ml， 内腔细胞仍为 SPCs， 反应 7d ； 最后， 更换 内腔种子细胞为 EPCs， 培养液为体积浓度 10%FBS 的 DMEM/F12， 含有终浓度各为 10ng/ml 的 bFGF 和 VEGF， 反应 7d。每隔 5d 或指示剂显示 pH 值在 7.2 7.4 范围外时， 暂停系统， 离心 收集细胞后更换培养液。具体。

33、的反应流程见表 1 ： 0054 表 1. 组织工程血管构建过程中采取的反应方案 0055 说 明 书 CN 102872478 B 7 6/6 页 8 0056 总计反应时间为 42d， 构建过程中的程序和参数如此表。其中， SPCs 为血管平滑 肌祖细胞 ； EPCs 为内皮祖细胞 ； ADSCs 为脂肪干细胞 ； 表示血管反应器转速 （rpm） ； F 表示外 腔液体流 （L/min） ； mean 表示平均血管壁切应力 （dyne/cm2） ； Pmean 表示血管环状张力 （mmHg） ； z 表示轴向拉伸长度。 0057 本发明构建的组织工程血管横截面和血管壁剖面结构图如图 2 所示 ： 构建的组织 工程血管具有与天然血管相似的三层结构。血管支架材料为羊颈动脉脱细胞血管基质， 内 膜 1 的种子细胞为内皮祖细胞， 中膜 2 的种子细胞为血管平滑肌祖细胞， 外膜 3 的种子细胞 为脂肪干细胞。 说 明 书 CN 102872478 B 8 1/1 页 9 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 102872478 B 9 。