一种还原敏感型多肽前药纳米胶束及其制备与应用.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201511019626.8 (22)申请日 2015.12.30 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 105560178 A (43)申请公布日 2016.05.11 (73)专利权人 浙江工业大学 地址 310014 浙江省杭州市下城区潮王路 18号 (72)发明人 张静 李猛飞 冯杰 (74)专利代理机构 杭州天正专利事务所有限公 司 33201 代理人 黄美娟 李世玉 (51)Int.Cl. A61K 9/107(2006.01) A61K 47/64(201。

2、7.01) A61K 31/704(2006.01) A61K 31/4745(2006.01) A61K 31/337(2006.01) A61P 35/00(2006.01) (56)对比文件 CN 101812178 A,2010.08.25, CN 105037739 A,2015.11.11, CN 104667292 A,2015.06.03, 审查员 段洁 (54)发明名称 一种还原敏感型多肽前药纳米胶束及其制 备与应用 (57)摘要 本发明公开了一种还原敏感型多肽前药纳 米胶束及其制备与应用， 所述纳米胶束以疏水药 物为内核， 以细胞穿膜肽为壳层， 所述内核与壳 层通过还原敏感。

3、型双硫键连接； 本发明设计出了 一种较为简便、 通用的将两种不同性质的模块化 分子结合起来的方法， 即将疏水性药物通过具有 还原敏感的双硫键连接上炔基， 再合成末端带有 叠氮的功能性多肽化合物， 最后通过Click反应， 制备出具有还原敏感型多肽前药纳米胶束。 以本 发明为例， 在温和的条件下， 通过Click反应制备 出具有多种功能性的前药纳米胶束， 且从前药的 释药情况看， 在不同体外条件下前药表现出良好 的环境响应性。 权利要求书1页 说明书6页 附图3页 CN 105560178 B 2019.02.01 CN 105560178 B 1.一种还原敏感型多肽前药纳米胶束， 其特征在于所。

4、述纳米胶束以疏水药物为内核， 以细胞穿膜肽为壳层， 所述内核与壳层通过还原敏感型双硫键连接； 所述还原敏感型多肽 前药纳米胶束结构通式为： K10-triazole-SS-DOX， K10为细胞穿膜肽序列， triazole为叠氮 与炔基环化后的三唑五元环， DOX为疏水药物， SS为连接细胞穿膜肽序列与疏水药物的还原 敏感型双硫键； 所述还原敏感型多肽前药纳米胶束按如下方法制备： (1)DOX-SS-alkyne： 将疏水药物 溶解在二甲基甲酰胺中， 加入三乙胺、 二硫代二丙酸酐， 2070搅拌0.1h4h后， 再加 入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、 N-羟基琥珀酰亚胺和丙。

5、炔胺， 室温避光搅 拌混匀， 将混合液用去离子水沉淀， 离心， 沉淀干燥， 得到DOX-SS-alkyne； 所述疏水药物与 二硫代二丙酸酐、 三乙胺物质的量之比为1:0.96： 1.03； 所述疏水药物与1-乙基-(3-二甲基 氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、 N-羟基琥珀酰亚胺和丙炔胺的物质的量之比为1:3.5:3.5: 4 .8； 所述二甲基甲酰胺体积用量以疏水药物物质的量计为100130L/mol； (2)K10- triazole-SS-DOX： 将步骤(1)制备的DOX-SS-alkyne和K10-N3加入二甲基甲酰胺中， 在氮气 保护下加入催化剂碘化亚铜， 2030反应完全后， 将反应。

6、液用0.0050.02mol/L乙二 胺四乙酸二钠水溶液作为透析液进行透析， 取截留液冷冻干燥， 得到还原敏感型多肽前药 纳米胶束K10-triazole-SS-DOX； 所述K10-N3为末端连接叠氮的细胞穿膜肽序列； 所述DOX- SS-alkyne与K10-N3物质的量之比为1:0.83； 所述催化剂用量以DOX-SS-alkyne和K10-N3的物 质的量之和计为4.5； 所述二甲基甲酰胺体积用量以DOX-SS-alkyne物质的量计为40ml/ mol。 2.如权利要求1所述还原敏感型多肽前药纳米胶束， 其特征在于所述细胞穿膜肽由8 30个碱性氨基酸缩合而成。 3.如权利要求2所述还。

7、原敏感型多肽前药纳米胶束， 其特征在于所述氨基酸包括赖氨 酸、 精氨酸或组氨酸。 4.如权利要求1所述还原敏感型多肽前药纳米胶束， 其特征在于所述疏水药物包括阿 霉素、 喜树碱或紫杉醇。 5.如权利要求1所述还原敏感型多肽前药纳米胶束， 其特征在于步骤(2)所述K10-N3通 过FMOC多肽方法合成： 先合成侧链带有保护基的多肽序列， 继而利用同样的方法加入氨基 受FMOC保护之后的12-氨基十二酸， 脱去12-氨基十二酸上的FMOC后， 暴露出活性氨基， 再加 入叠氮乙酸， 最后获得K10-N3。 6.一种权利要求1所述还原敏感型多肽前药纳米胶束在制备肿瘤靶向药物中的应用。 权 利 要 求 。

8、书 1/1 页 2 CN 105560178 B 2 一种还原敏感型多肽前药纳米胶束及其制备与应用 (一)技术领域 0001 本发明涉及一种生物医药纳米材料制备， 特别涉及一种多肽前药纳米胶束的制备 方法。 (二)背景技术 0002 智能响应型载药系统在癌症治疗中越来越引起人们的关注。 载药系统根据外界因 素的变化如温度、 pH和场效应等， 自发做出响应， 从而达到人们预期可控的治疗效果。 0003 还原型谷胱甘肽(GSH)是动物细胞内含量最丰富的含有巯基的生物小分子， 还原 型谷胱甘肽(GSH)和氧化型谷胱甘肽(GSSG)是体内最主要的氧化还原对。 在细胞内外不同 的环境中GSH/GSSG的。

9、含量存在显著的差异。 由于还原型辅酶II(NADPH)利谷胱甘肽还原酶 的作用， 细胞内GSH浓度是细胞外环境的100-1000倍， 从而使细胞内环境保持较强的还原 性。 此外， 研究发现， 肿瘤组织中GSH浓度比正常组织至少高4倍， 因此， 比正常组织有更高的 还原性。 0004 多肽分子是基体内重要的一类生物活性物质。 与蛋白质比较， 具有分子量小， 制备 容易， 抗原性弱， 毒副作用小等优点， 在医药研究和临床应用上越来越受到重视。 由于小片 段肽的低毒性、 靶向性、 无免疫原性、 良好的生物相容性以及本身的治疗作用等特点， 同时 肿瘤细胞表面高表达肽类受体的发现， 使得一些短肽可被作为。

10、导向物， 以配体-受体特异性 结合的方式应用于靶向药物递送系统。 利用肽与其受体的特异性结合特性， 将肽与药物结 合形成复合物， 增加药物在体内的选择性， 减少药物的毒副作用， 为提高药物的治疗提供了 可能性， 显示了良好的研究价值和应用前景。 0005 点击化学(Click Chemistry)由化学家巴里夏普莱斯在2001年引入的一个合成 概念， 主旨是通过小单元的拼接， 来快速可靠地完成形形色色的分子的化学合成。 叠氮与炔 基的这类反应属于点击化学的范畴， 其操作简单， 条件温和， 对氧气和水不敏感， 反应具有 立体选择性， 反应效率高， 副产物少， 在生理条件下稳定。 0006 药物载。

11、体的制备过程， 通常较为复杂、 繁琐， 副产物较多而且很难除去。 借助点击 化学反应， 可以实现简便而又高效的制备药物载体。 在制备治疗癌症的前药过程中， 采用 Click反应可以快速高效的将两种不同性质的模块化分子结合起来。 (三)发明内容 0007 本发明目的是克服背景技术存在的问题和缺陷， 提供一种制备还原敏感型多肽前 药的方法， 现有药物载体的制备过程， 通常较为复杂、 繁琐， 副产物较多而且很难除去。 本发 明借助点击化学反应， 可以实现简便而又高效的制备药物载体， 即不同种类的药物分子与 不同种类的多肽化合物通过叠氮与炔基的环化实现不同特性化合物的高效键合， 以制备具 有不同功能性。

12、的多肽前药。 所制备的多肽前药具有环境刺激响应性， 可以提高治疗效率， 降 低治疗的毒副作用。 0008 本发明采用的技术方案是： 说 明 书 1/6 页 3 CN 105560178 B 3 0009 本发明提供一种还原敏感型多肽前药纳米胶束， 所述纳米胶束以疏水药物为内 核， 以细胞穿膜肽为壳层， 所述内核与壳层通过还原敏感型双硫键连接； 所述还原敏感型多 肽前药纳米胶束结构通式为： K10-triazole-SS-DOX， K10为细胞穿膜肽序列， triazole为叠 氮与炔基环化后的三唑五元环， DOX为疏水药物， SS为连接细胞穿膜肽序列与疏水药物的还 原敏感型双硫键。 0010 。

13、进一步， 所述细胞穿膜肽由830个碱性氨基酸缩合而成， 优选10个氨基酸。 0011 进一步， 所述氨基酸包括赖氨酸、 精氨酸或组氨酸， 优选赖氨酸。 0012 进一步， 所述疏水药物包括阿霉素(DOX)、 喜树碱或紫杉醇， 优选阿霉素。 0013 本发明还提供一种所述还原敏感型多肽前药纳米胶束的制备方法， 所述方法为： (1)DOX-SS-alkyne： 将疏水药物溶解在二甲基甲酰胺(DMF)中， 加入三乙胺、 二硫代酸酐， 20 70搅拌0.1h4h后(优选25搅拌反应22min)， 再加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基) 碳二亚胺盐酸盐(EDC)、 N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和丙炔胺，。

14、 室温避光搅拌混匀， 将混合液用 去离子水沉淀， 离心， 沉淀干燥， 得到DOX-SS-alkyne； 所述疏水药物与二硫代二丙酸酐、 三 乙胺物质的量之比为1:0.51.5： 11.2； 所述疏水药物与1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳 二亚胺盐酸盐、 N-羟基琥珀酰亚胺和丙炔胺的物质的量之比为1： 24： 24： 46； 所述二 甲基甲酰胺体积用量以疏水药物物质的量计为100130L/mol； (2)K10-triazole-SS-DOX： 将步骤(1)制备的DOX-SS-alkyne和K10-N3加入二甲基甲酰胺中， 在氮气保护下加入催化剂 碘化亚铜， 2030反应完全后(优选25反应2。

15、4h)， 将反应液用0.0050.020mol/L(优 选0 .013mol/L)乙二胺四乙酸二钠水溶液作为透析液进行透析(优选透析袋(MWCO 1000Da)， 通过乙二胺四乙酸二钠与过渡金属铜离子的络合作用， 以除去铜离子)， 取截留液 冷冻干燥， 得到还原敏感型多肽前药纳米胶束K10-triazole-SS-DOX； 所述K10-N3为末端连接 叠氮的细胞穿膜肽序列； 所述DOX-SS-alkyne与K10-N3物质的量之比为1:0.70.9； 所述催 化剂用量以DOX-SS-alkyne和K10-N3的物质的量之和计为1-6； 所述二甲基甲酰胺体积 用量以DOX-SS-alkyne质量。

16、计为1050ml/g。 0014 进一步， 优选步骤(1)所述疏水药物与二硫代二丙酸酐、 三乙胺物质的量之比为1： 11.2： 11.1(最优选1:0.96： 1.03)； 所述疏水药物与1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二 亚胺盐酸盐、 N-羟基琥珀酰亚胺和丙炔胺的物质的量之比为1： 34： 34： 4.55.5(最优 选1:3.5:3.5:4.8)。 0015 进一步， 优选步骤(2)所述DOX-SS-alkyne与K10-N3物质的量之比为1:0.80.9(最 优选1:0.83)； 所述催化剂用量以DOX-SS-alkyne和K10-N3物质的量之和计为3-5(最优 选4.5)。 001。

17、6 进一步， 优选步骤(2)所述K10-N3通过FMOC多肽方法合成： 先合成侧链带有保护基 的多肽序列， 继而利用同样的方法加入氨基受FMOC保护之后的12-氨基十二酸， 脱去12-氨 基十二酸上的FMOC后， 暴露出活性氨基， 再加入叠氮乙酸， 最后通过多肽固相合成方法合成 K10-N3， 具体步骤是： 0017 (1)取树脂于DMF中， 搅拌、 静置溶胀， 之后， 抽干树脂并用DMF洗涤， 所述DMF的用量 以树脂质量计为1216ml/g。 0018 (2)称取氨基受保护的赖氨酸Fmoc-Lys(Boc)-OH、 N,N-二异丙基乙胺(DIEA)溶于 DMF， 向树脂加入后搅拌， 反应完。

18、成， 抽干树脂并用DMF洗涤。 所述树脂上活性点与Fmoc-Lys 说 明 书 2/6 页 4 CN 105560178 B 4 (Boc)-OH、 DIEA的物质量之比为1： 0.60.8： 0.0120.015； DMF的用量以树脂质量计为 10ml13ml/g。 0019 (3)向树脂中加入DMF、 MeOH和DIEA的混合液， 反应完成之后， 抽干树脂并用DMF洗 涤。 完成对未反应活性Cl的封端。 所述DMF的量以树脂质量计为410ml/g， MeOH的量以树脂 质量计为25ml/g， DIEA的量以树脂质量计为0.061.5ml/g。 0020 (4)向树脂中加入哌啶、 DMF的混。

19、合液， 反应完成后， 抽干树脂并用DMF洗涤。 完成 FMOC保护基的脱除。 所述DMF的量以树脂质量计为2.510ml/g， 哌啶的量以树脂质量计为 1522ml/g。 0021 (5)固相合成下一个赖氨酸： 配制Fmoc-Lys(Boc)-OH、 O-苯并三氮唑-四甲基脲六 氟磷酸盐(HBTU)、 1-羟基苯并三唑(HOBT)、 DIEA的DMF混合液。 向树脂中加入混合液， 搅拌反 应之后， 抽干树脂并用DMF洗涤。 所述树脂上活性点与Fmoc-Lys(Boc)-OH、 HBTU、 HOBT的物质 量之比为1： 35： 79： 79； DIEA的量以树脂质量计为1.52ml/g， DMF。

20、的量以树脂质量计 为2.510ml/g。 0022 (6)茚三酮检测： 取微量树脂与试管中， 加入茚三酮甲醇溶液(茚三酮质量浓度1 5)， 加热试管。 如果茚三酮变成蓝紫色， 则说明第(5)步反应中还有游离的氨基， 须重复 第(5)步， 直到茚三酮检测时， 颜色不变。 0023 重复(4)、 (5)、 (6)步骤完成10肽赖氨酸的合成。 0024 再合成FMOC保护的12氨基十二酸(FMOC-ADDA)。 具体步骤： 取12氨基十二酸 (ADDA)， 溶解于Na2CO3水溶液中， 在-13条件下逐渐滴加二氧六环的FMOC-Cl溶液， 撤 去冰浴， 常温反应3h6h。 旋转蒸发出去溶剂后， 加入。

21、去离子水， 用盐酸调节溶液pH至14 左右。 然后， 利用乙酸乙酯萃取得到FMOC保护的ADDA。 再经无水MgSO4干燥产物过夜， 旋蒸得 到粗产物， 最后利用乙腈重结晶产物两次， 得到纯度很高的FMOC-ADDA.所述ADDA与FMOC-cl 的物质量之比为1： 13.Na2CO3水溶液的质量分数为812， Na2CO3水溶液的量以ADDA 的质量计为2226ml/g， 二氧六环的量以FMOC-cl的质量计为68ml/g。 0025 最后合成叠氮乙酸： 在低温条件下， 向水相中加入叠氮化钠， 溶解完成后， 再向溶 液中逐渐滴加溴乙酸， 冰浴反应2436h。 反应结束后， 再用稀盐酸调节体系。

22、pH值至13， 用 乙醚萃取， 得到产物。 无水MgSO4干燥产物过夜， 旋蒸浓缩得到叠氮乙酸。 所述叠氮化钠与溴 乙酸的物质量之比为1： 12,所述水的量以叠氮化钠的质量计为10-15ml/g。 0026 配制FMOC-ADDA、 HBTU、 HOBT、 DIEA的DMF混合液， 向树脂中加入混合液， 反应1h-2h 后， 抽干树脂并洗涤。 所述树脂上活性点与FMOC-ADDA、 HBTU、 HOBT的物质量之比为1： 35： 7 9： 79， DIEA的量以树脂质量计为1.52ml/g， DMF的量以树脂质量计为2.510ml/g。 0027 重复第(4)步， 之后， 配制叠氮乙酸、 HB。

23、TU、 HOBT、 DIEA的DMF混合液， 向树脂中加入 混合液， 抽干树脂并洗涤。 0028 再重复第(5)步和第(6)步， 直到检验合格。 0029 接着脱去赖氨酸侧基保护基BOC， 同时将产物从树脂上切除。 步骤为， 先配制切落 剂。 向树脂中加入一定量的切落剂， 反应完成后， 抽干树脂并用甲醇洗涤。 收集最终的混合 液， 旋蒸混合液， 并用冰乙醚沉淀， 得到产物， 最后真空干燥。 所述切落剂： 三异丙基硅烷与 水、 三氟乙酸的体积比为1： 12： 3540， 切落剂的量以树脂质量计为1316ml/g。 0030 至此完成了末端带有叠氮的多肽化合物K10-N3的合成。 说 明 书 3/。

24、6 页 5 CN 105560178 B 5 0031 本发明还涉及一种所述还原敏感型多肽前药纳米胶束在制备肿瘤靶向药物中的 应用。 0032 本发明将疏水性药物通过具有还原敏感的双硫键连接上炔基， 然后， 通过多肽固 相合成的方法制备了末端带有叠氮的多肽化合物， 最后在催化剂的作用下， 通过叠氮与炔 基的Click反应制备了一种具有还原敏感的还原敏感型多肽前药纳米胶束。 所述的多肽前 药纳米胶束具有还原敏感型指的是分子中含有的双硫键可在还原剂的作用下断裂， 而在肿 瘤细胞内部， 存在有大量的还原性谷胱甘肽， 所以当前药纳米胶束被动靶向到肿瘤组织时， 在还原性谷胱甘肽的作用下双硫断裂， 释放出。

25、抗癌药物DOX， 从而能明显增加药物在肿瘤部 位的浓度， 提高其生物利用度和治疗效率， 减少其毒副作用。 0033 与现有技术相比， 本发明有益效果主要体现在： 本发明设计出了一种较为简便、 通 用的将两种不同性质的模块化分子结合起来的方法， 即将疏水性药物通过具有还原敏感的 双硫键连接上炔基， 再合成末端带有叠氮的功能性多肽化合物， 最后通过Click反应， 制备 出具有还原敏感型多肽前药纳米胶束。 以本发明为例， 在温和的条件下， 通过Click反应制 备出具有多种功能性的前药纳米胶束， 且从前药的释药情况看， 在不同体外条件下前药表 现出良好的环境响应性。 (四)附图说明 0034 图1。

26、为本发明实施例的DOX-SS-alkyne质谱图； 0035 图2为本发明实施例的K10-N3分子质谱图； 0036 图3为本发明实施例的K10-triazole-SS-DOX合成示意图； 0037 图4为本发明实施例的多肽前药纳米胶束的傅里叶红外光谱图； 0038 图5为本发明实施例的多肽前药纳米胶束的透射电子显微镜(TEM)表征； 0039 图6为本发明实施例的多肽前药纳米胶束的体外释药动力学曲线。 (五)具体实施方式 0040 下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述， 但本发明的保护范围并不仅限于 此： 0041 实施例1 DOX-SS-alkyne的制备 0042 将盐酸阿霉素72 。

27、.2g(0 .135mmol)溶解在DMF 15ml(0 .2mol)中， 加入21l (0.14mmol)三乙胺， 再加入环化的二硫代二丙酸酐(DTDPA)26mg(0.13mmol)。 25搅拌22分 钟后， 陆续加入0.48mmol 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)、 0.48mmol N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)以及44.7 l(0.65)mmol丙炔胺。 室温搅拌4h， 注意避光。 将上述混 合液用去离子水沉淀得到产物， 最后， 经离心、 干燥得到DOX-SS-alkyne。 图1为DOX-SS- alkyne的质谱图。 0043 实施例2 K10-N3的制备。

28、 0044 所述的多肽固相合成末端带有叠氮的多肽化合物的具体步骤是， 多肽固相合成采 用FMOC保护策略， 首先合成侧链受BOC保护的10肽赖氨酸， 具体步骤是： 0045 (1)取0.8g2-氯三苯甲基氯树脂加入10ml DMF后， 25搅拌15min， 再静置溶胀 30min， 之后， 抽干树脂并用DMF洗涤。 说 明 书 4/6 页 6 CN 105560178 B 6 0046 (2)称取0.29g氨基受保护的赖氨酸Fmoc-Lys(Boc)-OH、 2ml N,N-二异丙基乙胺 (DIEA)， 溶于8ml DMF， 加入步骤(1)树脂， 25搅拌1.5h， 抽滤， 滤饼用DMF洗涤。。

29、 其中Fmoc- Lys(Boc)-OH的摩尔量为所加树脂上活性Cl的60。 0047 (3)向步骤(2)滤饼中加入mol(DMF:MeOH:DIEA)6:3:1的混合液20ml后， 25反 应1.5h， 之后， 抽滤， 并用DMF洗涤。 完成对未反应活性Cl的封端。 0048 (4)向步骤(3)滤饼中加入V(哌啶:DMF)1:4的混合液共20ml， 每次加入10ml， 每 次搅拌20min， 25反应完成后， 抽滤， 滤饼用DMF洗涤。 完成FMOC保护基的脱除。 0049 (5)固相合成下一个赖氨酸： 配制2.5mmol Fmoc-Lys(Boc)-OH、 5.9mmol O-苯并三 氮唑。

30、-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)、 5.9mmol 1-羟基苯并三唑(HOBT)、 1.3ml DIEA的8ml DMF混合液。 将混合液加入到树脂中， 25搅拌反应2h， 之后， 抽滤， 并用DMF洗涤。 其中mol (Fmoc-Lys(Boc)-OH:HBTU:HOBT)1:2.4:2.4)。 0050 (6)茚三酮检测： 取步骤(5)中微量树脂于试管中， 加入0.5ml， 20mg/ml的茚三酮甲 醇溶液， 加热试管80约2min。 如果茚三酮变成蓝紫色， 则说明第(5)步反应中还有游离的 氨基， 须重复第(5)步， 直到茚三酮检测时， 颜色不变。 0051 重复(4)、 (5)、 (6。

31、)步骤完成10肽赖氨酸K10的合成。 0052 再合成FMOC保护的12氨基十二酸(FMOC-ADDA)。 具体步骤： 取4.31g 12-氨基十二 酸(ADDA)， 溶解于100ml， 10Na2CO3水溶液中， 在-2条件下逐渐滴加40ml二氧六环的 FMOC-Cl溶液(FMOC-Cl5.18g)， 撤去冰浴， 常温反应4h。 旋转蒸发出去溶剂后， 加入去离子 水， 用盐酸调节溶液pH至3左右。 然后， 利用乙酸乙酯萃取得到FMOC保护的ADDA。 再经无水 MgSO4干燥产物过夜， 旋蒸得到粗产物， 最后利用乙腈重结晶产物两次， 得到纯度很高的 FMOC-ADDA。 0053 最后合成叠。

32、氮乙酸： 在低温条件下， 向水相中加入13g叠氮化钠， 溶解完成后， 再向 溶液中逐渐滴加13.9g溴乙酸， 冰浴反应30h。 反应结束后， 再用稀盐酸调节体系pH值至2， 用 乙醚萃取， 得到产物。 无水MgSO4干燥产物过夜， 旋蒸浓缩得到叠氮乙酸。 0054 配制FMOC-ADDA 1.63g、 HBTU 3.34g、 HOBT 1.2g、 DIEA 1.7ml的DMF混合液15ml， 向 树脂中加入混合液， 反应2h后， 抽干树脂并洗涤。 0055 重复第(4)步， 之后， 配制叠氮乙酸0.34g、 HBTU 3.34g、 HOBT 1.2g、 DIEA 1.7ml的 DMF混合液15。

33、ml， 向树脂中加入混合液， 抽干树脂并洗涤。 0056 再重复第(5)步和第(6)步， 直到检验合格。 0057 接着脱去赖氨酸侧基保护基BOC， 同时将产物从树脂上切除。 步骤为， 先配制切落 剂V(三氟乙酸： N,N-二异丙基硅烷： 水)95:2.5:2.5且1g原始树脂对应切落剂15ml。 向 树脂中加入一定量的切落剂， 反应完成后， 抽干树脂并用甲醇洗涤。 收集最终的混合液， 旋 蒸混合液， 并用冰乙醚沉淀， 得到产物， 最后真空干燥。 0058 至此完成了K10-N3的合成。 图2为K10-N3的质谱图。 0059 实施例3还原敏感型多肽前药的制备 0060 图3为本发明实施例的还。

34、原敏感型多肽前药纳米胶束合成示意图。 其还原敏感型 可以从图3中看出： 分子中含有双硫键， 其可以在癌症组织中还原性谷胱甘肽的作用下， 双 硫键断裂， 释放药物。 药物DOX本身作为疏水的内核， 这样不仅提高了药物的利用率， 也避免 了一些非治疗分子的引入。 亲水性外壳由10肽赖氨酸构成， 其不仅有良好的亲水性， 而且可 说 明 书 5/6 页 7 CN 105560178 B 7 以生物降解， 无毒副作用。 0061 本发明制备还原敏感型多肽前药的具体方法： 0062 向1.2ml DMF中加入23.45mg(0.03mol)实施例1制备的DOX-SS-alkyne和40mg (0 .025。

35、mol)实施例2制备的K10-N3， 两者摩尔比为1 .2:1， 在氮气保护下加入0 .48mg (0.0025mol)催化剂碘化亚铜。 常温(25)反应24h， 之后在含有8g(0.02mol)乙二胺四乙酸 二钠的1.5L水中用MWCO(1000)的透析袋透析3天， 最后取截留液-50冷冻干燥48h， 得到还 原敏感型多肽前药纳米胶束。 图4为多肽前药纳米胶束的傅里叶红外光谱图； 图5为多肽前 药纳米胶束的透射电子显微镜(TEM)表征。 从图中可以看出胶束粒径约为2040nm， 且粒径 分布较为均匀。 0063 实施例4还原敏感型多肽前药纳米胶束的体外释药动力学曲线 0064 本次释药实验共。

36、分为4组不同条件下的实验组。 将实施例3制备的还原敏感型多肽 前药纳米胶束分别用pH为7.4、 浓度为0.1M的PBS磷酸缓冲液配制4份1ml、 0.8mg/ml前药溶 液， 于透析袋(MWCO(1000)中， 将透析袋放于塑料管中并分别加入不同种类的缓冲液。 组1 加入二硫苏糖醇DTT(具有还原性)的PBS溶液5ml， DTT的浓度为10mmol/L， 组2加入木瓜蛋白 酶Papain(可降解多肽)的PBS溶液5ml， Papain活性浓度为20U/ml， 组3加入DTT和Papain的 PBS溶液5ml， DTT的终浓度为10mmol/L， Papain的活性终浓度为20U/ml， 组4加。

37、入5ml pH7.4、 0.1M的PBS。 37条件下， 在摇床上震荡， 分别在0.5h、 2h、 12h之后取出透析袋外部的缓冲液 并保存， 再分别加入对应各自组别的PBS缓冲液5ml。 再用分光光度计进行阿霉素的荧光检 测， 释放的DOX的量通过荧光分光光度计测定其在560nm处的荧光强度(激发波长为480nm)， 利用标准曲线计算， 标准曲线： y-0.096*x2+8.579*x-2.2517， 其中y为荧光强度， x为释药 浓度(单位： g/ml)。 如图6， 较为清晰的看到在还原剂DTT的作用下， 多肽前药具有较快的释 药速度， 而且在Papain存在时， 释药效率更高。 说 明 书 6/6 页 8 CN 105560178 B 8 图1 图2 说 明 书 附 图 1/3 页 9 CN 105560178 B 9 图3 图4 说 明 书 附 图 2/3 页 10 CN 105560178 B 10 图5 图6 说 明 书 附 图 3/3 页 11 CN 105560178 B 11 。