技术领域
本发明涉及生物领域，具体而言，涉及一种生物种植体以及在基体上制备活性因子的方法。
背景技术
现有的生物种植体多为单一材料制成，例如钛合金等，这些材料具有良好的生物相容性，但难以具有其他的特性，例如促进骨生长等。
若想要生物种植体具有这些特性，则需要对种植体进行表面改性，加入具有这些效果的成分。但现有技术中的表面改性方法会破坏种植体的原结构，否则改性效果不够持久稳定。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种生物种植体以及在基体上制备活性因子的方法，以解决现有技术中的难以使种植体具有活性因子的问题。
为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种生物种植体，包括基体和活性因子，活性因子通过黏合剂黏附在基体上，黏合剂包括聚多巴胺。
进一步地，活性因子包括用于促进成骨的脂联素。
进一步地，基体具有用于促进骨质长入的微孔结构。
根据本发明的另一方面，提供了一种在基体上制备活性因子的方法，包括：使聚多巴胺生成在基体的表面；将带有聚多巴胺的基体与活性因子接触，使得活性因子通过聚多巴胺黏附在基体上。
进一步地，方法包括：将基体浸入包括多巴胺的碱性溶液中，以使聚多巴胺生成在基体的表面。
进一步地，方法包括：将基体浸泡在含有多巴胺的三羟甲基氨基甲烷的碱性溶液中；然后冲洗除去基体表面残留的未牢固粘附的聚多巴胺颗粒；然后将含有聚多巴胺涂层的基体再浸泡入含有活性因子的溶液中，将活性因子接枝在基底表面。
进一步地，含有多巴胺的三羟甲基氨基甲烷的碱性溶液的浓度为3mg/ml至5mg/ml。
根据本发明的另一方面，还提供了一种在基体上制备活性因子的方法，包括：将多巴胺盐酸盐和活性因子溶解于碱性溶液，配置成混合溶液；将基体浸入混合溶液，并浸泡预定时间，使得活性因子通过聚多巴胺黏附在基体上。
进一步地，将多巴胺盐酸盐和活性因子溶解于三羟甲基氨基甲烷的碱性溶液，配置成混合溶液。
进一步地，混合溶液的浓度为3mg/ml至5mg/ml。
本发明的生物种植体采用含有聚多巴胺的黏合剂将活性因子黏附在基体上，聚多巴胺具有良好的粘合效果，能够与基体材料表面形成较强的相互作用，并且聚多巴胺的基团还可以接枝活性因子，因此可以将活性因子稳定的黏附在基体的表面，并且不会破坏基体的结构。
附图说明
构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1示出了脂联素促进间充质干细胞成骨向分化的试验效果图；
图2示出了经脂联素处理后间充质干细胞成骨相关基因表达试验的柱状图。
具体实施方式
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。
根据本发明的一个方面，提供了一种生物种植体，包括基体和活性因子，活性因子通过黏合剂黏附在基体上，黏合剂包括聚多巴胺。
本发明的生物种植体采用含有聚多巴胺的黏合剂将活性因子黏附在基体上，聚多巴胺具有良好的粘合效果，能够与基体材料表面形成较强的相互作用，并且聚多巴胺的基团还可以接枝活性因子，因此可以将活性因子稳定的黏附在基体的表面，并且不会破坏基体的结构。
本发明中的活性因子，也称生长因子，活性生长因子，活性细胞因子，是一类通过与特异的、高亲和的细胞膜受体结合，调节细胞生长与其他细胞功能等多效应的多肽类物质，多数由100个左右氨基酸组成。生长因子有多种，活性因子对不同种类细胞具有一定的专一性。
本发明的活性因子优选地为促进骨生长的活性因子。
海洋生物贻贝的足腺细胞能分泌出一种高强度粘液，在海水中凝固成足丝，贻贝依靠这些足丝紧密附着在其他物体的表面上。这种粘液的主要成分是贻贝黏附蛋白，以下简称MAPs，这种蛋白质可以在潮湿的环境中迅速固化，与基体材料表面形成较强的相互作用。
研究发现，贻贝的足丝与黏附基体的MAPs界面层中含有大量蛋白质组分mfp25，其氨基端序列中含有近30％的L2多巴胺和15％的赖氨酸残基，这些基团是赋予MAPs特殊黏附性能的关键成分。因此作为L2多巴胺(以下简称PDA)的邻苯二酚基团和赖氨酸的氨基官能团，能够很好地模拟蛋白质组分mfp25，即能够具有良好的黏附性能。
PDA不仅具有良好的粘附性能，并且其基团能够接枝活性因子，例如含有氨基和巯基的活性分子，因此可以利用PDA将活性因子稳定的黏附在基体的表面，并且不会破坏基体的结构。
PDA的形成过程简单且不需要有机溶剂，仅需将基体浸入含多巴胺(以下简称DA)的碱性Tris-HCl缓冲液或其他碱性溶液中，就可以在表面形成PDA层，因此，PDA能够应用于材料的表面改性。其中Tris-HCl缓冲液又称三(羟甲基)氨基甲烷、氨丁三醇、缓血酸铵或三羟甲基氨基甲烷，其在25℃时的浓度为0.05mol/L。
优选地，活性因子包括用于促进成骨的脂联素。
脂联素(Adiponectin，以下简称APN)是动物及人类脂肪细胞分泌的一种内源性生物活性多肽或蛋白质，由247个氨基酸组成，存在2种受体(AdipoR1和AdipoR2)，成骨细胞和破骨细胞均表达脂联素受体。体外实验证明，脂联素激活AdipoR1/JNK、AdipoR1/P38信号通路诱导人成骨细胞的增殖及分化，促进其成骨功能。同时，脂联素处理小鼠单核细胞后，可抑制NF-kappaB道路的激活，进而抑制小鼠单核细胞向破骨细胞分化成熟。上述研究表明，脂联素在骨代谢过程中起重要的调控作用，但它的半衰期短，局部应用时很快被稀释和代谢。
图1示出了脂联素促进间充质干细胞成骨向分化的试验效果，其中成骨向分化的间充质干细胞经由茜素红染色，图中左侧培养皿未加入脂联素，右侧培养皿加入了脂联素。可见经由脂联素的作用，促进了间充质干细胞成骨向分化。
图2通过柱状图形式示出了经脂联素处理后间充质干细胞成骨相关基因表达试验的结果，其中间充质干细胞被g脂联素处理24小时以上。每组柱状图中的左侧柱表示未加入脂联素的控制组数据，中间柱表示经脂联素处理后的数据，右侧柱表示脂联素的上调作用被APPL1siRNA所阻断的对照组数据。可见经由脂联素的作用，促进了间充质干细胞成骨向分化。图中各英文简称的含义分别为：ALP，碱性磷酸酶；BSP，骨唾液酸蛋白；CON，骨钙素；OPN，骨桥蛋白；COL1，Ⅰ型胶原；APPL1，衔接蛋白1。
可替换地，活性因子包括用于促进成骨的重组人骨形态发生蛋白-2，即rhBMP-2。
优选地，基体具有用于促进骨质长入的微孔结构。该微孔结构可以是骨小梁结构。
优选地，基体的材料可以为钛、钛合金、不锈钢、陶瓷、钙质、骨质、有机材料等多种材料。
本发明的生物种植体的一种优选实施例为采用3D打印技术制备表面具有微孔结构的钛片，利用聚多巴胺的强力黏附特性及其特殊基团可接枝生物活性物质的特点，在种植体表面接枝脂联素(APN)促成骨生长因子，诱导成骨。
根据本发明的另一个方面，还提供了一种在基体上制备活性因子的方法，包括：使聚多巴胺生成在基体的表面；将带有聚多巴胺的基体与活性因子接触，使得活性因子通过聚多巴胺黏附在基体上。
其中使聚多巴胺生成在基体的表面的方法可以为：将基体浸入包括多巴胺的碱性溶液中，以使聚多巴胺生成在基体的表面。
具体地，将钛片浸泡在含有多巴胺的三羟甲基氨基甲烷的碱性溶液(Tris-Hcl溶液)中，37℃过夜，然后用蒸馏水冲洗除去表面残留的未牢固粘附的聚多巴胺颗粒，然后将含有聚多巴胺涂层的基底再浸泡入含有活性因子的溶液中，将活性因子接枝在基底表面，最后一步也需要再简单冲洗一下，除去物理吸附的活性分子。
在本发明的一个优选实施例中，在基体上制备活性因子的方法的步骤包括：
取钛片，于60℃温度下在10mol/L氢氧化钠溶液中浸泡2小时，水冲洗，然后依次用去离子水、异丙醇、丙酮进行超声清洗，每次15分钟，干燥；
将上述钛片浸泡在3-多巴胺盐酸盐的Tris液中，37℃过夜，其中3-多巴胺盐酸盐的Tris液为将3-多巴胺盐酸盐溶解于10mM的Tris液(PH8.5)，配成的浓度为4mg/ml的混合溶液；
用去离子水反复冲洗3次，除去表面残留的未牢固粘附的聚多巴胺颗粒；
将含有聚多巴胺涂层的钛片再浸泡入含有脂联素分子的溶液中，37℃过夜，将脂联素接枝在含有聚多巴胺涂层的钛片表面；
用去离子水将钛片反复冲洗3次，除去物理吸附的脂联素分子；
在氩气流下将钛片吹干，即得表面具有脂联素的钛片。
根据本发明的另一个方面，还提供了一种在基体上制备活性因子的方法，包括：将多巴胺盐酸盐和活性因子溶解于碱性溶液，配置成混合溶液；将基体浸入混合溶液，并浸泡预定时间，使得活性因子通过聚多巴胺黏附在基体上。
优选地，将多巴胺盐酸盐和活性因子溶解于三羟甲基氨基甲烷的碱性溶液，配置成混合溶液。
优选地，混合溶液，即含有多巴胺的三羟甲基氨基甲烷的碱性溶液的浓度为3mg/ml至5mg/ml。更优选地，混合溶液的浓度为4mg/ml。
优选地，上述三羟甲基氨基甲烷的碱性溶液为浓度为10mM的Tris液，即每1升溶液中含有10毫摩尔的溶质。更优选地，该Tris液的PH值范围为8至9。
优选地，将基体浸入混合溶液，并浸泡超过10小时，使得活性因子通过聚多巴胺黏附在基体上。
优选地，在将基体浸入混合溶液前，需要对基体进行清洁。
针对钛和钛合金制的基体，清洁步骤包括采用碱性溶液浸泡和清洗。更优选地，清洗步骤包括采用醇和/或酮进行清洗，清洗时间大于10分钟。
优选地，活性因子包括脂联素。
在一个优选实施例中，首先将3-多巴胺盐酸盐和脂联素溶解于10mM的Tris液(PH8.5)，配成4mg/ml的混合溶液；并取钛片，于60℃温度下在10mol/L氢氧化钠溶液中浸泡2小时，水冲洗，然后依次用去离子水、异丙醇、丙酮进行超声清洗，每次15分钟，干燥；最后将上步制备好的钛片放入配制好的混合溶液中，在避光条件下浸泡12小时，然后取出，用去离子水反复冲洗3次，然后在氩气流下吹干，即得表面具有活性因子涂层的钛片。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。