技术领域
本发明涉及制药领域，具体涉及一种鼠妇提取物及其应用。
背景技术
血栓是三大致死性心血管疾病（心脏病、中风和静脉血栓栓塞症）的根源，发病率较高，在全球范围内呈现渐增之势。国际血栓与止血学会提供的资料显示，在美国，每年有10万-30万人死于静脉血栓；在欧洲，每年有50万人死于静脉血栓，超过艾滋病、乳腺癌、前列腺癌和高速公路交通事故死亡人数之和；在中国，因血栓性疾病及其并发症死亡的人数也众多。目前，临床应用的抗栓药物虽然能大幅度降低死亡率和致残率，但是这些溶栓药物仍然存在缺点，诸如出血副作用大，剂量难以控制，可能出现再阻塞和再梗死 。此外，在临床治疗血栓性疾病过程中，一般先使用溶栓药物将已经形成的血栓溶解，然后使用抗凝药物，避免血栓再次形成。然而，目前市场上很少有药物同时具有溶栓和抗凝作用，因此，寻找一种副作用小，避免再阻塞和再梗死的溶栓抗凝药物势在必行。
鼠妇为甲壳纲等足目鼠妇科动物鼠妇Porcellio scaber Latreille的干燥虫体，别名潮虫，地虱，西瓜虫，豌豆虫等，始载于《神农本草》，具有破血利水，解毒止痛之功效。鼠妇是一味传统的虫类中药，可用于治疗中重度癌性疼痛，扁平疣，痔疮，百日咳等。
发明内容
本发明的目的是提供一种鼠妇提取物，具有溶栓和抗凝活性，且溶栓活性较温和。
本发明的另一目的是提供上述鼠妇提取物在制备治疗血栓性疾病药物中的应用。
本发明的目的采用如下技术方案实现。
本发明提供一种鼠妇提取物，具有溶栓和抗凝活性，采用如下方法制备：将鼠妇采用湿法超微粉碎，离心，取上清液，得到鼠妇提取物。
在本发明中，将所述上清液采用硫酸铵沉淀法进行纯化，得到鼠妇提取物。
优选的技术方案中，所述硫酸铵沉淀法如下：在所述上清液中加入硫酸铵至饱和度为55-65%，离心，取上清液，加入硫酸铵至饱和度为75-85%，离心，取沉淀，得到鼠妇提取物。
优选的技术方案中，将所述鼠妇提取物采用透析法除去硫酸铵。
在本发明中，在鼠妇中加入所述鼠妇质量6-10倍的水，浸泡0.5-2h，然后加入超微粉碎机中进行湿法超微粉碎。
优选的技术方案中，所述湿法超微粉碎的温度为0-40℃，时间为5-10分钟。
本发明还提供所述鼠妇提取物在制备治疗血栓性疾病药物中的应用。
本发明提供一种鼠妇提取物，具有溶栓和抗凝活性，且溶栓活性较温和。本发明鼠妇提取物并非是直接溶解纤维蛋白，而是通过激活纤溶酶原，使纤溶酶原转化为纤溶酶，进而溶解纤维蛋白，因此，该鼠妇提取物的溶栓作用相对温和，因而不会出现大量出血倾向，降低了组织大出血的风险。另外，本发明所提供鼠妇提取物，制备方法行之有效，工艺过程简便，易操作，适应于工业化生产。本发明鼠妇提取物还可以应用于制备治疗血栓性疾病药物。
附图说明
图1是鼠妇湿法超微粉碎粗提物和水煎煮粗提物的体外溶栓活性比较。
图2显示了鼠妇提取物溶栓活性。其中“高”对应的孔中加入高浓度鼠妇提取物溶液，“中”对应的孔中加入了中浓度鼠妇提取物溶液，“低”对应的孔中加入低浓度提取物溶液，“空白”对应的孔中加入去离子水，“尿激酶”对应的孔中加入了尿激酶。
图3显示了阴、阳性平板中鼠妇提取物的溶栓活性。
具体实施方式
实施本发明可以按如下实施例进行，但并不意味着对本发明范围的限制。
实施例1鼠妇湿法超微粉碎和水煎煮粗提物的制备及活性比较。
1.鼠妇湿法超微粉碎粗提物的制备
称取干燥鼠妇200.0 g，加入鼠妇质量8倍、25℃的蒸馏水，浸泡1 h后，加入超微粉碎机中在25℃条件下采用湿法超微粉碎10 min。将粉碎后得到的浆料在4 ℃条件下，10000 r/min离心10 min，取上清液，冷冻干燥可得鼠妇湿法超微粉碎粗提物。
2.鼠妇水煎煮粗提物的制备
称取200g干燥鼠妇，加入鼠妇质量8倍的蒸馏水，浸泡1 h后煎煮3 h。取煎煮液，在4℃条件下，10000 r/min离心10 min取上清液，60 ℃减压浓缩，冷冻干燥可得鼠妇水煎煮粗提物。
3.鼠妇湿法超微粉碎和水煎煮粗提物体内抗凝活性比较
将鼠妇湿法超微粉碎粗提物和水煎煮粗提物分别配制成生药浓度为200mg/mL和400mg/mL的溶液。昆明小鼠 50 只，雌雄各半，随机分为 5 组，即空白对照组，湿法超微粉碎高、低剂量组和水煎煮高、低剂量组。空白对照组灌胃生理盐水 0. 2mL/10g，湿法超微粉碎高、低剂量组分别灌胃生药浓度为200mg/mL和400mg/mL的鼠妇湿法超微粉碎粗提物溶液 0. 2mL/10g，水煎煮高、低剂量组分别灌胃生药浓度为200mg/mL和400mg/mL的鼠妇水煎煮粗提物溶液 0. 2mL/10g。连续给药 7 天，末次给药 1h 以后，摘眼球取血。分别按照PT（凝血酶原时间），TT（凝血酶时间），APTT（活化部分凝血活酶时间）试剂盒（北京中勤世帝科学仪器有限公司，批号分别为STY50101-52， STY50301-32， STY50201-39）说明测定各组的PT，TT，APTT。各体外诊断试剂盒的测定结果见表1，与空白对照组相比，水煎煮低剂量组的PT，TT，APTT均无显著性差异，水煎煮高剂量组仅能稍微延迟APTT。虽然湿法超微粉碎低剂量组与空白对照组比较，PT，TT，APTT均无显著性差异，但是湿法超微粉碎高剂量组均能显著延迟PT，TT，APTT，而且APTT的延迟时间显著大于水煎煮高剂量组。
延迟率(φ)=（给药组测定值-空白对照组测定值）/空白对照组测定值*100%
表1 体内抗凝活性分析比较
注：与空白对照比:“*”表示P＜0.05，“**”表示P＜0.01。
4.鼠妇湿法超微粉碎和水煎煮粗提物体外溶栓活性比较
（1）制备纤维蛋白平板
用20 mmol/mL的Tris-HCl缓冲液(pH7.8)配制5 mg/mL牛血纤维蛋白原溶液、10 U/mL凝血酶溶液和1.0%的琼脂糖溶液。取琼脂糖溶液20 mL煮沸，冷却至50-60 ℃，加入10 ml牛血纤维蛋白原溶液和1 mL凝血酶溶液，迅速摇匀，倒入直径为9 cm的培养皿中，室温静置。待平板充分凝固，打出若干直径约为2 mm的小孔。
（2）体外溶栓活性比较
将鼠妇湿法超微粉碎粗提物和水煎煮粗提物分别配制成质量浓度为40 mg/mL、80 mg/mL和160 mg/mL的溶液。
设置纤维蛋白平板（Ⅰ）和（Ⅱ）。平板（Ⅰ）：孔a、 b和c中分别加入浓度为40 mg/mL、80 mg/mL和160 mg/mL的水煎煮粗提物溶液；孔d中加入去离子水；孔e中加入尿激酶（100 U/mL）。平板（Ⅱ）:孔A、 B和 C中分别加入浓度为40 mg/mL、80 mg/mL和160 mg/mL湿法超微粉碎粗提物水溶液；孔D中加入去离子水；孔E中加入尿激酶（100 U/mL）。加入量均为10 μL/孔。将加样后的平板（Ⅰ）和（Ⅱ）放入37 ℃恒温培养箱中，18 h后观察纤维平板溶圈变化。
由图1可知，低中高浓度的水煎煮粗提物均无溶栓作用，低浓度湿法超微粉碎粗提物溶栓作用较弱，但随着药物浓度的增大，溶栓效果愈明显。由此可以说明，本发明巧妙选择了湿法超微粉碎对鼠妇进行提取，获得的鼠妇湿法超微粉碎粗提物具有较好的溶栓活性。
实施例2：具有溶栓活性的鼠妇提取物的制备
1.鼠妇提取物的制备
称取干燥鼠妇200.0 g，加入鼠妇质量8倍、25℃的蒸馏水，浸泡1 h后，加入超微粉碎机中在25℃条件下采用湿法超微粉碎粉碎10 min。将粉碎后得到的浆料在4 ℃条件下，10000 r/min离心10 min，取上清液。在该上清液中，加入饱和硫酸铵溶液至体系中硫酸铵的饱和度为60%，缓慢搅拌1 h后，4 ℃静置2 h，10000 r/min离心10 min，弃去杂蛋白沉淀，取上清液继续加入饱和硫酸铵溶液，直至体系中硫酸铵的饱和度为80%，缓慢搅拌1 h后，4 ℃静置2 h，10000 r/min离心10 min，收集沉淀。沉淀用蒸馏水复溶，装入处理好的透析袋中充分透析除盐。将透析液冷冻干燥，得鼠妇提取物。
2.鼠妇提取物溶栓活性及溶栓机理
（1）鼠妇提取物溶栓活性
将鼠妇提取物配制成低中高不同质量浓度的水溶液，低浓度为10 mg/mL，中浓度为20 mg/mL，高浓度为40 mg/mL。按照实施例1中方法制备纤维蛋白平板，并在其上打出若干直径约为2 mm的小孔。各小孔中分别加入10 μL低中高不同浓度的鼠妇提取物溶液，空白对照孔中加入10 μL去离子水，阳性对照孔中加入10 μL、100U/ml的尿激酶溶液。放入37 ℃恒温培养箱中，18 h后观察纤维平板溶圈变化。
结果如图2显示，不同浓度的鼠妇提取物溶液均表现出了明显的溶栓活性，随着鼠妇提取物浓度的增大，溶栓效果愈加显著，高浓度的鼠妇提取物溶液与100 U/ml的尿激酶溶液溶栓活性相当。说明了本发明鼠妇提取物具有非常好的溶栓活性。
（2）鼠妇提取物的溶栓机理
市售纤维蛋白原中往往含有微量的纤溶酶原，在实验条件下纤溶酶原可被激活成纤溶酶干扰测定，因此常规制作的纤维蛋白平板（阳性平板）反映了样品的纤溶活性（直接溶解纤维蛋白）和样品激活纤溶酶原间接溶解纤维蛋白的双重作用。将阳性平板置85 ℃保温30 min，破坏纤溶酶原，可得到阴性平板。由于阴性平板中纤溶酶原受热失活，因此只有具有纤溶活性的物质才能降解阴性平板中的纤维蛋白。通过比较阴、阳性平板中样品的溶栓活性，可以判断样品的溶栓活性究竟是基于样品的纤溶活性还是样品激活纤溶酶原的性质。
分别制作阳性平板和阴性平板，并在其上打出若干直径约为2 mm的小孔。在阴、阳性平板中，分别加入10 μL质量浓度为40 mg/mL鼠妇提取物溶液和去离子水（空白孔）。放入37 ℃恒温培养箱中，18 h后观察纤维平板溶圈变化。
结果由图3所示，阴、阳性平板上纤维蛋白的溶圈具有较大差异。阳性平板上鼠妇提取物溶液表现出明显的溶栓活性，而在阴性板上没有表现出溶栓活性，，由此提示鼠妇提取物溶栓方式是通过激活纤溶酶原，使其转化为纤溶酶，进而溶解纤维蛋白，而并非是直接溶解纤维蛋白。因此，本发明鼠妇提取物的溶栓作用相对温和，因而不会出现出血倾向，降低了组织大出血的风险。
3.鼠妇提取物的体外抗凝活性
选择新西兰雄性白兔，颈总动脉插管取血。按1：9（V/V）比例在兔血中混入3.8%的柠檬酸钠溶液，轻轻混匀后，3000 r·min-1离心10 min，分离血浆。分别按照PT（凝血酶原时间），TT（凝血酶时间），APTT（活化部分凝血活酶时间）试剂盒（北京中勤世帝科学仪器有限公司，批号分别为STY50101-52， STY50301-32， STY50201-39）说明测定各组的PT，TT，APTT。各测试区分别加入20μL的供试品溶液，其中鼠妇提取物组分为小、中、大三个剂量组，对应的供试品溶液分别为质量浓度为0.3 mg·mL-1、0.6mg·mL-1和1.2 mg·mL-1的鼠妇提取物溶液，以去离子水为空白对照，肝素钠（终浓度为0.75U·mL-1）为阳性对照。
结果：与空白对照组比较，APTT和TT随着鼠妇提取物溶液浓度的增大而延长；当鼠妇鼠妇提取物溶液浓度大于0.30 m/mL时，与空白组相比，APTT、TT均有显著性差异；当鼠妇提取物浓度为1.20 mg/mL时，与肝素钠的抗凝血作用相当，显示了非常好的抗凝活性；但是PT与鼠妇提取物浓度未呈现量效关系，即低中高浓度的鼠妇提取物对PT没有明显作用。结果见表2。
表2 不同样品对APTT、TT、PT的影响 （±s，n = 6）
注:：与空白对照比:*P＜0.05，**P＜0.01。
实施例1中鼠妇湿法超微粉碎粗提物的体内抗凝活性与实施例2中鼠妇提取物的体外抗凝活性中，两种提取物均能显著延迟TT和APTT；但是鼠妇湿法超微粉碎粗提物体内抗凝活性检测中能够延迟PT，鼠妇提取物体外PT测定结果与空白对照组无显著性差异，说明体外测定不足以表明该提取物在体内的抗凝活性，体内测定结果更能准确的表现出本发明的药效活性。