一种羟乙基壳聚糖复合凝胶的制备方法.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810378975.6 (22)申请日 2018.04.25 (71)申请人 信阳师范学院 地址 464000 河南省信阳市南湖路237号 (72)发明人 聂磊 李星辰 武巧运 张庆茜 董婧 (74)专利代理机构 南京业腾知识产权代理事务 所(特殊普通合伙) 32321 代理人 郑婷 (51)Int.Cl. A61L 27/26(2006.01) A61L 27/50(2006.01) A61L 27/52(2006.01) C08B 37/08(2006.01) (54)。

2、发明名称 一种羟乙基壳聚糖复合凝胶的制备方法 (57)摘要 本发明涉及一种羟乙基壳聚糖复合凝胶的 制备方法， 首先采用特殊工艺对壳聚糖进行羟乙 基化， 再加入明胶， 通过化学交联和冷冻干燥制 得复合凝胶。 本发明制备工艺简单， 原料简单， 成 本低， 制得的复合凝胶具有较好的生物活性， 可 以用于细胞装载， 同时可能具备抗菌性能， 这种 新型复合凝胶能更好地应用于软骨修复方面。 权利要求书1页 说明书4页 附图1页 CN 108310462 A 2018.07.24 CN 108310462 A 1.一种羟乙基壳聚糖复合凝胶的制备方法， 其特征在于， 包括如下步骤： (1)制备羟乙基壳聚糖： 。

3、取10g壳聚糖加入到1518g的50wt氢氧化钠溶液中进行碱 化， 得到壳聚糖溶液， 在-20条件下静置13h后， 加入1525ml溶剂异丙醇， 搅拌升温至 7080， 再搅拌冷却至室温， 然后加入130180ml异丙醇和1519ml 2-氯乙醇的混合溶 液， 搅拌均匀后， 采用盐酸溶液调pH7， 再采用无水乙醇洗涤， 然后进行透析， 最后冷冻干燥， 即得羟乙基壳聚糖； (2)制备复合凝胶： 将羟乙基壳聚糖溶解在1v的醋酸溶液中， 得到羟乙基壳聚糖溶 液， 羟乙基壳聚糖浓度为2-5wt， 往羟乙基壳聚糖溶液中加入明胶， 羟乙基壳聚糖与明胶 质量比为1:35:1， 搅拌均匀后进行超声处理， 然后。

4、将溶液倒入48孔板中， 循环冷冻解冻处 理39次， 最后放入冷冻干燥机进行冷冻干燥， 即得。 2.如权利要求1所述的羟乙基壳聚糖复合凝胶的制备方法， 其特征在于， 步骤(1)中， 所 述碱化在-20冰箱内进行， 碱化时间超过24h。 3.如权利要求1所述的羟乙基壳聚糖复合凝胶的制备方法， 其特征在于， 步骤(1)中， 盐 酸溶液浓度为0.1M。 4.如权利要求1所述的羟乙基壳聚糖复合凝胶的制备方法， 其特征在于， 步骤(1)中， 透 析选用的是截留分子量在10000Da的透析袋， 透析时间为2d以上。 5.如权利要求1所述的羟乙基壳聚糖复合凝胶的制备方法， 其特征在于， 步骤(2)中， 所 述。

5、循环冷冻解冻处理是指： 将48孔板放入-20冰箱内冷冻24小时， 然后拿出来常温下解冻 12个小时， 然后再放入-20冰箱内冷冻。 6.如权利要求1所述的羟乙基壳聚糖复合凝胶的制备方法， 其特征在于， 步骤(2)中， 羟 乙基壳聚糖与明胶质量比为2:1。 7.如权利要求1至6任一项所述的羟乙基壳聚糖复合凝胶的制备方法， 其特征在于， 步 骤(2)中， 所述超声处理采用的是功率为1000W的超声仪， 超声时间不超过5min。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 108310462 A 2 一种羟乙基壳聚糖复合凝胶的制备方法 技术领域 0001 本发明涉及一种羟乙基壳聚糖复合凝胶的制备方法，。

6、 属于生物医学材料技术领 域。 背景技术 0002 壳聚糖是由自然界广泛存在的几丁质经过脱乙酰作用得到的， 这种天然高分子具 有生物相容性、 血液相容性、 安全性、 微生物降解性等优良性能， 是制备生物医用领域中一 种较好的材料。 壳聚糖凝胶在制备过程中需要通过交联， 交联剂通常选用戊二醛或者水溶 性碳化二亚胺， 交联剂的引入会降低支架的细胞相容性。 0003 明胶也常用于制备生物医用凝胶， 可以与壳聚糖复合制备凝胶用于细胞装载， 但 是与壳聚糖制备的凝胶装载细胞时， 细胞的活性还有待提高。 发明内容 0004 本发明的目的在于解决现有技术的不足， 提供一种羟乙基壳聚糖复合凝胶的制备 方法， 。

7、该复合凝胶具有良好的细胞装载性能， 能够使细胞很好的附着、 增殖， 能更好的应用 于软骨修复方面。 0005 技术方案 0006 一种羟乙基壳聚糖复合凝胶的制备方法， 包括如下步骤： 0007 (1)制备羟乙基壳聚糖： 取10g壳聚糖加入到1518g的50wt氢氧化钠溶液中进 行碱化， 得到壳聚糖溶液， 在-20条件下静置13h后， 加入1525ml溶剂异丙醇， 搅拌升 温至7080， 再搅拌冷却至室温， 然后加入130180ml异丙醇和1519ml 2-氯乙醇的混 合溶液， 搅拌均匀后， 采用盐酸溶液调pH7， 再采用无水乙醇洗涤， 然后进行透析， 最后冷冻 干燥， 即得羟乙基壳聚糖 000。

8、8 (2)制备复合凝胶： 将羟乙基壳聚糖溶解在1v的醋酸溶液中， 得到羟乙基壳聚糖 溶液， 羟乙基壳聚糖浓度为2-5wt， 往羟乙基壳聚糖溶液中加入明胶， 羟乙基壳聚糖与明 胶质量比为1:35:1， 搅拌均匀后进行超声处理， 然后将溶液倒入48孔板中， 循环冷冻解冻 处理39次， 最后放入冷冻干燥机进行冷冻干燥， 即得。 0009 进一步， 步骤(1)中， 所述碱化在-20冰箱内进行， 碱化时间超过24h。 0010 进一步， 步骤(1)中， 盐酸溶液浓度为0.1M。 0011 进一步， 步骤(1)中， 透析选用的是截留分子量在10000Da的透析袋， 透析时间为2d 以上。 0012 进一步。

9、， 步骤(2)中， 所述循环冷冻解冻处理是指： 将48孔板放入-20冰箱内冷冻 24小时， 然后拿出来常温下解冻12个小时， 然后再放入-20冰箱内冷冻。 0013 进一步， 步骤(2)中， 羟乙基壳聚糖与明胶质量比为2:1。 0014 进一步， 步骤(2)中， 所述超声处理采用的是功率为1000W的超声仪， 超声时间不超 过5min。 说 明 书 1/4 页 3 CN 108310462 A 3 0015 本发明的有益效果： 本发明将壳聚糖进行羟乙基化， 然后加入特定比例的明胶， 制 备成复合凝胶。 与现有技术相比， 本发明的优势在于： 该复合凝胶具有更好的力学性能、 生物活性和细胞装载性能。

10、， 可以使细胞更好的附着， 让其更好的增殖； 整个制备过程简单 易操作， 可以进行大量的制备； 采用的高分子材料成本较低， 无污染。 附图说明 0016 图1为实施例1-3制得的羟乙基壳聚糖复合凝胶的扫描电镜图； 0017 图2为实施例1-6制得的羟乙基壳聚糖复合凝胶的细胞相容性检测结果； 0018 图3为实施例3制备的羟乙基壳聚糖复合凝胶装载成骨细胞后的AO染色图。 具体实施方式 0019 以下将通过附图和实例具体说明本发明， 但这些具体实施方案不以任何方式限制 本发明的保护范围。 该实验方案所用到原料均可在市场购得。 0020 实施例1 0021 一种羟乙基壳聚糖复合凝胶的制备方法， 包括。

11、如下步骤： 0022 (1)制备羟乙基壳聚糖： 取10g壳聚糖加入到16.7g的50wt氢氧化钠溶液中进行 碱化， 所述碱化在-20冰箱内进行， 碱化时间为24h， 得到壳聚糖溶液， 在-20条件下静置 1h后， 加入20ml溶剂异丙醇， 搅拌升温至75， 再搅拌冷却至室温， 然后加入133ml异丙醇和 18.3ml 2-氯乙醇的混合溶液， 搅拌均匀后， 用0.1M盐酸溶液调pH7， 再采用无水乙醇洗涤3 次， 然后选用截留分子量在10000Da的透析袋透析两天， 最后冷冻干燥， 即得羟乙基壳聚糖； 0023 (2)制备复合凝胶： 将羟乙基壳聚糖溶解在1v的醋酸溶液中， 得到羟乙基壳聚糖 溶液。

12、， 羟乙基壳聚糖浓度为2wt， 往羟乙基壳聚糖溶液中加入明胶， 羟乙基壳聚糖与明胶 质量比为1:2， 搅拌均匀后进行超声处理(采用的是功率为1000W的超声仪， 超声时间为 2min)， 然后将溶液倒入48孔板中， 循环冷冻解冻处理(将48孔板放入-20冰箱内冷冻24小 时， 然后拿出来常温下解冻12个小时， 然后再放入-20冰箱内冷冻)3次， 最后放入冷冻干 燥机进行冷冻干燥， 即得。 0024 实施例1制得的复合凝胶的扫描电镜图见图1。 0025 实施例2 0026 一种羟乙基壳聚糖复合凝胶的制备方法， 包括如下步骤： 0027 (1)制备羟乙基壳聚糖： 取10g壳聚糖加入到16.7g的5。

13、0wt氢氧化钠溶液中进行 碱化， 所述碱化在-20冰箱内进行， 碱化时间为24h， 得到壳聚糖溶液， 在-20条件下静置 1h后， 加入20ml溶剂异丙醇， 搅拌升温至75， 再搅拌冷却至室温， 然后加入133ml异丙醇和 18.3ml 2-氯乙醇的混合溶液， 搅拌均匀后， 用0.1M盐酸溶液调pH7， 再采用无水乙醇洗涤3 次， 然后选用截留分子量在10000Da的透析袋透析两天， 最后冷冻干燥， 即得羟乙基壳聚糖； 0028 (2)制备复合凝胶： 将羟乙基壳聚糖溶解在1v的醋酸溶液中， 得到羟乙基壳聚糖 溶液， 羟乙基壳聚糖浓度为2wt， 往羟乙基壳聚糖溶液中加入明胶， 羟乙基壳聚糖与明胶。

14、 质量比为1:1， 搅拌均匀后进行超声处理(采用的是功率为1000W的超声仪， 超声时间为 2min)， 然后将溶液倒入48孔板中， 循环冷冻解冻处理(将48孔板放入-20冰箱内冷冻24小 时， 然后拿出来常温下解冻12个小时， 然后再放入-20冰箱内冷冻)3次， 最后放入冷冻干 说 明 书 2/4 页 4 CN 108310462 A 4 燥机进行冷冻干燥， 即得。 0029 实施例2制得的复合凝胶的扫描电镜图见图1， 其中， 图1A为实施例1的复合凝胶， 图1B为实施例2的复合凝胶。 0030 实施例3 0031 一种羟乙基壳聚糖复合凝胶的制备方法， 包括如下步骤： 0032 (1)制备羟。

15、乙基壳聚糖： 取10g壳聚糖加入到16.7g的50wt氢氧化钠溶液中进行 碱化， 所述碱化在-20冰箱内进行， 碱化时间为24h， 得到壳聚糖溶液， 在-20条件下静置 1h后， 加入20ml溶剂异丙醇， 搅拌升温至75， 再搅拌冷却至室温， 然后加入133ml异丙醇和 18.3ml 2-氯乙醇的混合溶液， 搅拌均匀后， 用0.1M盐酸溶液调pH7， 再采用无水乙醇洗涤3 次， 然后选用截留分子量在10000Da的透析袋透析两天， 最后冷冻干燥， 即得羟乙基壳聚糖； 0033 (2)制备复合凝胶： 将羟乙基壳聚糖溶解在1v的醋酸溶液中， 得到羟乙基壳聚糖 溶液， 羟乙基壳聚糖浓度为2wt， 往。

16、羟乙基壳聚糖溶液中加入明胶， 羟乙基壳聚糖与明胶 质量比为2:1， 搅拌均匀后进行超声处理(采用的是功率为1000W的超声仪， 超声时间为 2min)， 然后将溶液倒入48孔板中， 循环冷冻解冻处理(将48孔板放入-20冰箱内冷冻24小 时， 然后拿出来常温下解冻12个小时， 然后再放入-20冰箱内冷冻) 0034 3次， 最后放入冷冻干燥机进行冷冻干燥， 即得。 0035 实施例3制得的复合凝胶的扫描电镜图见图1， 其中， 图1A为实施例1的复合凝胶， 图1B为实施例2的复合凝胶， 图1C为实施例3的复合凝胶。 0036 实施例4 0037 一种羟乙基壳聚糖复合凝胶的制备方法， 包括如下步骤。

17、： 0038 (1)制备羟乙基壳聚糖： 取10g壳聚糖加入到16.7g的50wt氢氧化钠溶液中进行 碱化， 所述碱化在-20冰箱内进行， 碱化时间为24h， 得到壳聚糖溶液， 在-20条件下静置 1h后， 加入20ml溶剂异丙醇， 搅拌升温至75， 再搅拌冷却至室温， 然后加入133ml异丙醇和 18.3ml 2-氯乙醇的混合溶液， 搅拌均匀后， 用0.1M盐酸溶液调pH7， 再采用无水乙醇洗涤3 次， 然后选用截留分子量在10000Da的透析袋透析两天， 最后冷冻干燥， 即得羟乙基壳聚糖； 0039 (2)制备复合凝胶： 将羟乙基壳聚糖溶解在1v的醋酸溶液中， 得到羟乙基壳聚糖 溶液， 羟乙。

18、基壳聚糖浓度为2wt， 往羟乙基壳聚糖溶液中加入明胶， 羟乙基壳聚糖与明胶 质量比为3:1， 搅拌均匀后进行超声处理(采用的是功率为1000W的超声仪， 超声时间为 2min)， 然后将溶液倒入48孔板中， 循环冷冻解冻处理(将48孔板放入-20冰箱内冷冻24小 时， 然后拿出来常温下解冻12个小时， 然后再放入-20冰箱内冷冻)3次， 最后放入冷冻干 燥机进行冷冻干燥， 即得。 0040 实施例5 0041 一种羟乙基壳聚糖复合凝胶的制备方法， 包括如下步骤： 0042 (1)制备羟乙基壳聚糖： 取10g壳聚糖加入到16.7g的50wt氢氧化钠溶液中进行 碱化， 所述碱化在-20冰箱内进行，。

19、 碱化时间为24h， 得到壳聚糖溶液， 在-20条件下静置 1h后， 加入20ml溶剂异丙醇， 搅拌升温至75， 再搅拌冷却至室温， 然后加入133ml异丙醇和 18.3ml 2-氯乙醇的混合溶液， 搅拌均匀后， 用0.1M盐酸溶液调pH7， 再采用无水乙醇洗涤3 次， 然后选用截留分子量在10000Da的透析袋透析两天， 最后冷冻干燥， 即得羟乙基壳聚糖； 0043 (2)制备复合凝胶： 将羟乙基壳聚糖溶解在1v的醋酸溶液中， 得到羟乙基壳聚糖 说 明 书 3/4 页 5 CN 108310462 A 5 溶液， 羟乙基壳聚糖浓度为2wt， 往羟乙基壳聚糖溶液中加入明胶， 羟乙基壳聚糖与明胶。

20、 质量比为4:1， 搅拌均匀后进行超声处理(采用的是功率为1000W的超声仪， 超声时间为 2min)， 然后将溶液倒入48孔板中， 循环冷冻解冻处理(将48孔板放入-20冰箱内冷冻24小 时， 然后拿出来常温下解冻12个小时， 然后再放入-20冰箱内冷冻) 0044 3次， 最后放入冷冻干燥机进行冷冻干燥， 即得。 0045 实施例6 0046 一种羟乙基壳聚糖复合凝胶的制备方法， 包括如下步骤： 0047 (1)制备羟乙基壳聚糖： 取10g壳聚糖加入到16.7g的50wt氢氧化钠溶液中进行 碱化， 所述碱化在-20冰箱内进行， 碱化时间为24h， 得到壳聚糖溶液， 在-20条件下静置 1h。

21、后， 加入20ml溶剂异丙醇， 搅拌升温至75， 再搅拌冷却至室温， 然后加入133ml异丙醇和 18.3ml 2-氯乙醇的混合溶液， 搅拌均匀后， 用0.1M盐酸溶液调pH7， 再采用无水乙醇洗涤3 次， 然后选用截留分子量在10000Da的透析袋透析两天， 最后冷冻干燥， 即得羟乙基壳聚糖； 0048 (2)制备复合凝胶： 将羟乙基壳聚糖溶解在1v的醋酸溶液中， 得到羟乙基壳聚糖 溶液， 羟乙基壳聚糖浓度为2wt， 往羟乙基壳聚糖溶液中加入明胶， 羟乙基壳聚糖与明胶 质量比为5:1， 搅拌均匀后进行超声处理(采用的是功率为1000W的超声仪， 超声时间为 2min)， 然后将溶液倒入48孔。

22、板中， 循环冷冻解冻处理(将48孔板放入-20冰箱内冷冻24小 时， 然后拿出来常温下解冻12个小时， 然后再放入-20冰箱内冷冻)3次， 最后放入冷冻干 燥机进行冷冻干燥， 即得。 0049 性能测试 0050 1.对实施例1-6制得的羟乙基壳聚糖复合凝胶进行细胞相容性检测。 0051 细胞相容性测试流程如下： 将样品用75酒精进行消毒， 然后与骨髓间充质干细 胞进行培养， 采用CCK-8进行评价。 图2是本发明制备的复合骨支架材料的细胞相容性测试 结果。 由图2可以看出细胞在复合凝胶支架上随着时间的增加， 细胞存活率呈增加趋势， 这 说明制备出的复合凝胶具有良好的细胞相容性。 0052 2.复合凝胶的细胞繁殖性能检测。 0053 将实施例3制备的复合凝胶装载成骨细胞后的AO染色图见图3， 图3A是在第1天的 AO染色图， 图3B是第3天的AO染色图， 由图3可以明显看出， 细胞数量明显增加。 说 明 书 4/4 页 6 CN 108310462 A 6 图1 图2 图3 说 明 书 附 图 1/1 页 7 CN 108310462 A 7 。