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神经再生剂.pdf

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1、(10)授权公告号 CN 101631542 B (45)授权公告日 2011.12.21 CN 101631542 B *CN101631542B* (21)申请号 200780048401.2 (22)申请日 2007.12.27 355854/2006 2006.12.28 JP A61K 31/232(2006.01) A61P 9/00(2006.01) A61P 19/08(2006.01) A61P 21/04(2006.01) A61P 25/14(2006.01) A61P 25/16(2006.01) A61P 25/18(2006.01) A61P 25/22(2006.。

2、01) A61P 25/24(2006.01) A61P 25/28(2006.01) (73)专利权人三得利控股株式会社地址日本大阪府专利权人国立大学法人东北大学 (72)发明人绀谷昌仙石仓义之大隅典子前川素子 (74)专利代理机构北京信慧永光知识产权代理有限责任公司 11290 代理人张淑珍王维玉 JP 200348831 A,2003.02.21,参见权利要求 1-16. (54) 发明名称神经再生剂 (57) 摘要本发明提供作为有效成分含有花生四烯酸及 / 或以花生四烯酸为结构脂肪酸的化合物而形成的神经再生剂。 (30)优先权数据 (85)PCT申请进入。

3、国家阶段日 2009.06.26 (86)PCT申请的申请数据 PCT/JP2007/075403 2007.12.27 (87)PCT申请的公布数据 WO2008/081989 JA 2008.07.10 (51)Int.Cl. (56)对比文件审查员曾振文 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利权利要求书 1 页说明书 6 页附图 1 页 CN 101631542 B1/1 页 2 1. 花生四烯酸及 / 或以花生四烯酸为结构脂肪酸的化合物在制造具有神经再生作用的药物中的应用，所述药物用于治疗或预防选自统合失调症及发育障碍的神经疾病。 2. 根据权利要求 1 。

4、所述的应用，其用于口服给药。 3.根据权利要求1或2所述的应用，其中，以花生四烯酸为结构脂肪酸的化合物是花生四烯酸的醇酯或结构脂肪酸的一部分或全部为花生四烯酸的三酸甘油酯、磷脂或糖脂。 4. 花生四烯酸及 / 或以花生四烯酸为结构脂肪酸的化合物在制造具有神经再生作用的饮食品中的应用，所述饮食品用于预防选自统合失调症及发育障碍的神经疾病。 5. 根据权利要求 4 所述的应用，其中，以花生四烯酸为结构脂肪酸的化合物是花生四烯酸的醇酯或结构脂肪酸的一部分或全部为花生四烯酸的三酸甘油酯、磷脂或糖脂。权利要求书 CN 101631542 B1/6 页 3 神经再生剂技术。

5、领域 0001 本发明涉及作为有效成分含有花生四烯酸及 / 或以花生四烯酸为结构脂肪酸的化合物而形成的神经再生剂。背景技术 0002 神经疾病 ( 例如帕金森病、阿尔茨海默病、多聚谷氨酰胺疾病 ( 亨丁顿舞蹈症、脊髓小脑变性病等 )、肌肉萎缩性侧索硬化病、多发性神经病、脊髓损伤、脑血管障碍等 ) 是由于增龄、环境、遗传等因素而使脑、末梢神经细胞(神经元)因退化、减少、细胞死亡，或因为受到伤害、脱失而引发疾病。因此，这些神经疾病的治疗中，或补充因神经元损伤而失去的神经递质、或使神经元再生是有效方法。作为神经递质的供给源，有未分化的神经干细胞、可分。

6、化成各种细胞的 ES 细胞等。 0003 但因可分化成神经的内源性神经干细胞极少，又不能充分补充因脑血管障碍等而退化的细胞，所以，必须依赖从外界获取 ( 具体地说，为来自胎儿的神经干细胞、人体 ES 细胞 )，在伦理性和移植抗原性上都存在问题。并且还未确立正确分化目的神经元的技术，也未达到功能性再生。而且，对于再生中枢神经系统的再生医疗也存在因使用流产胎儿脑的方法所引起的问题，所以，未作为一般性利用而被应用。 0004 近年来，有报道指出即使在成体脑的海马等中也能产生新的神经元 ( 将其称为 “神经新生” 或 “神经元新生” )。基于此观点，研究了用药剂等刺激患。

7、者脑内内在的神经干细胞以诱导再生的治疗神经疾病的方法 ( 例如纤维芽细胞增殖因子 -2( 非专利文献 1)、 NGF( 非专利文献 2) 等 )。但是，均需将蛋白质或蛋白因子注入脑内，应用于一般性医疗较为困难，所以，提出了代替此种蛋白质的低分子化合物丹酚酸 B( 专利文献 1)、锂或其药理学上允许的盐 ( 专利文献 2) 等。 0005 此外，最近有如下报道，通过口服给药使母小鼠负荷牛磺酸，并通过母乳使小鼠胎儿负荷时，通过向腹腔内注射 BrdU 以观察神经元的产生，结果证明了海马的神经元新生的增强 ( 非专利文献 3)。还进一步有如下报道，通过向经过 3 代都。

8、缺乏 DHA( 二十二碳六烯酸 ) 的老龄大鼠投给 DHA，也有海马的神经元新生的更新 ( 非专利文献 4)。进而还指出了抑郁症和神经新生降低有关。 0006 另外，对于花生四烯酸及 / 或以花生四烯酸为结构脂肪酸的化合物，证实了其具有改善由脑功能低下引起的症状的作用，具体地说，使老龄动物进行 Morris 水迷宫试验，通过投给花生四烯酸及 / 或以花生四烯酸为结构脂肪酸的化合物可改善伴随增龄引起的学习能力降低 ( 专利文献 3)。 0007 专利文献 1 日本特开 2006-76948 号公报 0008 专利文献 2 国际公开 WO2004/91663 号 pamphle。

9、t 0009 专利文献 3 日本特开 2003-48831 号公报 0010 非专利文献 1Pro.Nat.Acad.Sci.USA.5874-5879(2001) 0011 非专利文献 2Cell.110.429(2002) 说明书 CN 101631542 B2/6 页 4 0012 非专利文献 3 第 173 届必须氨基酸研究协议会计划第 1 页 2003 年 0013 非专利文献 4 Neuroscience.139.991-997(2006) 发明内容 0014 本发明的课题在于提供可容易利用的神经再生剂。 0015 本发明者为解决上述课题进行锐意研究的结果，通过口服给药含有花。

10、生四烯酸的三酸甘油酯 ( 与含有结构脂肪酸的一部分或全部为花生四烯酸的三酸甘油酯的三酸甘油酯含义相同 ) 使母大鼠负荷，并通过母乳使大鼠幼仔负荷时，发现增强了大鼠幼仔的海马神经元的新生。而且，发现该作用对抑郁症、阿尔茨海默型痴呆有效，且比已报道的具有神经元新生效果的 DHA 作用还要显著，从而完成了本发明。 0016 因此，本发明提供作为有效成分含有花生四烯酸及 / 或以花生四烯酸为结构脂肪酸的化合物而形成的神经再生剂。此神经再生剂例如为神经疾病的治疗药物。此神经疾病可例举肌肉萎缩性侧索硬化病、帕金森病、认知症、阿尔茨海默病、脑血管障碍、脑中风、脊髓损伤。

11、、亨丁顿舞蹈症、焦虑障碍、统合失调症、抑郁症、躁郁病、发育障碍、注意缺陷多动障碍、学习障碍等。 0017 上述神经再生剂优选用于口服给药。 0018 所述以花生四烯酸为结构脂肪酸的化合物例如是花生四烯酸的醇酯或结构脂肪酸的一部分或全部为花生四烯酸的三酸甘油酯、磷脂或糖脂。附图说明 0019 图1是比较摄取不添加花生四烯酸的饲料的大鼠(对照)、摄取添加了花生四烯酸的饲料的大鼠和摄取添加了二十二碳六烯酸的饲料的大鼠中神经元新生的图。具体实施方式 0020 本发明涉及作为有效成分含有花生四烯酸及 / 或以花生四烯酸为结构脂肪酸的化合物而形成的神经再生剂。 0021 本。

12、发明的神经再生剂不仅对人，对非人类的动物也非常有用。在此，非人类的动物指农场动物、宠物及实验动物，更详细地说，农场动物指牛、马、猪、山羊、绵羊等的家畜、赛马、猎犬等，宠物指狗、猫、狨猴、仓鼠等，实验动物指小鼠、大鼠、豚鼠、比格犬、迷你猪、猕猴、食蟹猴等可共用于医学、生物学、农学、药学等领域进行研究的动物，但不限于此。优选的非人类的动物为狗或猫等作为宠物饲养的宠物动物。 0022 本发明的神经再生剂具有作用于人体或动物的脑内神经干细胞以促进神经元新生从而使脑内的神经元增加的作用 ( 本说明书中，有时也称为神经元新生促进剂 )。本发明。

13、的神经再生剂可作为伴随神经变性或损伤的神经疾病的预防及 / 或治疗剂使用。所述神经疾病不仅可例举帕金森病、认知症、阿尔茨海默病、多聚谷氨酰胺疾病 ( 亨丁顿舞蹈症、脊髓小脑变性病等 )、肌肉萎缩性侧索硬化病、多发性神经病、脊髓损伤、脑血管障碍、脑中风等伴随神经变性的疾病，还可例举焦虑障碍、统合失调症、抑郁症及躁郁病等不伴随神经变性的疾病、发育障碍 ( 广泛性发育障碍 (pervasive developmental disorders， PDD)、注意缺陷多动障碍 (Attention Deficit/Hyperactivity Disorder， AD/HD。

14、)、学习障说明书 CN 101631542 B3/6 页 5 碍 (Learning Disorder， LD) 等 ) 等。 0023 本发明的神经再生剂可将花生四烯酸及 / 或以花生四烯酸为结构脂肪酸的化合物直接单独使用，但优选作为通常的各种医疗制剂来提供。作为医疗制剂提供时，可与药理学上允许的一种或一种以上的任意成分混合后制成制剂。制剂化的方法可根据该技术领域中常用的方法、例如日本药局方中记载的方法或依据上述方法的方法来进行制造。 0024 作为医疗制剂使用时，其给药方式只要是治疗时最有效均可使用，可选择口服或例如静脉内给药等的非口服方式，但最优选口服给药。

15、。给药形态可适当选择肠内营养剂、粉末、颗粒、片剂、胶囊、含片、内服液、悬浮液、乳液、糖浆剂、注射剂等。 0025 以本发明作为医疗制剂使用时，作为有效成分的花生四烯酸及 / 或以花生四烯酸为结构脂肪酸的化合物的配合量，只要能实现本发明的目的无特别限定，可适当以适合的配比使用。而且此医疗制剂的给药量因年龄、体重、症状、给药次数等而不同，例如，成人 ( 约 60kg) 每天的给药量：将本发明的花生四烯酸及以花生四烯酸为结构脂肪酸的化合物用花生四烯酸量换算，通常为约0.00110g、优选约0.011g、更优选约0.050.5g、最优选约 0。

16、.1 0.3g，可 1 天给药 1 3 次。 0026 因本发明的神经再生剂可通过口服给药发挥其效果，所以也可将花生四烯酸及 / 或以花生四烯酸为结构脂肪酸的化合物单独、或与实质上不含有花生四烯酸或即使含有也极少的饮食品原料一同配合，作为具有神经疾病的预防或改善作用的饮食品来提供。 0027 在此，饮食品除一般食品外，可例举功能性食品、特定保健用食品、营养补助食品、早产儿配方乳、婴儿配方乳、婴儿食品、孕产妇食品或老人食品、包含宠物营养强化剂 ( 动物营养补助食品 ) 的动物用饮食品等。此外该饮食品中还包含以下饮食品，将神经疾病的预防及 / 或改善作用，具体地。

17、说是将具有预防改善情绪障碍 ( 例如抑郁症等 )、智力障碍 ( 例如阿尔茨海默型痴呆、脑血管性痴呆 )、预防健忘、预防认知症、脑年龄的返老还童等作用的事项在该食品组合物的包装用容器及/或为促进该食品组合物销售的用具(例如手册等 ) 中记载或表示等而进行销售的饮食品。 0028 所述饮食品可作为以下食品使用，含有油脂的食品，例如肉、鱼或果仁等本身就含有油脂的天然食品；汤等在制作时加入油脂的食品；炸面圈等用油脂作热介质的食品；黄油等油脂食品；曲奇等在加工时加入油脂的加工食品；或硬饼干等在加工完成时用油脂喷雾或涂布的食品等，还可添加在不含油脂的农产食。

18、品、发酵食品、畜产食品、水产食品或饮料中，其使用形态无任何限制。因此，也可含有通常可用于各种食品的添加剂等。特别是以防止本发明的有效成分的氧化变质为目的，最好含有抗氧化剂。 0029 作为抗氧化剂，例如可例举维生素 E 类、黄酮衍生物、叶甜素类、曲酸、没食子酸衍生物、儿茶素类、蜂斗酸 (Fukiic Acid)、棉酚、吡嗪衍生物、芝麻木脂素类 ( 芝麻素、表芝麻素、芝麻素酚 (sesaminol)、芝麻酚 (sesamol) 等 )、愈创木酚、愈创木脂、对香豆酸、去甲二氢愈创木酸、固醇类、萜类、核酸碱基类、类胡萝卜素类、木脂素类。

19、等的天然抗氧化剂及以抗坏血酸棕榈酸酯、抗坏血酸硬脂酸酯、丁基羟基茴香醚 (BHA)、丁基羟基甲苯 (BHT)、单叔丁基氢醌 (Mono-tert-Butylhydroquinone)(TBHQ)、 4- 羟甲基 -2， 6- 二叔丁基苯酚 (HMBP) 为代表的合成抗氧化剂。 0030 维生素 E 类可例举 - 维生素 E、 - 维生素 E、 - 维生素 E、 - 维生素 E、 - 维生素 E、 - 维生素 E、 - 维生素 E 及维生素 E 酯 ( 维生素 E 醋酸酯等 ) 等。且类胡萝卜素说明书 CN 101631542 B4/6 页 6 类例如可例举 - 胡萝卜素、。

20、斑蝥黄素、虾青素等。 0031 除上述抗氧化剂以外，还可例举助溶剂、缓冲剂、促溶剂、胶凝剂、悬浮剂、小麦粉、米粉、淀粉、玉米淀粉、多糖类、牛奶蛋白、胶原蛋白、米油、卵磷脂、各种添加剂 ( 例如维生素类、甜味料、有机酸、着色剂、香料、防湿剂、纤维、电解质、矿物质、营养素、抗氧化剂、保存剂、芳香剂、润湿剂、天然的食物提取物、蔬菜提取物 ) 等，但并不限定于上述物质。 0032 花生四烯酸及以花生四烯酸为结构脂肪酸的化合物的主要药效成分在于花生四烯酸。有报道指出饮食中的花生四烯酸的每天摄取量在关东地区为 0.14g，关西地区为。

21、 0.19 0.20g( 脂质营养学 4， 73-82， 1995)，从高龄者对油脂摄取量降低、胰脂肪酶活性降低等方面来看，需摄取相当的量，进而需要摄取其以上的花生四烯酸。因此，本发明的花生四烯酸及以花生四烯酸为结构脂肪酸的化合物的成人 ( 例如体重 60kg) 每天的摄取量，用花生四烯酸换算可为 0.001g 10g，优选约 0.01 1g，更优选约 0.05 0.5g，最优选约 0.1 0.3g。 0033 已知作为脑磷脂膜的主要脂肪酸为花生四烯酸及二十二碳六烯酸。也已报道了二十二碳六烯酸对阿尔茨海默型痴呆很有效，且在动物试验中通过摄取二十二碳六烯酸而具有神经。

22、元新生效果(非专利文献4)。但该动物试验的结果是经过3代都用缺乏二十二碳六烯酸的饲料饲养后，通过观察二十二碳六烯酸给药结果所观察到的现象，很难说是通常的状态。但是，本发明者用出生后不久的幼龄大鼠，在通常的饲养条件下，使用配合了花生四烯酸的饲料、配合了二十二碳六烯酸的饲料分别使幼龄大鼠通过母乳摄取时，发现在摄取配合了花生四烯酸的饲料的幼龄大鼠的脑内 ( 海马 ) 具有显著的神经元新生作用。 0034 本发明的神经元新生促进作用及神经疾病治疗效果可使用以下的神经元检测方法评价。 0035 将可表达可标记增殖细胞的溴脱氧尿嘧啶核苷 (BrdU)、或绿色荧光蛋白 (Gree。

23、n Fluorescent Protein)(GFP)、 - 半乳糖苷酶等可标记细胞的基因的反转录病毒载体在与该物质最初给药同时、给药前或给药后投给实验动物后，将该物质一天一次乃至数次给药，共饲养 7 28 天。而后，将该实验动物通过灌流固定后摘出脑，制作脑的冷冻切片，用荧光显微镜观察，例如作为标记增殖细胞的药剂使用BrdU时，将每单位面积的BrdU阳性细胞数及相对于 BrdU 阳性细胞数的作为神经元标记的 NeuN、 Calretinin、 Calbindin、 Tuj1 阳性细胞数的比例与阴性对照比较。 0036 实施例 0037 以下，根据实施例进一步具体说明本。

24、发明，但本发明不限于以下实施例。 0038 参考例 1 ：含有花生四烯酸的三酸甘油酯的制造 0039 花生四烯酸生产菌使用高山被孢霉 (Mortierella alpina)CBS754.68。在 10kL 培养槽中配制含有葡萄糖 1.8、脱脂大豆粉 3.1、大豆油 0.1、 KH2PO40.3、 Na2SO4 0.1、 CaCl22H2O 0.05及 MgCl26H2O 0.05的培养基 6kL，将初始 pH 值调整到 6.0。 0040 接种前培养液 30L，在温度 26、通气量 360m3/ 小时、槽内压力 200kPa 的条件下进行 8 天的通气搅拌培养。而且调整搅拌。

25、数，将溶解氧浓度维持在 10 15ppm。进而将葡萄糖浓度通过流加法调整，使到第 4 天为止的培养基中的葡萄糖浓度为 1 2.5的范围，其后维持在 0.5 1 ( 上述为质量 (w/v) )。培养结束后，通过过滤、干燥，回收含有含花生四烯酸的三酸甘油酯的菌体，用己烷从所得到的菌体中提取油脂，经过食用油脂的说明书 CN 101631542 B5/6 页 7 精制过程 ( 脱胶、脱酸、脱臭、脱色 )，得到含有花生四烯酸的三酸甘油酯 ( 花生四烯酸与三酸甘油酯的任意位置结合 )150kg。 0041 将所得到的油脂 ( 三酸甘油酯 ) 进行甲酯化，将得到的脂肪酸。

26、甲酯用气相色谱法分析时，花生四烯酸占总脂肪酸的比例为 40.84 质量。且棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、 -亚麻酸、二高-亚麻酸等分别为11.63、 7.45、 7.73、 9.14、 2.23、 3.27质量。进一步将上述含有花生四烯酸的油脂 ( 三酸甘油酯 ) 进行甲酯化，从含有 40 质量的花生四烯酸乙酯的脂肪酸乙酯混合物中，通过通用的高效液相色谱法分离纯化 99 质量的花生四烯酸乙酯，以制造含有花生四烯酸的三酸甘油酯 (SUNTGA40S)。 0042 实施例 1. 摄取含有花生四烯酸的油脂对幼龄动物的海马神经细胞新生的效果 0043 作为幼龄动物，使用出。

27、生后第 2 天的大鼠。将 30 只幼龄大鼠分成对照饲料摄取组 (10只： Control)、花生四烯酸配合饲料摄取组(10只： ARA)和DHA配合饲料摄取组(10只： DHA)3 组，在各个组中给与表 1 所示的对照饲料、 SUNTGA40S 配合饲料 ( 实施例 1 制造品 )、含有DHA的油脂配合饲料，饲养4周。配合饲料时使花生四烯酸配合饲料中的花生四烯酸量及 DHA 配合饲料中的 DHA 量为等量。且因一直到出生后第 3 周幼兽都不能直接摄食饲料，所以向母兽投给饲料 ( 自由摄取 )，使幼兽 ( 幼龄大鼠 ) 通过母乳摄取花生四烯酸。 0044 饲养 4 周后，。

28、向幼龄大鼠的腹腔内注射 BrdU( 溴脱氧尿嘧啶核苷 )50mg/kg， 1 天 3 次。次日摘出脑，制备向吻尾方向的海马全范围的冷冻切片，使用抗 BrdU 抗体进行免疫染色，用荧光显微镜观察。均等取出全部冷冻切片中的 1/6，对海马齿状回神经新生区的 BrdU 标记细胞数进行计数，将其总计乘以 6 倍来计算出海马整体中所含有的 BrdU 标记细胞数，分析神经干细胞及神经前驱细胞的增殖能力。 0045 表 1 0046 表 1 0047 0048 图 1 表示幼龄大鼠的各种测定结果。证明与对照饲料摄取组 (Control)、 DHA 配合饲料摄取组 (DHA) 相比，花生四烯。

29、酸配合饲料摄取组 (ARA) 中有神经元新生 ( 神经元新生能力增强 )。求出各组平均值，结果显示，以对照饲料摄取组中 BrdU 吸收为 100时，花生四烯酸配合饲料摄取组中为 133，为显著增加。说明书 CN 101631542 B6/6 页 8 0049 本发明的神经再生剂或神经干细胞的神经元新生促进剂以口服给药为特征。因不需要如同以往的进行脑内注入的外科操作，所以容易利用。此外，从口服给药的形式上来看，不仅可作为神经疾病对症疗法的治疗药物，从预防医疗的观点来看也可发挥效果，可提供用于神经疾病预防的新型组合物。说明书 CN 101631542 B1/1 页 9 图 1 说明书附图。

摘要
申请专利号：	CN200780048401.2	申请日：	20071227
公开号：	CN101631542B	公开日：	20111221
当前法律状态：		有效性：	有效
法律详情：
IPC分类号：	A61K31/232,A61P9/00,A61P19/08,A61P21/04,A61P25/14,A61P25/16,A61P25/18,A61P25/22,A61P25/24,A61P25/28	主分类号：	A61K31/232,A61P9/00,A61P19/08,A61P21/04,A61P25/14,A61P25/16,A61P25/18,A61P25/22,A61P25/24,A61P25/28
申请人：	三得利控股株式会社,国立大学法人东北大学
发明人：	绀谷昌仙,石仓义之,大隅典子,前川素子
地址：	日本大阪府
优先权：	355854/2006
专利代理机构：	北京信慧永光知识产权代理有限责任公司	代理人：	张淑珍;王维玉
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内容摘要

本发明提供作为有效成分含有花生四烯酸及/或以花生四烯酸为结构脂肪酸的化合物而形成的神经再生剂。

权利要求书

1.花生四烯酸及/或以花生四烯酸为结构脂肪酸的化合物在制造具有神经再生作用的药物中的应用，所述药物用于治疗或预防选自统合失调症及发育障碍的神经疾病。 2.根据权利要求1所述的应用，其用于口服给药。 3.根据权利要求1或2所述的应用，其中，以花生四烯酸为结构脂肪酸的化合物是花生四烯酸的醇酯或结构脂肪酸的一部分或全部为花生四烯酸的三酸甘油酯、磷脂或糖脂。 4.花生四烯酸及/或以花生四烯酸为结构脂肪酸的化合物在制造具有神经再生作用的饮食品中的应用，所述饮食品用于预防选自统合失调症及发育障碍的神经疾病。 5.根据权利要求4所述的应用，其中，以花生四烯酸为结构脂肪酸的化合物是花生四烯酸的醇酯或结构脂肪酸的一部分或全部为花生四烯酸的三酸甘油酯、磷脂或糖脂。

说明书

技术领域

本发明涉及作为有效成分含有花生四烯酸及/或以花生四烯酸为结构脂肪酸的化合物而形成的神经再生剂。

背景技术

神经疾病(例如帕金森病、阿尔茨海默病、多聚谷氨酰胺疾病(亨丁顿舞蹈症、脊髓小脑变性病等)、肌肉萎缩性侧索硬化病、多发性神经病、脊髓损伤、脑血管障碍等)是由于增龄、环境、遗传等因素而使脑、末梢神经细胞(神经元)因退化、减少、细胞死亡，或因为受到伤害、脱失而引发疾病。因此，这些神经疾病的治疗中，或补充因神经元损伤而失去的神经递质、或使神经元再生是有效方法。作为神经递质的供给源，有未分化的神经干细胞、可分化成各种细胞的ES细胞等。

但因可分化成神经的内源性神经干细胞极少，又不能充分补充因脑血管障碍等而退化的细胞，所以，必须依赖从外界获取(具体地说，为来自胎儿的神经干细胞、人体ES细胞)，在伦理性和移植抗原性上都存在问题。并且还未确立正确分化目的神经元的技术，也未达到功能性再生。而且，对于再生中枢神经系统的再生医疗也存在因使用流产胎儿脑的方法所引起的问题，所以，未作为一般性利用而被应用。

近年来，有报道指出即使在成体脑的海马等中也能产生新的神经元(将其称为“神经新生”或“神经元新生”)。基于此观点，研究了用药剂等刺激患者脑内内在的神经干细胞以诱导再生的治疗神经疾病的方法(例如纤维芽细胞增殖因子-2(非专利文献1)、NGF(非专利文献2)等)。但是，均需将蛋白质或蛋白因子注入脑内，应用于一般性医疗较为困难，所以，提出了代替此种蛋白质的低分子化合物丹酚酸B(专利文献1)、锂或其药理学上允许的盐(专利文献2)等。

此外，最近有如下报道，通过口服给药使母小鼠负荷牛磺酸，并通过母乳使小鼠胎儿负荷时，通过向腹腔内注射BrdU以观察神经元的产生，结果证明了海马的神经元新生的增强(非专利文献3)。还进一步有如下报道，通过向经过3代都缺乏DHA(二十二碳六烯酸)的老龄大鼠投给DHA，也有海马的神经元新生的更新(非专利文献4)。进而还指出了抑郁症和神经新生降低有关。

另外，对于花生四烯酸及/或以花生四烯酸为结构脂肪酸的化合物，证实了其具有改善由脑功能低下引起的症状的作用，具体地说，使老龄动物进行Morris水迷宫试验，通过投给花生四烯酸及/或以花生四烯酸为结构脂肪酸的化合物可改善伴随增龄引起的学习能力降低(专利文献3)。

专利文献1日本特开2006-76948号公报

专利文献2国际公开WO2004/91663号pamphlet

专利文献3日本特开2003-48831号公报

非专利文献1Pro.Nat.Acad.Sci.USA.5874-5879(2001)

非专利文献2Cell.110.429(2002)

非专利文献3第173届必须氨基酸研究协议会计划第1页2003年

非专利文献4 Neuroscience.139.991-997(2006)

发明内容

本发明的课题在于提供可容易利用的神经再生剂。

本发明者为解决上述课题进行锐意研究的结果，通过口服给药含有花生四烯酸的三酸甘油酯(与含有结构脂肪酸的一部分或全部为花生四烯酸的三酸甘油酯的三酸甘油酯含义相同)使母大鼠负荷，并通过母乳使大鼠幼仔负荷时，发现增强了大鼠幼仔的海马神经元的新生。而且，发现该作用对抑郁症、阿尔茨海默型痴呆有效，且比已报道的具有神经元新生效果的DHA作用还要显著，从而完成了本发明。

因此，本发明提供作为有效成分含有花生四烯酸及/或以花生四烯酸为结构脂肪酸的化合物而形成的神经再生剂。此神经再生剂例如为神经疾病的治疗药物。此神经疾病可例举肌肉萎缩性侧索硬化病、帕金森病、认知症、阿尔茨海默病、脑血管障碍、脑中风、脊髓损伤、亨丁顿舞蹈症、焦虑障碍、统合失调症、抑郁症、躁郁病、发育障碍、注意缺陷多动障碍、学习障碍等。

上述神经再生剂优选用于口服给药。

所述以花生四烯酸为结构脂肪酸的化合物例如是花生四烯酸的醇酯或结构脂肪酸的一部分或全部为花生四烯酸的三酸甘油酯、磷脂或糖脂。

附图说明

图1是比较摄取不添加花生四烯酸的饲料的大鼠(对照)、摄取添加了花生四烯酸的饲料的大鼠和摄取添加了二十二碳六烯酸的饲料的大鼠中神经元新生的图。

具体实施方式

本发明涉及作为有效成分含有花生四烯酸及/或以花生四烯酸为结构脂肪酸的化合物而形成的神经再生剂。

本发明的神经再生剂不仅对人，对非人类的动物也非常有用。在此，非人类的动物指农场动物、宠物及实验动物，更详细地说，农场动物指牛、马、猪、山羊、绵羊等的家畜、赛马、猎犬等，宠物指狗、猫、狨猴、仓鼠等，实验动物指小鼠、大鼠、豚鼠、比格犬、迷你猪、猕猴、食蟹猴等可共用于医学、生物学、农学、药学等领域进行研究的动物，但不限于此。优选的非人类的动物为狗或猫等作为宠物饲养的宠物动物。

本发明的神经再生剂具有作用于人体或动物的脑内神经干细胞以促进神经元新生从而使脑内的神经元增加的作用(本说明书中，有时也称为神经元新生促进剂)。本发明的神经再生剂可作为伴随神经变性或损伤的神经疾病的预防及/或治疗剂使用。所述神经疾病不仅可例举帕金森病、认知症、阿尔茨海默病、多聚谷氨酰胺疾病(亨丁顿舞蹈症、脊髓小脑变性病等)、肌肉萎缩性侧索硬化病、多发性神经病、脊髓损伤、脑血管障碍、脑中风等伴随神经变性的疾病，还可例举焦虑障碍、统合失调症、抑郁症及躁郁病等不伴随神经变性的疾病、发育障碍(广泛性发育障碍(pervasive developmental disorders，PDD)、注意缺陷多动障碍(Attention Deficit/Hyperactivity Disorder，AD/HD)、学习障碍(Learning Disorder，LD)等)等。

本发明的神经再生剂可将花生四烯酸及/或以花生四烯酸为结构脂肪酸的化合物直接单独使用，但优选作为通常的各种医疗制剂来提供。作为医疗制剂提供时，可与药理学上允许的一种或一种以上的任意成分混合后制成制剂。制剂化的方法可根据该技术领域中常用的方法、例如日本药局方中记载的方法或依据上述方法的方法来进行制造。

作为医疗制剂使用时，其给药方式只要是治疗时最有效均可使用，可选择口服或例如静脉内给药等的非口服方式，但最优选口服给药。给药形态可适当选择肠内营养剂、粉末、颗粒、片剂、胶囊、含片、内服液、悬浮液、乳液、糖浆剂、注射剂等。

以本发明作为医疗制剂使用时，作为有效成分的花生四烯酸及/或以花生四烯酸为结构脂肪酸的化合物的配合量，只要能实现本发明的目的无特别限定，可适当以适合的配比使用。而且此医疗制剂的给药量因年龄、体重、症状、给药次数等而不同，例如，成人(约60kg)每天的给药量：将本发明的花生四烯酸及以花生四烯酸为结构脂肪酸的化合物用花生四烯酸量换算，通常为约0.001～10g、优选约0.01～1g、更优选约0.05～0.5g、最优选约0.1～0.3g，可1天给药1～3次。

因本发明的神经再生剂可通过口服给药发挥其效果，所以也可将花生四烯酸及/或以花生四烯酸为结构脂肪酸的化合物单独、或与实质上不含有花生四烯酸或即使含有也极少的饮食品原料一同配合，作为具有神经疾病的预防或改善作用的饮食品来提供。

在此，饮食品除一般食品外，可例举功能性食品、特定保健用食品、营养补助食品、早产儿配方乳、婴儿配方乳、婴儿食品、孕产妇食品或老人食品、包含宠物营养强化剂(动物营养补助食品)的动物用饮食品等。此外该饮食品中还包含以下饮食品，将神经疾病的预防及/或改善作用，具体地说是将具有预防·改善情绪障碍(例如抑郁症等)、智力障碍(例如阿尔茨海默型痴呆、脑血管性痴呆)、预防健忘、预防认知症、脑年龄的返老还童等作用的事项在该食品组合物的包装用容器及/或为促进该食品组合物销售的用具(例如手册等)中记载或表示等而进行销售的饮食品。

所述饮食品可作为以下食品使用，含有油脂的食品，例如肉、鱼或果仁等本身就含有油脂的天然食品；汤等在制作时加入油脂的食品；炸面圈等用油脂作热介质的食品；黄油等油脂食品；曲奇等在加工时加入油脂的加工食品；或硬饼干等在加工完成时用油脂喷雾或涂布的食品等，还可添加在不含油脂的农产食品、发酵食品、畜产食品、水产食品或饮料中，其使用形态无任何限制。因此，也可含有通常可用于各种食品的添加剂等。特别是以防止本发明的有效成分的氧化变质为目的，最好含有抗氧化剂。

作为抗氧化剂，例如可例举维生素E类、黄酮衍生物、叶甜素类、曲酸、没食子酸衍生物、儿茶素类、蜂斗酸(Fukiic Acid)、棉酚、吡嗪衍生物、芝麻木脂素类(芝麻素、表芝麻素、芝麻素酚(sesaminol)、芝麻酚(sesamol)等)、愈创木酚、愈创木脂、对香豆酸、去甲二氢愈创木酸、固醇类、萜类、核酸碱基类、类胡萝卜素类、木脂素类等的天然抗氧化剂及以抗坏血酸棕榈酸酯、抗坏血酸硬脂酸酯、丁基羟基茴香醚(BHA)、丁基羟基甲苯(BHT)、单叔丁基氢醌(Mono-tert-Butylhydroquinone)(TBHQ)、4-羟甲基-2，6-二叔丁基苯酚(HMBP)为代表的合成抗氧化剂。

维生素E类可例举α-维生素E、β-维生素E、γ-维生素E、δ-维生素E、ε-维生素E、ζ-维生素E、η-维生素E及维生素E酯(维生素E醋酸酯等)等。且类胡萝卜素类例如可例举β-胡萝卜素、斑蝥黄素、虾青素等。

除上述抗氧化剂以外，还可例举助溶剂、缓冲剂、促溶剂、胶凝剂、悬浮剂、小麦粉、米粉、淀粉、玉米淀粉、多糖类、牛奶蛋白、胶原蛋白、米油、卵磷脂、各种添加剂(例如维生素类、甜味料、有机酸、着色剂、香料、防湿剂、纤维、电解质、矿物质、营养素、抗氧化剂、保存剂、芳香剂、润湿剂、天然的食物提取物、蔬菜提取物)等，但并不限定于上述物质。

花生四烯酸及以花生四烯酸为结构脂肪酸的化合物的主要药效成分在于花生四烯酸。有报道指出饮食中的花生四烯酸的每天摄取量在关东地区为0.14g，关西地区为0.19～0.20g(脂质营养学4，73-82，1995)，从高龄者对油脂摄取量降低、胰脂肪酶活性降低等方面来看，需摄取相当的量，进而需要摄取其以上的花生四烯酸。因此，本发明的花生四烯酸及以花生四烯酸为结构脂肪酸的化合物的成人(例如体重60kg)每天的摄取量，用花生四烯酸换算可为0.001g～10g，优选约0.01～1g，更优选约0.05～0.5g，最优选约0.1～0.3g。

已知作为脑磷脂膜的主要脂肪酸为花生四烯酸及二十二碳六烯酸。也已报道了二十二碳六烯酸对阿尔茨海默型痴呆很有效，且在动物试验中通过摄取二十二碳六烯酸而具有神经元新生效果(非专利文献4)。但该动物试验的结果是经过3代都用缺乏二十二碳六烯酸的饲料饲养后，通过观察二十二碳六烯酸给药结果所观察到的现象，很难说是通常的状态。但是，本发明者用出生后不久的幼龄大鼠，在通常的饲养条件下，使用配合了花生四烯酸的饲料、配合了二十二碳六烯酸的饲料分别使幼龄大鼠通过母乳摄取时，发现在摄取配合了花生四烯酸的饲料的幼龄大鼠的脑内(海马)具有显著的神经元新生作用。

本发明的神经元新生促进作用及神经疾病治疗效果可使用以下的神经元检测方法评价。

将可表达可标记增殖细胞的溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)、或绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protein)(GFP)、β-半乳糖苷酶等可标记细胞的基因的反转录病毒载体在与该物质最初给药同时、给药前或给药后投给实验动物后，将该物质一天一次乃至数次给药，共饲养7～28天。而后，将该实验动物通过灌流固定后摘出脑，制作脑的冷冻切片，用荧光显微镜观察，例如作为标记增殖细胞的药剂使用BrdU时，将每单位面积的BrdU阳性细胞数及相对于BrdU阳性细胞数的作为神经元标记的NeuN、Calretinin、Calbindin、Tuj1阳性细胞数的比例与阴性对照比较。

实施例

以下，根据实施例进一步具体说明本发明，但本发明不限于以下实施例。

参考例1：含有花生四烯酸的三酸甘油酯的制造

花生四烯酸生产菌使用高山被孢霉(Mortierella alpina)CBS754.68。在10kL培养槽中配制含有葡萄糖1.8％、脱脂大豆粉3.1％、大豆油0.1％、KH2PO40.3％、Na2SO4 0.1％、CaCl2·2H2O 0.05％及MgCl2·6H2O 0.05％的培养基6kL，将初始pH值调整到6.0。

接种前培养液30L，在温度26℃、通气量360m3/小时、槽内压力200kPa的条件下进行8天的通气搅拌培养。而且调整搅拌数，将溶解氧浓度维持在10～15ppm。进而将葡萄糖浓度通过流加法调整，使到第4天为止的培养基中的葡萄糖浓度为1～2.5％的范围，其后维持在0.5～1％(上述％为质量(w/v)％)。培养结束后，通过过滤、干燥，回收含有含花生四烯酸的三酸甘油酯的菌体，用己烷从所得到的菌体中提取油脂，经过食用油脂的精制过程(脱胶、脱酸、脱臭、脱色)，得到含有花生四烯酸的三酸甘油酯(花生四烯酸与三酸甘油酯的任意位置结合)150kg。

将所得到的油脂(三酸甘油酯)进行甲酯化，将得到的脂肪酸甲酯用气相色谱法分析时，花生四烯酸占总脂肪酸的比例为40.84质量％。且棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、γ-亚麻酸、二高-γ-亚麻酸等分别为11.63、7.45、7.73、9.14、2.23、3.27质量％。进一步将上述含有花生四烯酸的油脂(三酸甘油酯)进行甲酯化，从含有40质量％的花生四烯酸乙酯的脂肪酸乙酯混合物中，通过通用的高效液相色谱法分离·纯化99质量％的花生四烯酸乙酯，以制造含有花生四烯酸的三酸甘油酯(SUNTGA40S)。

实施例1.摄取含有花生四烯酸的油脂对幼龄动物的海马神经细胞新生的效果

作为幼龄动物，使用出生后第2天的大鼠。将30只幼龄大鼠分成对照饲料摄取组(10只：Control)、花生四烯酸配合饲料摄取组(10只：ARA)和DHA配合饲料摄取组(10只：DHA)3组，在各个组中给与表1所示的对照饲料、SUNTGA40S配合饲料(实施例1制造品)、含有DHA的油脂配合饲料，饲养4周。配合饲料时使花生四烯酸配合饲料中的花生四烯酸量及DHA配合饲料中的DHA量为等量。且因一直到出生后第3周幼兽都不能直接摄食饲料，所以向母兽投给饲料(自由摄取)，使幼兽(幼龄大鼠)通过母乳摄取花生四烯酸。

饲养4周后，向幼龄大鼠的腹腔内注射BrdU(溴脱氧尿嘧啶核苷)50mg/kg，1天3次。次日摘出脑，制备向吻尾方向的海马全范围的冷冻切片，使用抗BrdU抗体进行免疫染色，用荧光显微镜观察。均等取出全部冷冻切片中的1/6，对海马齿状回神经新生区的BrdU标记细胞数进行计数，将其总计乘以6倍来计算出海马整体中所含有的BrdU标记细胞数，分析神经干细胞及神经前驱细胞的增殖能力。

表1

图1表示幼龄大鼠的各种测定结果。证明与对照饲料摄取组(Control)、DHA配合饲料摄取组(DHA)相比，花生四烯酸配合饲料摄取组(ARA)中有神经元新生(神经元新生能力增强)。求出各组平均值，结果显示，以对照饲料摄取组中BrdU吸收为100％时，花生四烯酸配合饲料摄取组中为133％，为显著增加。

本发明的神经再生剂或神经干细胞的神经元新生促进剂以口服给药为特征。因不需要如同以往的进行脑内注入的外科操作，所以容易利用。此外，从口服给药的形式上来看，不仅可作为神经疾病对症疗法的治疗药物，从预防医疗的观点来看也可发挥效果，可提供用于神经疾病预防的新型组合物。