发明背景
1.技术领域
本发明涉及一种焊接制剂和使用该焊接制剂进行组织焊接的方 法。该焊接制剂在涉及组织焊接的各种应用中提供可能很有助益的强 力粘合。
2.背景技术
随着外科手术的发展，安全修复由这些方法产生的复合组织缺损 的能力已经成为一种限制因素。例如，内镜颅底手术产生的组织缺损 很难安全地修复。目前已经从内镜脑脊液漏(CSF)修复的经验演化出 多层技术。然而，安全分离鼻腔鼻窦和颅内间室的方法依然存在不确 定因素，而手术失败的病人可能需要接受疾病干预如腰穿置管或开颅 手术。激光组织焊接提供了产生持久的鼻内组织粘合的能力，并可为 该手术困境提供解决方案。
激光组织焊接(LTW)利用掺有激光特异性生色团的生物焊接剂， 该激光特异性生色团经激光照射后通过使蛋白质变性而融化组织的 边缘。通过微小的附带性组织热损伤，该焊接可产生能够承受超过人 颅内压力的组织粘合。LTW可利用光纤进行内镜操作，因而很适用 于颅底。生物焊接剂的使用已经表明，相比常见于使用缝合材料产生 的肉芽肿炎症反应，其为伤口愈合提供了一个非免疫原性的骨架 (scaffold)。Kirsch AJ，Miller MI，Hensle TW，Chang DT，Shabsigh R， Olsson CA，Connor JP，“Laser tissue soldering in urinary tract reconstruction：first human experience(尿路修复重建中的激光组织焊 接：第一次人的体验)，”Urology.1995 Aug；46(2)：261-6。该生物焊接剂 也在正常的伤口愈合过程中被逐渐吸收。Lauto A，Trickett R，Malik R， Dawes JM，Owen ER，“Laser-activated solid protein bands for peripheral nerve repair：an vivo study(用于外周神经修复的激光激活固相蛋白带： 体内研究)，”Lasers Surg Med.1997；21(2)：134-41和Lauto A，Kerman I，Ohebshalon M，Felsen D，Poppas DP，“Two-layer film as a laser soldering biomaterial(用作激光焊接生物材料的两层膜)，”Lasers Surg Med 1999；25(3)：250-6。生物焊接剂可与波长特异性生色团结合。 Talmor M，Bleustein CB，Poppas DP，“Laser tissue welding：a biotechnological advance forthe future(激光组织焊接：未来生物技术的 发展)，”Arch Facial Plast Surg.2001 Jul-Sep；3(3)：207-13和Oz MC， Johnson JP，Parangi S，Chuck RS，Marboe CC，Bass LS，Nowygrod R， Treat MR，“Tissue soldering by use of indocyanine green dye-enhanced fibrinogen with the near infrared diode laser(使用吲哚菁绿染料增强的 纤维蛋白原和近红外二极管激光进行组织焊接)，”J Vase Surg.1990 May；l 1(5)：718-25。这不仅增加了目标特异性能量吸收并且减少了泄 漏给周围组织的热能。此外，通过选择特定的生色团如炭黑、荧光素 染料或吲哚菁染料，通过提供与激光焊接的充分性相关的可预测的颜 色变化可提供测定激光焊接充分性的客观基础。
研究最广泛的LTW焊接剂由白蛋白、透明质酸和作为生色团的 吲哚菁绿染料组成。在各种组织中的多项研究表明，利用对该焊接剂 具有时空特异性的激光能，该液体焊接剂能够产生持久的焊接。然而， 该焊接制剂有一些缺点。作为液体，其很难放置于无依托的区域而不 大量流失。此外，其很容易被血液或其它液体稀释，因而必须应用于 完全干燥的基底上。还有，该焊接剂缺少有效的内部结构稳定性而无 法成功地封合组织中的小缝隙。同样，由于该焊接剂以液体的形式应 用，其不具有能够使组织维持在一起的内部结构，直至施加了激光能， 因为当施用激光以形成激光焊接时，水不得不从该焊接剂中蒸发出 来。这就需要在形成焊接前和焊接过程中使用其它装置将组织维持在 一起。最后，该焊接材料中白蛋白基质的轴向收缩会导致该焊接材料 收缩，而在形成焊接时拉扯临近组织，在某些情况下这会危及到该焊 接。
Lauto，Antonio等人，“Chitosan Adhesive for Laser Tissue Repair： In Vitro Characterization(用于激光组织修复的壳聚糖粘合剂：体外特 性描述)，”Lasers in Surgery and Medicine，vol.36，pages 193-201(2005) (下文称“Lauto 2005”)公开了使用不溶的激光激活粘合条进行激光组 织修复。该不溶粘合条由含有壳聚糖(2％w/v)、ICG(0.02％w/v)和 醋酸(2％w/v)(参见第194页)的凝胶状溶液合成。当干燥时该Lauto 2005凝胶材料非常粘和脆，因此，用Lauto 2005制备该材料的不溶 粘合条用于激光焊接。该粘合条对湿润的羊肠进行激光焊接表现出抗 拉强度14.7kPa和弹性系数6.8Mpa。Lauto 2005显示该粘合剂也可用 于输送治疗化合物。但是，Lauto 2005没有公开在该制剂中使用交联 剂。
Lauto，Antonio等人，“In Vitro and In Vivo Tissue Repair with Laser-Activated Chitosan Adhesive(激光激活的壳聚糖粘合剂进行体外 和体内组织修复)，”Lasers in Surgery and Medicine，vol.39，pages 19-27(2007)(下文称“Lauto 2007”)公开了两种制剂，用于制备不溶的 激光激活粘合条进行激光组织修复：制剂I：含有壳聚糖(1.8％w/v)、 ICG(0.02％w/v)和醋酸(2％w/v)的凝胶状溶液；以及制剂II：含有壳 聚糖(1.8％w/v)、ICG(0.02％w/v)、京尼平(genipin)交联剂(1％w/v)、 醋酸(2％w/v)和乙醇(0.7％w/v)的凝胶状溶液。Lauto 2007未表明制备 不溶的激光激活粘合条用于该激光组织修复方法的该凝胶状溶液为 过饱和凝胶。Lauto 2007还得出结论“分子间和分子内交联有损于胶 原蛋白和壳聚糖的结合能力”。
Ono，K等人，“Photocrosslinkable Chitosan as a Biological Adhesive(作为生物粘合剂的光交联壳聚糖)，”Journal of Biomedical Material Resources，49，289-295(2000)(下文称“Ono”)教导了一种含有 经乳糖酸和p-叠氮苯甲酸修饰的壳聚糖的凝胶。该凝胶旨在用于封合 小肠、主动脉和气管上针头大小的孔。向壳聚糖中添加叠氮化物和乳 糖部分产生了高水溶性的壳聚糖溶液，其属于流体稀释液。经紫外线 照射，该修饰的壳聚糖自身交联产生不溶的壳聚糖水凝胶基质。
国际公开No.2007/082292(下文称“McGurk”)公开了一种生物 胶，其可由交联剂和蛋白质如白蛋白和/或能制成可调粘度的凝胶或 水凝胶的各种添加剂合成。在各种选择中，McGurk表明，可用于该 发明的可植入水凝胶可包括壳聚糖。McGurk的材料可包括荧光染料， 但McGurk并未考虑使用激光特异性生色团。此外，如果McGurk可 产生水密封口，那么该凝胶可应用于潮湿组织，并可用于包括填补孔 洞、修复组织裂伤和组织切口的各种用途。
国际公开No.2008/053432(下文称“Pini”)公开了用于各种激光组 织焊接如角膜和皮肤修复的多种固体和半固体制剂。在一个实施方案 中，该组合物包括一种过饱和ICG凝胶，其可通过使用前室插管填 入和涂覆在角膜切口并进行激光焊接。多余的凝胶可从切口冲洗掉。 在一个实施方案中，Pini公开了一种半固体的组合物，其可选择性地 包含壳聚糖(0.5-15％w/w)、ICG(0.5-10％w/w)和其它稳定该制剂 的的物质。然而，Pini未公开可交联化合物如白蛋白与壳聚糖和ICG 组合，也未考虑在其组合物中进行交联。
美国专利No.5,958,443(下文称“Viegas”)公开了一种包括成膜 聚合物、离子型多糖和抗衡离子的凝胶组合物，其可用作药物传输系 统、激光烧蚀保护物或角膜保护组合物。该凝胶组合物粘度可调。 Viegas公开了如果需要不可逆凝胶或保持其形状的凝胶，该凝胶可选 择性地包含壳聚糖和多种可交联化合物如聚乙烯醇和透明质酸。 Viegas未公开使用激光特异性生色团或激光组织焊接的方法。
WO 92/14513(下文称“Sawyer”)公开了一种用于激光组织焊接的 填充材料。Sawyer使用一种固体胶原蛋白“填充剂”使焊接物为固体的 棒、片等，具有降低焊接过程中因焊接剂从伤口边缘收缩而产生伤口 收缩的所述优点。Sawyer指出，因其高度可溶，该填充剂凝胶如明 胶可迅速被血液溶解。
因此，本技术领域存在对用于激光组织焊接的焊接制剂的需求， 该制剂需具有足够的粘度以应用于各种特定用途，同时提供足够的粘 结强度以产生安全的组织焊接。
发明概述
在第一方面，本发明涉及过饱和凝胶制剂。所述过饱和凝胶组合 物包括壳聚糖、白蛋白和激光特异性生色团的溶液。
在第二方面，本发明涉及使用本发明凝胶制剂的激光组织焊接方 法。在该方法中，本发明凝胶制剂被提供给用于组织修复的位点，并 用激光激活所述凝胶中的激光特异性生色团，从而通过蛋白质变性来 融合组织。
在第三方面，可使用所述凝胶制剂和激光组织焊接方法，例如， 进行颅底修复、气道消化道内镜修复、内镜经鼻手术修复、医源性食 道穿孔修复、腹腔镜腹部手术修复、肺部修复、结肠修复、血管吻合、 泌尿道/妇科内镜骨盆修复、口面手术修复、牙齿复位、皮肤缝合、 子宫纤维瘤切除和膀胱手术后的子宫缝合和修复。
在第四方面，本发明涉及制备用于激光组织焊接的过饱和凝胶组 合物的方法。在该方法中，壳聚糖酸性水溶液与白蛋白水溶液组合。 随后添加吲哚菁绿染料水溶液。将所得溶液进行沉淀并去除上清液后 得到一种过饱和凝胶组合物。
附图说明
图1A示出了如实施例3(右边)和比较例C(左边)中，实施激光组 织焊接术后0天伤口愈合的扫描电镜显微图。
图1B示出了如实施例3(右边)和比较例C(左边)中，实施激光组 织焊接术后5天伤口愈合的扫描电镜显微图。
图1C示出了如实施例3(右边)和比较例C(左边)中，实施激光组 织焊接术后15天伤口愈合的扫描电镜显微图。该图像显示焊接剂作 为正常伤口愈合和疤痕形成的骨架存在，没有损害上颌骨窦下方的重 新成膜。
图2示出了实施例3中的凝胶焊接剂扫描电镜显微图，左边为激 光焊接前，右边为激光焊接后。
图3示出了实施例7和比较例F中由肌电图检测的基线神经功能 的恢复。
图4示出了实施例7用于神经修复操作的修复方法的手术时间。
图5示出了基于多次实施操作的修复时间的学习曲线。
图6示出了对照组与带有衬底移植物的本发明激光焊接的兔鼓 膜损伤平均压力。
具体实施方式
为了说明的目的，下面参照其各个示例性的实施方案描述本发明 的原理。尽管本文特别描述了本发明的某些实施方案，本领域技术人 员将很容易理解相同的原理同样适用于，和可应用于其它设备和方 法。在详细描述本发明公开的实施方案以前，应该理解本发明的应用 并不限于其详述的任何具体实施方案。本文所用术语仅为描述的目 的，而非限制本发明。此外，尽管描述某些方法时参照了本文中以某 种顺序提供的某些步骤，但在许多情况下这些步骤可以以本领域技术 人员理解的任何顺序实施，且该方法并不限于本发明公开的特定步骤 安排。
必须提请注意的是，如本文和所附权利要求书中所用，除非另有 明确说明，单数形式“一”、“一个”和“所述的”包括了复数形式。同样， 本文中术语“一”(或“一个”)、“一或多”和“至少一”可互换使用。注意 术语“包含”、“包括”和“具有”也可互换使用。
激光组织焊接(LTW)涉及掺有激光特异性生色团的基于蛋白质 的焊接剂的应用，所述激光特异性生色团经激光照射后通过使细胞外 基质蛋白质变性而融合组织边缘。该焊接可使用柔性光纤进行内镜操 作，且已经表明其具有有用的粘结强度。另外，该基于蛋白质的焊接 剂已被证明为正常的伤口愈合过程提供了一个骨架，从而免于植入异 物或额外的拆除手术。
在第一方面，本发明涉及例如，用于激光组织焊接的有用的过饱 和凝胶制剂。所述过饱和凝胶组合物包括壳聚糖、白蛋白和激光特异 性生色团的溶液。
用于本发明的最优选生色团为吲哚菁绿(ICG)。但是，任何用于 激光焊接的具有合适化学和物理性质和特性的生物相容性的其它类 型染料都可作为替代物，包括但不限于炭黑和荧光素染料。ICG生色 团的实例有美国伊利诺伊州布法罗市Akorn公司生产的药用吲哚菁 绿和Monaco(德国)的PULSION Medical System AG公司的 ICG-PULSION染料。ICG水溶液的光吸收谱以分别在700和780nm 处的两个峰表征。这两个峰的相对强度随该溶液的浓度和/或不同的 过饱和程度而变化。
本发明使用过饱和凝胶制剂。作为过饱和凝胶制剂，本发明的组 合物不存在传统的液体焊接剂的缺点，如难于放置在无支承的区域， 被血液或其它液体迅速稀释，因为常规焊接剂缺乏强的内部结构稳定 性而不能封合组织的小缝隙，以及在激光焊接过程中需要从溶液中蒸 发大量的水。
本发明过饱和凝胶制剂优选表现出允许其放置于理想的焊接位 置而不会大量流失该制剂的流变行为。更优选地，本发明过饱和凝胶 制剂的粘度(于16℃以赛波特通用秒(SSU)测定)为约700至约 250,000，甚至更优选地，该过饱和凝胶制剂的粘度为约2500至约 70,000，最优选地，该过饱和凝胶制剂的粘度为约7000至约25,000。
在沉淀和形成过饱和凝胶制剂前测定，并以壳聚糖、ICG和白 蛋白组分的干重计，本发明制剂可包含约0.5-7.0％(w/w)壳聚糖、约 0.05至约0.60％(w/w)的ICG和约20-99％(w/w)白蛋白，余量为溶剂/ 载体材料。优选的制剂可包含约0.7-5.5％(w/w)壳聚糖、约0.07-0.55％ (w/w)的ICG和约24-99％(w/w)白蛋白，余量为溶剂/载体材料。更优 选的制剂可包含约2.3-4.0％(w/w)壳聚糖、约0.2-0.36％(w/w)的ICG 和约72-97.5％(w/w)白蛋白，余量为溶剂/载体材料。最优选地，所述 制剂可包含约2.9-4.0％(w/w)壳聚糖、约0.2-0.3％(w/w)的ICG和约 91-96.9％(w/w)白蛋白，余量为溶剂/载体材料。特别优选的制剂包含， 在沉淀和形成过饱和凝胶制剂前测定，约3.1％(w/w)壳聚糖、约0.3％ (w/w)的ICG和约96％(w/w)白蛋白，余量为溶剂/载体材料。
当使用除ICG外的替代性生色团时，本领域技术人员可根据该 凝胶组合物的粘度和所需的激光吸收水平等因素确定用于本发明组 合物中的生色团的量。
合适的溶剂/载体材料包括能够溶解该组合物的各种成分的溶 剂。所述合适的溶剂/载体材料应该优选为生物相容性的，水是本发 明制剂的特别好的溶剂材料。其它本领域技术人员已知的合适溶剂及 其混合物也可用于本发明。
壳聚糖是指由发现于甲壳动物壳中的几丁质经脱乙酰作用产生 的氨基多糖，且其可被制成阳离子聚合物。该制剂的壳聚糖组分最好 能在酸性条件下溶解于合适的溶剂。因而，一般理想的情况是，在本 发明制剂中使用足量的合适生物相容性酸组分以促进壳聚糖的溶解。 特别优选用于本发明制剂的酸为乙酸，尽管其它本领域技术人员已知 的合适的酸及其混合物也可用于本发明。
本发明的壳聚糖组分具有几大优点。例如，已经发现在激光焊接 中使用壳聚糖组分提供了非常好的粘结强度和/或破裂压力。此外， 壳聚糖的止血特性、粘着性(mucoadherent)和生物可降解性使其非常 适合用于激光焊接和组织修复。
提供白蛋白组分的目的为至少部分交联壳聚糖组分，并改善该壳 聚糖组分与组织的粘合力。以这种方式可获得该具有理想流变行为的 制剂。更优选地，使用足够的白蛋白以基本完全地交联该制剂的壳聚 糖组分。
已经发现，本发明制剂提供的流变特性便于其分布于激光焊接的 位点，并在激光焊接过程中使该制剂维持在其所处位置。同样，本发 明制剂提供了足够的化学稳定性从而允许该制剂在使用前制备并储 存于合适的条件下。合适的储存条件可为，例如，为保护生色团而避 光冷藏于约4℃。
其它合适的添加剂也可用于该制剂中，如抗氧化剂、抗菌剂、类 固醇、抗真菌剂、抗病毒剂、成纤维细胞抑制剂、抗生物膜剂、抗炎 剂、免疫活性化合物、等渗剂、pH调节剂、增塑剂、纳米微粒和抗 生素。可在本发明制剂中使用足量的上述每种添加剂以实现所需的功 效。本发明的过饱和凝胶能够可逆地结合药物制剂，该药物制剂在体 内随时间而被洗脱。因而，与传统制剂不同，该焊接剂还能用作多种 热稳定化合物的药物输送载体。
本发明制备过饱和凝胶制剂的合适方法如下。搅拌壳聚糖酸性水 溶液，可向其中加入白蛋白水溶液。然后，加入吲哚菁绿染料水溶液。 使该溶液沉淀并去除上清液，得到过饱和凝胶组合物。本申请中壳聚 糖、白蛋白和ICG含量的重量百分比范围，基于在沉淀步骤和凝胶 形成之前的壳聚糖、白蛋白和ICG组分的干重而确定。如需要，可 采用进一步的步骤去除上清液。
在本发明一些实施方案中，添加这些成分的顺序对于确定最终过 饱和凝胶产品和/或由其形成的激光焊接的特性可能很重要。在这些 实施方案中，优选在添加染料之前向壳聚糖溶液中加入白蛋白溶液， 然后沉淀该过饱和凝胶。以这种方式，可制备浓缩形式的白蛋白，其 在激光焊接过程中的收缩程度不如一些其它激光焊接剂那么大。
本发明方法提供的过饱和凝胶，比液体更具粘性，但足够柔软且 能被泵送至激光焊接的位置，并能够形成可于激光焊接步骤中保持的 所需形状。进一步地，由于本发明的过饱和凝胶是由水溶液沉淀而成， 其具有的附加优点为不溶于水，因而在激光焊接过程中无需将该凝胶 应用于干燥的组织基座(bed)。这大大增加了激光焊接过程的灵活性， 同时免于在某些焊接场合为了提供干燥的组织基座需进行额外的准 备。
进一步地，本发明过饱和凝胶在使用中表现出凝血特性。同样， 如需要，该凝胶可与药物载体材料一起传送。
已经发现，本发明的过饱和焊接凝胶强于当前描述的焊接剂，其 易于操作且定位精确，能够连接距离达几个毫米的组织小间隙，而且 可作为药物制剂的载体。此外，由于本发明材料为凝胶，其在焊接过 程中具有足够的结构以将一些组织维持在一起，从而减少了用外部手 段将组织维持于所需位置和/或使组织边缘紧密相对以供焊接的需 要。这便于，例如，使用内镜进行激光组织焊接，该焊接过程中可能 难于用其它工具将组织维持于适当位置。
本发明凝胶的另一个优点为，其收缩量与如公开号为WO 92/014513的国际申请公布的激光焊接剂相比要少。据信本发明的沉 淀方法浓缩了该过饱和凝胶中的白蛋白，该方式减少了激光焊接期间 该材料的收缩。
本发明凝胶的又一个优点为，证据表明该凝胶在激光焊接前或激 光焊接过程中填入到组织内，从而形成结构更为良好的粘合。例如， Lauto 2005固体不溶条无法填入组织内且不具备本发明的这一优点。
本发明壳聚糖/白蛋白过饱和焊接凝胶能够产生水密性组织粘 合，该粘合超过颅内压，有助于伤口自然愈合，产生微小的附带性热 组织损伤。这些焊接可通过光纤使用激光实施，因而可能极为适合内 镜操作。该焊接凝胶相比传统焊接剂粘合力更强、更易于使用，还可 用作药物制剂的载体。该技术非常适于颅底修复，其应用延伸至任何 在某区域要求水密性组织封合又难以接近的手术专科，该手术专科包 括但不限于头和颈的手术修复如颅底修复、气管修复、气道消化道内 镜修复、内镜经鼻手术修复、医源性食道穿孔修复、腹腔镜手术修复 如腹腔镜腹部手术修复、肺部修复、结肠修复、鼓膜修复(耳膜)、神 经修复如切断神经的再附着、血管吻合、泌尿道/妇科内镜骨盆修复、 口面手术修复、牙齿复位、皮肤缝合、胸腔手术修复、神经外科修复、 子宫纤维瘤切除和膀胱手术后的子宫封合与修复。该方法可应用的修 复手术还有，例如，普通外科手术、经自然腔道内镜手术(NOTES)、 胃间隔减肥(TOGA)、胃镜检查手术、视频辅助手术如视频辅助胸腔 手术(VATS)和/或机器人手术。
本发明尤其适用于无法应用缝合或吻合技术(stapling)的情况，如 该修复可能要求一定程度的水或空气密封性。例如，胸腔手术中可能 要求某种最低程度的空气密封性，使用本发明的材料就能达到。在必 须减少流体渗漏的各种形式头和颈手术中也可能涉及类似应用。
在第二方面，本发明涉及使用本发明凝胶制剂进行激光组织焊接 方法。在该方法中，将本发明凝胶制剂提供给用于组织修复的位点， 所述凝胶中的激光特异性生色团被激光激活通过诱导蛋白质变性而 融合组织。
为了本发明的目的且根据本发明一个实施方案，本发明过饱和凝 胶制剂被传送至组织修复的位点。可使用例如，约650-850nm波长 的激光，进行激光组织焊接。例如，使用以810nm波长发射的AlGaAs 二极管激光器来实施。或者，可使用二极管激光模块(加利福利亚州 山景市Iridex公司)与600μm内径的石英光纤耦合，该光纤的技术参 数如下：功率1.0W，脉冲时长0.5s，脉冲间隔0.1s，功率密度31.81 d/cm2，主波长输出808+/-1nm。用足够的激光发射通过蛋白质变性 产生合适的组织粘合。例如，在焊接过程中可将激光能施加于该焊接 剂直至发生由绿色至米黄色的特征性变化或达到某个特定温度。为了 实施特定组织修复手术的目的，本领域技术人员常规上可根据如组织 修复的大小和位置以及有效封合该伤口所需焊接剂的量等因素确定 足够程度的激光。
下列实施例结果中的破裂压力表明了几个重要特征。在实施例1 中，无需额外的骨膜移植，手术5天后瞬时破裂压力由135.03+/-5.76 mmHg升至154.10+/-3.68mmHg，这表明鼻腔粘膜内激光焊接产生 的焊接其破裂强度甚至超过了病理学上提高的颅内压。相对于使用基 于透明质酸、白蛋白和ICG混合物常规制剂的类似比较例A，其也 表现出了显著的改善。所述实施例还证明，该焊接的目的是作为骨架 而加固该修复并防止CSF渗漏，直至形成天然的伤口疤痕。相对于 使用基于透明质酸、白蛋白和ICG混合物常规制剂的类似比较例B， 实施例2也表现出了显著的改善。其余实施例表明，本发明可成功地 应用于多种其它类型的修复。
实施例
材料和方法
破裂阈值测压法：该测压系统由带有可追踪测压计(-776.00至 +776.00mmHg范围，宾夕法尼亚州匹兹堡市Fisher Scientific公司)的 装有盐水的封闭系统和使用以鲁尔旋锁接口(luer lock)固定的标准 静脉输液管、呈平行设置的10cc注射器组成。为测定粘膜修复的破 裂压力，将兔子处死，去除硅胶垫片后露出粘膜修复。用1mm的耳 科金刚钻头在上颌骨窦的前外侧上实施另外的鼻窦切开手术。鼻窦切 开手术过程中，用牙科粘合剂(伊利诺伊州伍德戴尔市Stoelting公司) 以水密封方式将鲁尔旋锁接口粘接并与该测压系统平行连接。在鼻腔 内找出上颌窦自然开口，并用一条以牙科粘合剂加固的粘膜将其堵 住。通过给注射器活塞施压逐渐增加系统内的压力，当盐水穿过粘膜 破裂出来时记录其破裂压力。然后，将其与该测压计上记录的最大压 力相关联。
组织学分析：进行破裂压力分析后，从每种条件中选出一个修复， 与其周围的骨头一起取出并包埋于石蜡中。进行标准的苏木精和伊红 染色，在两个不同的切口，由兽医组织病理学家以3点计量法对所述 修复的附带热损伤、局部炎症程度和纤维组织形成进行盲评计分。
统计学分析：所有统计分析均使用SigmaStat的3.1版(加利福利 亚州圣何塞市Systat Software公司)进行。将破裂压力排序并用条件 (激光焊接与开口)和术后天数(0，5，15)这两个因素进行双因素方差 分析(ANOVA)。用图基氏(Tukey)检验以0.05的显著性水平进行事后 成对多重比较。
激光系统：使用二极管激光模块(加利福利亚州山景市Iridex公 司)与600μm内径的石英光纤耦合，该光纤的技术参数如下：功率 0.5-1.0W，脉冲时长0.5s，脉冲间隔0.1s，功率密度31.81d/cm2至 约19W/cm2，流畅度8.0J/cm2，主波长输出808+/-1nm。
样本数：下列公式用于计算本研究中分别比较的样本数。使用该 公式应考虑规定的α误差za。
(z＝α误差的值[1.96]；s2＝方差；d＝待检测的差值；N＝每个研 究组的受试对象数)。由于我们的样本数计算表明，为了足够的效力 (adequate power)每个研究组需要大于3个受试对象，所以每个研究组 用了至少4个受试对象。
实施例1
壳聚糖/白蛋白焊接剂的制备
母液：
1)0.2M醋酸-12.01g冰醋酸+H2O至总体积1L。
2)1.3％(w/w)壳聚糖-将0.327g的88-92％DDA壳聚糖 (Ultrasan CHO2)混合于12mL H2O和12mL 0.2M醋酸，于振荡器 上混合36小时以上。
3)71.4％(w/w)-吲哚菁绿染料(Cardiogreen Sigma)。将ICG与 H2O混合制备2.5mg/mL的溶液。用金属箔避光保存。
4)29.4％(w/w)白蛋白溶液-将2.5g白蛋白混合入6mL H2O中。 于37℃水浴加热15分钟，根据需要涡动旋转。以3000rpm转速离心 3分钟以去除气泡。
焊接剂的制备：
1)通过搅棒将4cc的1.3％壳聚糖母液加入至50cc的烧杯中，
2)搅拌的同时将4cc的29.4％白蛋白母液加入至该壳聚糖溶液 中，以及
3)将2cc的吲哚菁绿染料溶液加入至该混合物中。
4)然后使该溶液沉淀，并去除上清液。将该凝胶吸入至10cc的 注射器中，且任选地根据需要涡动旋转以清除额外的上清液。
最终产品为本发明的过饱和凝胶制剂。然后将该过饱和凝胶制剂 用于评估活体手术产生的兔上颌窦切开手术中的激光焊接破裂压力 (该焊接破裂时的压力)。传统的焊接剂能够获得120.85+/-47.84mmHg 的瞬时破裂压力，并且如下述比较例A所示，于手术后5天组中升 至132.56+/-24.02mmHg。对于传统的白蛋白/透明质酸焊接剂，焊接 前需要进行骨膜移植以连接鼻窦切开手术中的间隙。当使用本发明过 饱和凝胶制剂为焊接剂重复比较例A的实验时，其获得的瞬时破裂 压力为135.03+/-5.76mmHg，于手术后5天升至154.10+/-3.68 mmHg，而无需额外的骨膜移植。两组的组织分析均表现出正常的伤 口愈合、微小的附带热损伤和最小的炎症反应。
实施例2
该实施例使用实施例1的过饱和凝胶制剂评估外植体兔食管切 开手术模型的破裂强度。在兔食管内做出一个全层穿孔，然后进行焊 接，测定破裂压力。下面的比较例B表明，使用传统的焊接剂，获 得的破裂强度为71.6+/-7.5mmHg。但其需要缝合加固以避免进行破 裂压力测定过程中伤口变形。当使用本发明过饱和凝胶制剂为焊接剂 重复比较例B的实验时，获得的破裂强度为95.86+/-8.9mmHg，且 无需缝合加固。
该修复的组织学分析结果也非常令人满意。激光焊接和对照组之 间在全面的炎症和纤维组织形成之间没有发现差异。这再次支持了一 个事实，即手术后15天尽管焊接剂依然附着其上但对疤痕形成的进 展毫无影响。
同样重要的是其对周围组织没有热损伤。添加激光波长特异性生 色团增强了焊接剂的能量吸收效率，从而实现用相对低的激光能密度 进行有效的焊接。当评估将该技术应用于易受伤害身体部位如前颅窝 及其相关结构的临近范围内的可能性时，这一点也很重要。
比较例A
焊接剂制备：该比较例的生物焊接剂制备基于以前公开的技术， 例如，描述于Kirsch，A.J.，Miller，M.I.，Hensle，T.W.等人，“Laser tissue soldering in urinary tract reconstruction：first human experience(尿路修 复重建中的激光组织焊接：第一次人的体验)，”Urology 1995； 46(2)：261-6。该焊接剂组成为比例分别为2∶1∶2的42％牛血清白蛋 白(宾夕法尼亚州匹兹堡市Fisher Scientific公司)、吲哚菁绿染料 (2.5mg/mL，明尼苏达州圣路易斯市Sigma-Aldrich公司)和透明质酸 钠(10mg/mL，明尼苏达州圣路易斯市Sigma-Aldrich公司)的混合物。 将该白蛋白溶液用0.2μm孔的过滤器过滤，将其400μL部分与200μL 吲哚菁绿染料和400μL透明质酸混合。
在20只新西兰白兔上切出两侧的上颌骨窦粘膜切口，其一侧用 激光组织焊接(LTW)修复。于手术后0、5和15天测量破裂压力阈 值，并用双因素方差分析(ANOVA)和事后图基氏检测与对照组比较。 对焊接进行热损伤、炎症和纤维组织形成的组织学检查，并由兽医组 织病理学家以3点计量法进行评估计分。
结果：LTW组的破裂压力大大高于对照组，即手术后0天 (120.85mmHg，WA，SD＝47.84与7.85mmHg，N＝4，SD＝0.78)和5 天(132.56mmHg，N＝8，SD＝24.02与41.7mmHg，N＝8，SD＝7.2)(p＜0.05)。 到手术后15天其破裂阈值没有大的区别，即LTW(169.64mmHg，N＝8， SD＝18.49)和对照(160.84mmHg，N＝8，SD＝14.16)。没有证据表明任何 组中存在对周围组织的热损伤，并且实验组和对照组在炎症或纤维组 织形成方面也没有区别。
比较例B
医源性食道穿孔为潜在的疾病并发症，其发生率在过去的20年 来已升至仅次于诊断和治疗性食道内镜检查的增加率。本实施例使用 提供瞬时水密性封合而无需异物移植的激光组织焊接技术，利用动物 模型进行一期(primary)单阶段食道穿孔经腔修复。
在食道仪器使用过程中医源性损伤所占比例多达所有食道穿孔 的59％，且在弹性软质食道内镜检查中发生率0.03％，硬质食道内镜 检查中发生率0.11％。当24小时内开始处理，有报道死亡率为4-20％， 延误时间超过48小时则可能使死亡率翻倍。这些损伤易于发生在结 构上的狭窄位点包括环咽部、主动脉弓、左主支气管和食道下端括约 肌。
焊接剂的制备：按照比较例A进行生物焊接剂的制备。
兔组织的获取：基于无关unrelated)动物管理和使用委员会 (IACUC)实验计划书并获得批准使用死后组织，将20只使用的新西 兰白兔处死。从胸骨切痕至耻骨做中线切口，然后实施胸骨正中切开 手术以露出胸段食管。将气管食管复合体从椎前筋膜上完全切下，并 截去环咽部以上和隔膜处以下。然后将食管从该气管上完全切下。
实验组：我们的研究包括测定4种条件下食管损伤的破裂压力， 该4种条件为5mm开口切口，使用25-0间断聚丙烯缝线的外部缝 合，外部激光增强缝合，以及无缝合的内腔激光焊接。所有条件都测 定5遍。
组织学：获得另外5个内腔焊接，并将其包埋于石蜡中。进行标 准的苏木精和伊红染色，并由兽医组织病理学家对焊接进行附带性热 组织损伤检查。
该封闭测压系统可提供的最大压力为186.4mmHg。其平均破裂 阈值，开口切口组为6.5mmHg(N＝5，SD＝1.94)，而外部缝合组为 37.18mmHg(N＝5，SD＝I.97)。对于激光焊接条件下其平均破裂强度， 外部激光增强缝合组为71.60mmHg(N＝5，SD＝7.58)，而内腔激光焊 接组为54.78mmHg(N＝5，SD＝5.84)。
该处理组中的中间值差异都明显大于随机的期望值 (Kruskal-Wallis检测，H＝17.87，3df，P＝＜0.001)。事后(post hoc)分析表 明，几个处理组具有明显不同的破裂强度。内腔焊接组的破裂强度明 显高于开口切口组(P＜0.05)。外部激光增强缝合组的破裂强度明显高 于开口切口组和仅作外部缝合组(P＜0.05)。在内腔焊接组和外部缝合 或外部激光增强缝合组之间没有明显的统计差异。
将激光凝结与正常粘膜对照进行组织学检测比较，显示出微小的 热组织损伤。
实施例3和比较例C
在实施例3中，使用根据本发明制备的过饱和凝胶焊接剂进行颅 底组织焊接，该焊接剂包含1.3％重量的壳聚糖、29.4％白蛋白和吲哚 菁染料。在比较例C中，手术后使用现有技术的焊接剂进行颅底组 织焊接，该焊接剂包含42％白蛋白溶液、吲哚菁染料和透明质酸钠。 这些实施例中使用的是上文描述的激光系统。
应用破裂阈值测压法评估所述焊接的破裂强度。没有进行组织焊 接的对照其瞬时破裂压力(手术后0天)为7.85mmHg，比较例C焊接 的瞬时破裂压力为120.85mmHg，而本发明实施例3焊接的瞬时破裂 压力为135.02mmHg。手术后5天，对照组破裂压力为41.7mmHg， 比较例C焊接的破裂压力为132.56，而本发明实施例3焊接的破裂 压力为154.10mmHg。
图1A-1C所示为手术后0、5和15天，比较例C(左边)和实施例 3(右边)的伤口愈合。由这些图可知，使用该焊接剂产生微小的附带 热损伤，并维持了正常伤口愈合过程的进展。该焊接剂随时间而被吸 收并且炎症最小，到45天时显示其被完全再吸收。另外，该实施例 表明，该基于壳聚糖的焊接剂无需桥接移植即可成功地封合伤口。
图2所示为焊接前实施例3组织修复的扫描电镜显微图，即应用 焊接剂后(左边)和对应用的焊接剂实施激光照射后(右边)。该图表明， 对本发明焊接剂实施激光照射使得在组织和激光照射焊接剂之间界 面处的组织内形成激光照射焊接剂的内含物。
实施例4和比较例D
在这些实施例中，实施例3和比较例C的焊接剂被分别应用于 实施例4和比较例D进行食道修复。这些实施例中使用的是上文描 述的激光系统。所得结果如下列表1所示。
表1
表1的结果表明，甚至在用于比较的激光组织焊接与缝合结合的 时候，本发明激光组织焊接的破裂强度明显大于用于比较的激光组织 焊接。
实施例5
在该实施例中，使用实施例3的焊接剂组合物进行气管修复。该 实施例中使用的是上文描述的激光系统。实施了3种不同类型的气管 修复，结果如下列表2所示。
表2
表2中的结果表明，本发明激光组织焊接材料和方法可应用于各 种类型的气管修复。
实施例6和比较例E
在该实施例中，使用实施例3的焊接剂对肺组织进行激光组织焊 接。将该焊接的破裂强度与健康肺的组织、Tisseel纤维蛋白粘合剂修 复后的组织和未修复的组织的破裂强度基线值进行比较。结果如表3 所示。
表3
这些结果表明，该激光组织焊接提供的破裂强度明显大于其它方 法的肺组织修复。在产生医源性穿孔或修复完成后立即测定其破裂强 度。
实施例7和比较例F
在该实施例中。实施了切开了兔面部神经修复。3个修复为通过 防损伤锥形针采用3种9-0单丝尼龙缝线进行常规缝合，3个修复为 采用本发明实施例3的焊接剂组合物进行激光焊接。
估算手术时间，并于12周后通过肌电图测定神经功能恢复率/程 度。图3所示为通过肌电图测定的基线功能恢复。图4所示为实施例 7神经修复过程修复方法的手术时间。图5所示为基于进行修复过程 次数的修复时间的学习曲线。结果表明，12周后通过肌电图测定激 光组织焊接修复兔面部神经对其功能的恢复大于传统的缝合修复。同 样，激光组织焊接修复实施的手术过程比传统的缝合修复快5倍。最 后，激光焊接的修复时间几乎不受外科医生经验的影响，因而一个新 手实施手术的过程可以和有经验的医生一样快，而对于缝合修复则存 在一个明显的学习曲线。
实施例8
将气吹入兔的中耳，并测定其耳膜破裂的压力。为制备这些样本， 鼓膜的整个松弛部结合抽吸和精细掏耳器(otologic pick)进行处理。得 到颞骨的骨膜并压入薄筋膜移植物，其以衬垫方式穿过鼓膜穿孔。然 后，将一薄层焊接剂置于该移植物上，特别注意覆盖筋膜移植物和穿 孔边缘的连接处。接着，用实施例3的焊接制剂对鼓膜进行修复，在 吹气后测定该修复破裂时的压力。结果如图6所示。从这些结果可知， 激光组织焊接的强度达到自然无伤害鼓膜组织的5倍。
上述实施例用于解释和说明的目的，而非以任何方式限制本发明 的范围。本发明的范围取决于其所附的权利要求书。