紫草素衍生物的应用.pdf

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1、(10)授权公告号 CN 101683331 B (45)授权公告日 2013.01.30 CN 101683331 B *CN101683331B* (21)申请号 200810200713.7 (22)申请日 2008.09.27 A61K 31/215(2006.01) A61P 35/00(2006.01) (73)专利权人 厦门大学 地址 361005 福建省厦门市思明区厦门大学 (72)发明人 曾锦章 张晓坤 刘婕 李绍顺 周文 王光辉 (74)专利代理机构 上海德昭知识产权代理有限 公司 31204 代理人 缪利明 CN 101066919 A,2007.11.07, 全文 . 。

2、US 2005/0222258 A1,2005.10.06, 全文 . CN 1374288 A,2002.10.16, 全文 . 曾云等 .AKT 注射液抗肿瘤作用及其机制的 初步研究 .四川大学学报 （医学版） .2008, 第 39 卷 ( 第 3 期 ),500-502. 曾云等 . 乙酰紫草素注射液对人胃癌细胞 SGC_7901 的抑制作用及机制研究 .中国药理学 会化疗药理专业委员会第九届学术研讨会论文摘 要集 .2008,58-59. 马赤等 . 紫草抗肿瘤有效成分的初步研 究 .吉林医学 .1980,39-42. Ushio Sankawa,et alAntitumor aci。

3、tvity of shikonin and its derivatives. Chem.Pharm.Bull .1977, 第 25 卷 ( 第 9 期 ),2392-2395. (54) 发明名称 紫草素衍生物的应用 (57) 摘要 本发明提供了一种紫草素衍生物用于制备 治疗癌症的药物的应用， 所述药物以孤儿受体 Nur77 作为作用靶点。本发明还提供了孤儿受体 Nur77 作为作用靶点用于筛选紫草素衍生物的应 用。本发明的紫草素衍生物通过作用于孤儿受体 Nur77 诱导肿瘤细胞凋亡的这一重大发现， 阐明 了紫草素衍生物的抗肿瘤作用的机理， 为该类结 构的修饰和优化提供了有效的靶点。 (51。

4、)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 师晓荣 权利要求书 1 页 说明书 8 页 附图 5 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 8 页 附图 5 页 1/1 页 2 1. 一种紫草素衍生物用于制备治疗肺癌或宫颈癌的药物的应用， 其特征在于， 所述紫 草素衍生物为 5， 8- 二乙酰氧基 -6-(1 乙酰氧基 -4 甲基 -3 戊烯基 )-1， 4- 萘醌 ； 所述药 物以孤儿受体 Nur77 作为作用靶点。 2. 如权利要求 1 所述的应用， 其特征在于， 所述药物用于诱导肿瘤细胞的凋亡。 3. 如权利要求 2 所述的应用， 其特征在于。

5、， 所述诱导肿瘤细胞的凋亡是通过诱导孤儿 受体 Nur77 的表达。 4. 如权利要求 2 所述的应用， 其特征在于， 所述诱导肿瘤细胞的凋亡是通过诱导孤儿 受体 Nur77 出核且定位在线粒体上。 5.如权利要求2所述的应用， 其特征在于， 所述诱导肿瘤细胞的凋亡是通过诱导Bcl-2 的构象变化。 6. 如权利要求 2 所述的应用， 其特征在于， 所述诱导肿瘤细胞的凋亡是通过激活 Bax。 7. 如权利要求 2 所述的应用， 其特征在于， 所述诱导肿瘤细胞的凋亡是通过引起细胞 色素 C 从线粒体释放。 权 利 要 求 书 CN 101683331 B 2 1/8 页 3 紫草素衍生物的应用 。

6、技术领域 0001 本发明涉及中草药领域， 具体地说， 是关于紫草素衍生物的应用。 背景技术 0002 孤儿受体 Nur77( 又称为 TR3 或 NGFI-B)， 是核受体超家族的重要成员， 它也是一 种立刻早期基因， 其表达可以被血清、 生长因子、 十四烷酰佛波醋酸酯 -13(TPA) 以及钙信 号迅速诱导 (Zhang XK.et.al.， Expert Opin Ther Tar2007 ； 11 ： 69-79 ； Moll UM， et.al.， Oncogene2006 ； 25 ： 4725-43.)。 0003 Nur77 最初被认为是一种细胞存活因子， 它可以介导多种存活信。

7、号通路， 包括蛋白 激酶 A、 蛋白激酶 C、 MAPK 和 NF-B 通路。Nur77 表达的促生长作用在多种肿瘤中都被证实 (Chen GQ， et.al.， Int J Cancer2002 ； 99 ： 171-8 ； Wu Q， et.al.， Carcinogenesis2002 ； 23 ： 1583-92.)， 已有报道表明， Nur77 的 mRNA 在癌组织中的表达水平明显高于癌旁组织。 0004 最近， 越来越多的证据表明 Nur77 同时也是一种促凋亡分子。Nur77 对凋亡的 作用首先在未成熟的胸腺细胞和 T- 细胞杂交瘤通过 T- 细胞受体信号的凋亡中被报道。 Nu。

8、r77 对细胞凋亡的作用已在多种类型的癌细胞中被证实， 它可以对多种凋亡因子， 如钙 离子载体、 依托泊甙 (VP-16)、 佛波酯、 镉以及 1， 1-Bis(3 -indolyl)-1-(p-substituted phenyl)methanes 做出应答 (Stasik I， et.al.， BBA-Mol Cell Res2007 ； 1773 ： 1483-90 ； Gennari A， et.al.， ToxicolAppl Pharmacol2002 ； 181 ： 27-31 ； Liu S， et.al.， World J Gastroenterol2002 ； 8 ： 44。

9、6-50 ； Wilson AJ， et.al.， Cancer Res2003 ； 63 ： 5401-7 ； Chintharlapalli S， et.al.， J Biol Chem2005 ； 280 ： 24903-14.)。 0005 调控Nur77的增殖作用和凋亡作用的生物活性机制之一是通过Nur77的亚细胞定 位来实现的。 Nur77通过其在细胞核中的作用实现生长促进， 这一作用需要Nur77与靶基因 DNA 反应调控元件相结合， 即 Nur77 在细胞核内的转录激活作用具有诱导细胞增殖的功能。 而Nur77的凋亡作用不依赖于转录， 在其DNA结合结构域缺失时， 这种凋亡诱导。

10、作用仍可发 生。 0006 最近， 发明人通过一系列的研究发现， 在某些促凋亡因素的作用下， Nur77 可被诱 导出核， 并且定位到线粒体、 高尔基体或内质网， 诱导细胞凋亡， 这种凋亡作用可通过诱导 Nur77与Bcl-2的相互作用， 引起Bcl-2构象发生变化， 暴露出Bcl-2中蕴藏的BH3结构 域， 使 Bcl-2 从一个细胞抗凋亡蛋白转化成细胞促凋亡蛋白。已证明， 在前列腺癌、 肺癌、 结肠 癌、 卵巢癌以及胃癌等许多不同肿瘤中， 不同的凋亡因子可诱导 Nur77 的线粒体定位。由于 许多肿瘤高表达 Nur77 和 Bcl-2， 因而， 通过调控 Nur77/Bcl-2 凋亡通路成。

11、为一种非常有效 的筛选肿瘤治疗药物的方法。 0007 紫 草 为 紫 草 科 植 物 (Boraginaceae)，在 我 国 有 新 疆 软 紫 草 Amebia euchroma(Royle)Johnst、 辽宁硬紫草 (Lithospermum erythrorhizon Sieb.et Zucc.) 或 内蒙紫草 (Amebia guttataBunge) 等几类。紫草性甘、 咸、 寒， 归心、 肝经， 味苦， 性寒， 有清 热凉血， 透疹解毒的功能。 说 明 书 CN 101683331 B 3 2/8 页 4 0008 紫草含多种萘醌类色素如紫草素、 乙酰紫草色素等。新疆紫草含有 。

12、， - 二 甲 基 丙 烯 酰 紫 草 素 (， -Dimethyl-acryl-shikonin)、 紫 草 素 (shikonin)、 乙 酰 紫 草 素 (Acetyl shikonin)、 异 丁 酰 紫 草 素 (Isobutyryl shikonin)、 异 戊 酰 紫 草 素 (Isovalerylshikonin)、 - 羟基异戊酰紫草素 (-Hydroxyixovalerylshikonin)、 去氧 紫草素 (Deoxyshikonin) 等， 它们具有多种生物活性。 0009 近年来， 中医临床研究证明紫草对于治疗多种癌症有较好的效果， 并证明了其主 要的活性成分是紫草素。

13、及其衍生物。目前对紫草素及其衍生物抗肿瘤作用的研究报道， 包 括抑制肿瘤细胞生长、 诱导细胞凋亡、 抑制 DNA 拓扑异构酶、 抑制蛋白酪氨酸激酶核抗血管 增生活性等 (Chen X， etal.， Phytother Res.2002May ； 16 ： 199-209. ； Shen CC， et al.， J Nat Prod.2002Dec ； 65 ： 1857-62)。但是， 紫草素及其衍生物抗肿瘤作用的机理至今尚不明 了， 并且一直没有找到一个明确的作用靶点， 因而难以对该结构进行有效的修饰和优化， 这 是制约其进一步开发成为抗癌药物的最主要原因。 发明内容 0010 本申请的发。

14、明人在研究紫草素衍生物对于肿瘤细胞的作用机理的过程中发现， 某 些紫草素衍生物可通过诱导 Nur77/Bcl-2 凋亡途径诱导多种肿瘤细胞的凋亡。 0011 因此， 本发明的第一个目的在于， 提供一种紫草素衍生物用于制备治疗癌症药物 的应用。 0012 本发明的第二个目的在于， 提供一种孤儿受体 Nur77 作为作用靶点用于筛选紫草 素衍生物的应用。 0013 根据本发明， 紫草素衍生物用于制备治疗癌症的药物的应用， 所述药物以孤儿受 体 Nur77 作为作用靶点。 0014 根据本发明， 紫草素衍生物可以诱导肿瘤细胞的凋亡， 具体的， 紫草素衍生物可以 诱导孤儿受体 Nur77 的表达、 诱。

15、导孤儿受体 Nur77 出核且定位在线粒体上、 诱导 Bc1-2 的构 象变化、 激活 Bax， 以及引起细胞色素 C 从线粒体释放和细胞凋亡。 0015 根据本发明， 所述紫草素衍生物包括乙酰紫草素、 5， 8- 二乙酰氧基 -2-(1 乙酰氧 基 -4 甲基 -3 戊烯基 )-1， 4- 萘醌和 5， 8- 二乙酰氧基 -6-(1 乙酰氧基 -4 甲基 -3 戊 烯基 )-1， 4- 萘醌。 0016 根据本发明， 所述癌症优选为肺癌、 子宫颈癌、 乳腺癌、 肝癌、 胃癌。 0017 根据本发明， 以孤儿受体 Nur77 作为作用靶点， 可以用于筛选紫草素衍生物， 以进 一步开发用于治疗各。

16、种癌症。 0018 本发明提供的作用于孤儿受体 Nur77 诱导肿瘤细胞凋亡可以用于指导筛选紫草 素衍生物， 从中获得具有抗肿瘤活性的化合物， 并可将获得的药物进而制备可作用于孤儿 受体 Nur77 诱导肿瘤细胞凋亡的活性与功能的药物。 0019 附图说明 0020 图 1A 显示紫草素衍生物对 NIH-460 细胞中 Nur77 蛋白的表达量调控结果 ； 图 1B 显示紫草素衍生物对 HeLa 细胞中 Nur77 蛋白的表达量调控结果 ； 图 1C 显示 SK07 对诱导 Nur77 的表达量增高具有良好的时效和量效关系 ； 图 1D 显示荧光染色检测紫草素衍生物导 致 Nur77 从细胞核。

17、中迁移出， 并且出核后定位于线粒体上。 说 明 书 CN 101683331 B 4 3/8 页 5 0021 图 2A 显示荧光染色检测紫草素衍生物诱导肿瘤细胞的凋亡 ； 图 2B 显示凋亡的百 分比结果 ； 图 2C 显示紫草素衍生物诱导肿瘤细胞中的 PARP 蛋白降解。 0022 图 3A 为流式细胞仪分析 Annexin-V/PI 双染检测紫草素衍生物诱导 NIH-H460 肺 癌细胞的凋亡结果 ； 图 3B 为流式细胞仪分析 Annexin-V/PI 双染检测紫草素衍生物诱导小 鼠胚胎成纤维细胞 MEF 及 MEF Nur77-/- 细胞的凋亡结果。 0023 图4A、 B显示荧光染。

18、色检测紫草素衍生物诱导凋亡依赖于Nur77的表达及其出核 ； 图 4C 显示细胞凋亡率结果。 0024 图 5A 显示荧光染色检测 Nur77 和 Bcl-2 的共定位 ； 图 5B 显示荧光染色检测 SK07 激活了 Bax ； 图 5C 显示荧光染色检测 Bax 的激活伴随着细胞色素 c 的释放 ； 图 5D 显示荧光 染色检测 SK07 诱导了 Bcl-2 构象变化。 0025 具体实施方式 0026 以下结合具体实施例， 对本发明作进一步说明。 应理解， 以下实施例仅用于说明本 发明而非用于限定本发明的范围。 0027 实施例中未注明具体条件的实验方法， 通常按照常规条件如 分子克隆 。

19、： 实验室手 册 (New York ： Cold Spring Harbor Laboratory Press， 1989)中所述的条件， 或按照制造 厂商所建议的条件。 0028 本发明中使用的试剂 ： 0029 脂质体 2000、 Trizol LS 购自 Invitrogen 公司 ； ECL、 山羊抗兔、 山羊抗鼠辣根过 氧化物酶二抗购自 Thermo 公司 ； Cy3 标记的山羊抗鼠二抗购自 Chenicon international ； Nur77 多抗 (sc-5569)、 Hsp60(sc-7150)、 Bcl-2(sc-509)、 Bax(sc-493)、 Bax(6A7。

20、) (sc-23959) 抗体、 PARP(sc-556494) 及 FITC 标记的山羊抗兔二抗购自 Santa Cruz ； 细胞 色素 C(556433) 抗体购自 BD 公司 ； -actin 抗体购自 Sigma 公司。Nur77 单抗购自 R&D ； Bcl2-BH3(AP1303a) 抗体购自 Abgent， PVDF 膜购自 Millipore。无特别注明外， 其它本发明 中所用的化学试剂均购自 Sigma。 0030 实施例 1、 紫草素衍生物的制备 0031 称取20kg辽宁硬紫草(市售)， 磨碎后过80目筛， 收集过筛后获得的紫草粉末， 用 95乙醇进行常温渗滤提取， 至。

21、提取液为近无色为止。 0032 合并提取液， 减压浓缩至溶液变为紫红色， 得到紫褐色油状物粗产物约 250g。 0033 过滤除去不溶物后， 加入浓 HCl 酸化溶液， 至溶液由蓝色变为紫红色， 此时有大量 沉淀生成， 静置过夜。 0034 将粗产物用三氯甲烷溶解， 并每 50 毫升加 17 克 200 300 目的硅胶， 搅拌均匀上 柱。 洗脱剂分别用石油醚(6090)丙酮和石油醚(1 ： 1)丙酮三氯甲烷(1 ： 1)， 依 次洗脱并分别收集洗脱液。 0035 将洗脱液浓缩至沉淀析出， 然后重结晶(重结晶方法参考专利号为02114973.9的 中国专利 )， 纯化紫草类化合物， 产物经 M。

22、NR、 MSUV 和元素分析数据确定为乙酰紫草素， 其结 构式如下 ： 0036 说 明 书 CN 101683331 B 5 4/8 页 6 0037 乙酰紫草素 0038 (SK03) 0039 200710046917.5 和 200710041978.2 的中国专利申请的方法， 合成衍生物 5， 8- 二 乙酰氧基 -2-(1 - 乙酰氧基 -4 - 甲基 -3 - 戊烯基 )-1， 4- 萘醌 (SK06) 和 5， 8- 二乙酰氧 基 -6-(1 - 乙酰氧基 -4 - 甲基 -3 - 戊烯基 )-1， 4- 萘醌 (SK07)， SK06 和 SK07 的结构式 分别如下 ： 0。

23、040 0041 2 - 二乙酰紫草素 6 - 二乙酰紫草素 0042 (SK06) (SK07) 0043 实施例 2、 紫草素衍生物对于 Nur77 表达的诱导作用 0044 2.1、 细胞培养 0045 选择肺癌细胞 NIH-H460(ATCC， HTB-177) 和宫颈癌细胞 HeLa(ATCC， CCL-2)， 用 RPM1640 培养基 ( 购自 Hyclone)， 在 37和 5二氧化碳培养箱培养于 24 孔板组织培养 板中， 24 小时后换液， 饥饿 16 小时后进行加药 ( 不含血清 ) 处理。紫草素衍生物溶解于 DMSO(DMSO 终浓度 0.1 ) 中， 对照组用同样浓度。

24、的 DMSO 处理， 具体处理如下 ： 0046 (1) 对照组 (DMSO) 0047 (2)SK03 组 0048 (3)SK06 组 0049 (4)SK07 组 0050 SK03、 SK06、 SK07 的浓度均为 5 或 10M， 处理时间为 12 或 24 小时， 以未经任 何处理的 NIH-H460 细胞和 HeLa 细胞作为对照。为了确证时效及量效关系， 用 SK07 处理 NIH-H460 细胞， 处理浓度为 1、 5 或 10M， 处理时间为 6、 12 或 24 小时， 以未经任何处理的 NIH-H460 细胞作为对照。 0051 2.2、 Western blotti。

25、ng 分析 Nur77 的表达 0052 细胞以改进的 RIPA 裂解缓冲液 (50mM Tris-Hcl， pH7.4 ； 150mM NaCl ； 5mM EDTA ； 1NP-40， 0.5脱氧胆酸钠， 0.1SDS)于冰上裂解30分钟。 以相同上样量， 8SDS-PAGE 电 泳， 转 膜， 以 5 脱 脂 奶 粉 的 TBST(50mM Tris-HCl(pH7.4)， 150mM NaCl and0.1 说 明 书 CN 101683331 B 6 5/8 页 7 Tween20)室温封闭1小时， 于室温2小时或4过夜孵育一抗， 室温孵育二抗一小时， ECL显 色， 曝光， 结果如。

26、图 1A、 1B、 1C 所示。 0053 由图 1A 的结果可知， 在 NIH-H460 肺癌细胞中， 紫草素衍生物 SK03 能够有效诱导 Nur77 的表达。以 SK035-10M 的浓度处理细胞 12-24 小时， 其诱导的 Nur77 蛋白的表达 量约为对照的 3-5 倍。以 SK07 处理 NIH-H460 细胞具有类似的调控 Nur77 表达的作用， 但 SK06 对 Nur77 的表达作用被显著抑制。 0054 由图 1B 的结果可知， 在 HeLa 宫颈癌细胞中， 紫草素衍生物 SK03 能够有效诱导 Nur77 的表达。以 SK035-10M 的浓度处理细胞 12-24 小。

27、时， 其诱导的 Nur77 蛋白的表达量 显著提高。以 SK07 处理 HeLa 细胞也可导致 Nur77 表达的显著提高， 而 SK06 对 Nur77 的诱 导作用被抑制。 0055 由图 1C 的结果可知， 随着 SK07 处理浓度的增加及处理时间的延长， Nur77 的表达 量显著提高， 具有良好的时效和量效关系。 0056 2.3、 紫草素衍生物诱导 Nur77 出核 0057 选择肺癌细胞 NIH-H460(ATCC， HTB-177)， 用 RPM1640 培养基 ( 购自 Hyclone)， 在 37和5二氧化碳培养箱培养于覆有盖玻片的24孔板组织培养板中， 24小时后换液和进。

28、 行加药 ( 不含血清 ) 处理。紫草素衍生物溶解于 DMSO(DMSO 终浓度 0.1 ) 中， 对照组用 同样浓度的 DMSO 处理， 具体处理如下 ： 0058 (1) 对照组 (DMSO) 0059 (2)TPA 组 0060 (3)SK03 组 0061 (4)SK06 组 0062 (5)SK07 组 0063 (6) 用普霉素 A(LMB)(10ng/mL) 预处理后、 加入 SK07 组。 0064 其中， 以 (1) 作为对照组、 (2) 为阳性对照组。 0065 反应板中各孔溶液的总体积均为 1ml， SK03、 SK06 和 SK07 的浓度均为 5M。 0066 细胞经。

29、处理 24 小时后， 用 0.1M 磷酸缓冲盐 PBS 洗涤 3 遍， 用 4多聚甲醛溶液 40ul固定， 再以含1Triton的0.1M PBS溶液穿孔5min ； 接着， 用含5BSA的0.1M PBS溶 液、 37封闭半小时， 然后加入兔抗Nur77多克隆抗体(1 ： 200稀释)(Santa Cruz， sc-5569) 作为一抗， 4过夜。 0067 取上步过夜处理后的细胞溶液， 于室温放置 15min， 吸掉一抗后， 用 0.1M 的 PBS 洗 涤 3 遍， 每遍 5min ； 加入 cy3 耦连的羊抗鼠二抗 (1 ： 500 稀释， 购自 Chemicon)， 于 37放置 3。

30、0min 后， 吸掉二抗， 用 0.1M PBS 洗涤 3 遍， 每遍 5min。 0068 DAPI( 购自 Sigma) 染色用于检测细胞核。然后用荧光显微镜 (Carl Zeiss) 观察 内源性 Nur77 的亚细胞定位 (BioRad)， 结果如图 1D 所示。 0069 根据图1D的结果可知， 以紫草素衍生物处理24小时后， Nur77从细胞核中迁移出， 并且出核后定位于线粒体上 ； 而对照组中的 Nur77 仍留在细胞核中 ； LMB 是已知的依赖于 CRM1 的出核转运通路和抑制剂， 用 LMB 和 SK07 共同处理细胞后， SK07 诱导的 Nur77 在细胞 质中的积累可。

31、以显著地被 LMB 所抑制， 说明 SK07 增强了 Nur77 的出核。 0070 上述结果表明 ： 紫草素衍生物可以诱导 Nur77 从细胞核向细胞质的迁移且定位在 说 明 书 CN 101683331 B 7 6/8 页 8 线粒体上。 0071 实施例 3、 紫草素衍生物诱导肿瘤细胞的凋亡 0072 3.1 紫草素衍生物诱导 NIH-H460 细胞凋亡 0073 选择肺癌细胞 NIH-H460(ATCC， HTB-177)， 用 RPM1640 培养基 ( 购自 Hyclone)， 在 37和 5二氧化碳培养箱培养于 24 孔板组织培养板中， 24 小时后换液和进行加药 ( 不 含血清。

32、 ) 处理。紫草素衍生物溶解于 DMSO(DMSO 终浓度 0.1 ) 中， 对照组用同样浓度的 DMSO 处理， 具体处理如下 ： 0074 (1) 对照组 (DMSO) 0075 (2)SK03 组 0076 (3)SK06 组 0077 (4)SK07 组 0078 反应板中各孔溶液的总体积均为 1ml， SK03、 SK06 和 SK07 的浓度均为 5M。 0079 处理 24h 后， 细胞用 0.5胰酶消化， 用 0.1M PBS 洗涤后， 用 4多聚甲醛进行固 定， 以 1g/ml DAPI 进行染色， 用荧光显微镜 (Carl Zeiss) 观察细胞核的形态， 结果如图 2A 。

33、所示。随机选 5 个视野， 计算每视野 300 个细胞的凋亡数， 取 5 个视野细胞凋亡的平均 数， 计算凋亡的百分比， 结果如图 2B 所示。 0080 由图 2A 可见， 以紫草素衍生物处理 24 小时后， 细胞明显发生凋亡。凋亡的细胞 表现出典型的形态学上的特征， 如细胞质浓缩、 膜呈泡状， 核浓缩以及产生碎片等。由图 2B 的结果可知， 未用紫草素衍生物处理的细胞很少有凋亡现象发生 (7 )， 用 SK03 处理可引 起细胞明显凋亡 (22 )， SK07 的促凋亡作用显著增强 (33 )， 而 SK06 对凋亡的作用较弱 (14 )。由此可以看出， 紫草素衍生物癌细胞具有不同程度的促。

34、凋亡作用。 0081 3.2SK07 诱导 NIH-H460 细胞和 HeLa 细胞的 PARP 蛋白降解 0082 选择肺癌细胞 NIH-H460(ATCC， HTB-177) 和宫颈癌细胞 HeLa(ATCC， CCL-2)， 用 RPM1640 培养基 ( 购自 Hyclone)， 在 37和 5二氧化碳培养箱培养于 24 孔板组织培养板 中， 24 小时后， 分别用加有 5M SK07 的无血清的 RPMI1640 处理 3、 6、 12、 24 小时。细胞以 改进的 RIPA 裂解缓冲液 (50mM Tris-Hcl， pH7.4 ； 150mM NaCl ； 5mM EDTA ； 。

35、1 NP-40， 0.5 脱氧胆酸钠， 0.1 SDS) 于冰上裂解 30 分钟。以相同上样量， 8 SDS-PAGE 电泳， 转膜， 以 5脱脂奶粉的 TBST(50mM Tris-HCl(pH7.4)， 150mM NaCl and0.1 Tween20) 室温封闭 1 小时， 于室温 2 小时或 4过夜孵育一抗 anti-PARP(1 ： 1000 稀释 )， 室温孵育二抗一小时， ECL 显色， 曝光， 结果如图 2C 所示。 0083 如图 2C 所示， SK07 可以诱导 113kD 的 PARP 蛋白降解为 89kD 的特异性降解产物。 随 SK07 作用时间的延长 89kD 的。

36、降解产物量逐渐增多， 特别是 HeLa 细胞中在作用 12 小时 和 24 小时后， 113kD 的 PARP 蛋白几乎完全消失， 全部被降解。 0084 实施例 4、 利用 Annexin-V/PI 双染检测紫草素衍生物诱导肿瘤细胞的凋亡 0085 在无血清 RPM1640 培养基 ( 购自 Hyclone) 中用 5M SK07 在普霉素 A(LMB) 存 在和缺少的情况下处理 NIH-H460 肺癌细胞 24 小时， 以不加 SK07 的细胞作为对照。细 胞根据 Vybrant Apoptosis Assay Kit#2 操作手册染色 PI 和 AnnexinV， 用流式细胞仪 (Bec。

37、kmanCoulter EPICS ALTRA)分析。 用EXPO32ADC软件(Beckman Coulter EPICS ALTRA) 分析， 结果如图 3A 所示。 说 明 书 CN 101683331 B 8 7/8 页 9 0086 由图3A可以看出， 5M的SK07在缺少LMB的情况下导致37.9的NIH-H460细胞 早期凋亡， 而在存在 LMB 的情况下基本不会诱导 NIH-H460 细胞发生凋亡。表明 SK07 处理 可以诱导 NIH-H460 细胞的早期凋亡， 而并不引起细胞坏死 ( 图中右下象限表示早期凋亡， 右上象限表示坏死 ) ； 且这种早期凋亡的诱导可被 LMB 抑。

38、制。 0087 同 样 地， 将 小 鼠 胚 胎 成 纤 维 细 胞 MEF(ATCC、 SCRC-1046) 和 Nur77 敲 除 的 MEFNur77-/- 细胞 (Carcinogenesis， vol28， pp1653-1658， 2007) 用 1M 和 10M SK07 或 10MSK03 处理 24 小时， 用流式细胞仪分析凋亡， 结果如图 3B 所示。 0088 由图 3B 可以看出， Nur77 敲除的 MEF Nur77-/-细胞， SK07 的促凋亡作用被显著 抑制。用 1M SK07 处理 24 小时， MEF 细胞的凋亡率为 14.6， 而同样的处理不能引起 ME。

39、FNur77-/-细胞的凋亡。 高浓度的SK07(10M)虽然可以引起MEF Nur77-/-细胞23.7的 凋亡率， 但明显小于MEF细胞57的凋亡率。 这一结果表明， SK07诱导的细胞凋亡极大程度 地依赖于 Nur77 的表达。当用 SK03(10M) 处理细胞时， 发现它可以引起 MEF 细胞 54.6 以及 MEF Nur77-/-细胞 66.8的坏死率， 这说明 SK03 的作用不依赖于 Nur77 的表达， 并对 于细胞具有非特异的毒性。 0089 实施例5、 紫草素衍生物诱导凋亡依赖于Nur77的表达水平以及Nur77的出核转运 0090 为了研究 Nur77 的易位在紫草素衍。

40、生物诱导的细胞凋亡中所起的作用， 用 Nur77 的抗体和DAPI共同染色SK07处理后的NIH-H460细胞(细胞培养同实施例2.3)， 荧光显微 镜观察结果如图 4A 所示。根据图 4A 的结果可以看出， 胞质 Nur77 分布的细胞中， 细胞核多 呈现凋亡的典型形态， 而细胞核完好的细胞中 Nur77 不表达或分布于核中。 0091 为了进一步证明 Nur77 的易位同细胞凋亡诱导之间的关系， 将转染 GFP-Nur77 的 NIH-H460细胞用10M的SK07处理24小时， 然后DAPI染色检测凋亡， 用荧光显微镜观察， 结果如图 4B 所示。 0092 从图 4B 的结果可以看出，。

41、 在对照组细胞中， GFP-Nur77 定位于细胞核中， 细胞核形 态正常。而 SK07 处理后的细胞 GFP-Nur77 则定位于细胞质中， 细胞核凝缩， 破碎。 0093 如果 Nur77 的出核转运在 SK07 诱导的细胞凋亡中起作用， 抑制 Nur77 的出核将可 以减少细胞凋亡。 因此， 转染GFP-Nur77的NIH-H460细胞在LMB存在或是缺乏的情况下， 以 SK07 处理。然后 DAPI 染色检测细胞凋亡， 将显微镜观察的结果绘制柱形图， 结果见图 4C。 0094 从图 4C 的结果可以看出， 在无 GFP-Nur77 转染的条件下， 以 SK07 处理 H460 细胞，。

42、 凋亡率近 35， 而对照组为 7。在 GFP-Nur77 转染的细胞中， SK07 处理后， 凋亡率达到 88。而当细胞经 LMB 同时处理， SK07 诱导的凋亡率显著降低， 未转染细胞为 10， 转染细 胞为 16。 0095 以上的结果说明 SK07 诱导的细胞凋亡不仅依赖于 Nur77 的表达水平也依赖于其 细胞质定位。 0096 实施例 6、 SK07 诱导 Bcl-2 构象变化、 激活 Bax 0097 NIH-H460 细胞在用 SK07 处理 24 小时后， 利用免疫染色对抑凋亡蛋白 Nur77、 Bcl-2 的定位， Bax 的激活， 细胞色素 C 的释放和 Bcl-2 的。

43、构象变化进行分析， 以下抗体的稀 释比例均为 1 ： 500。 0098 6.1、 Nur77 和 Bcl-2 的共定位 0099 SK07(5M) 在 LMB 存在和缺少的情况下作用于细胞 24 小时后， 用 Nur77 的抗体 说 明 书 CN 101683331 B 9 8/8 页 10 和 Bcl-2 的抗体共同染色处理后的细胞。荧光显微镜分析 Nur77 和 Bcl-2 的分布， 结果如 图 5A 所示。图 5A 显示了 Nur77 和 Bcl-2 的共定位。 0100 6.2、 SK07 激活了 Bax 0101 细胞用 5M SK07 处理 24 小时后， 共染 Bax(6A7)。

44、 的抗体和 Hsp60 的抗体。荧光 显微镜分析结果如图 5B 所示。根据图 5B 的结果可知， 在对照细胞中， 并没有观察到激活 的 Bax， 但是在 SK07 处理的细胞中， 却表现得很明显， Nur77 与线粒体特异蛋白 Hsp60 共同 定位。激活 Bax 细胞的染色通常表现核固缩， 表明了 SK07 诱导的凋亡与 Bax 的激活有关， SK07 激活了 Bax， Bax(6A7) 和 Hsp60 的共定位与细胞凋亡相关联。 0102 6.3Bax 的激活伴随着细胞色素 C 的释放 0103 SK07(5M) 在 LMB 存在和缺少的情况下作用于细胞 24 小时， Bax(6A7) 的。

45、抗体和 细胞色素 C 的抗体及 DAPI 共染细胞， 荧光显微镜分析结果如图 5C 所示。根据图 5C 的结果 可知， 细胞色素 C 与它的线粒体定位一样， 表现出小染色斑点。但是， 细胞色素 C 在用激活 的 Bax 免疫染色处理的细胞中呈弥散分布。这种现象表明 SK07 诱导了 Bax 的激活与细胞 色素 C 的释放有关。LMB 共同处理细胞， 阻止了 Nur77 的出核和 Bcl-2 构象变化， 几乎完全 抑制 SK07 诱导的 Bax 激活和细胞色素 C 的释放。 0104 6.4SK07 诱导了 Bcl-2 构象变化 0105 SK07(5M) 处理 NIH-H460 细胞 24 小。

46、时后， 以 Bcl2(BH3) 和 BAX(6a7) 的抗体及 DAPI 染色， 荧光显微镜分析结果如图 5D 所示。根据图 5D 的结果可知， Bcl-2(BH3) 的抗体 不能染色对照细胞， 但可以在SK07处理后的细胞中强染色， 且大多和Bax(6A7)的染色相一 致。共聚焦分析表明， SK07 处理后的大多数细胞这两种蛋白呈共定位。从而说明， SK07 诱 导的 Bcl-2 构象变化和 Bax 的激活以及细胞凋亡密切相关。 0106 由以上的结果可知， SK03 在 MEF 和 MEF Nur77-/- 细胞中均诱导了明显的早期凋 亡和坏死细胞(图3B)， 因此说明SK03的生物活性很。

47、大程度地依赖于Nur-77-非依赖途径 ； 而 SK07 的凋亡效应与诱导 Nur77 表达及出核有关， 通过诱导 Nur77 表达及出核转运， 线粒 体定位， Bcl-2 构象变化和激活 Bax 来有效的激活 Nur77 途径， 导致细胞色素 C 从线粒体释 放， 诱导凋亡 ； 而 SK06 却没有上述作用。 0107 综上所述， 本发明的紫草素衍生物通过诱导 Nur77 表达及从细胞核定位到细胞 质， 从而诱导肿瘤细胞的凋亡。因此本发明的紫草素衍生物可以用于制备治疗癌症的以孤 儿受体 Nur77 作为作用靶点的药物。另外， 孤儿受体 Nur77 可以作为作用靶点用于筛选紫 草素衍生物。 说 明 书 CN 101683331 B 10 1/5 页 11 图 1A 图 1B 图 1C 说 明 书 附 图 CN 101683331 B 11 2/5 页 12 图 1D 图 2A 图 2B 图 2C 说 明 书 附 图 CN 101683331 B 12 3/5 页 13 图 3A 图 3B 说 明 书 附 图 CN 101683331 B 13 4/5 页 14 图 4 说 明 书 附 图 CN 101683331 B 14 5/5 页 15 图 5 说 明 书 附 图 CN 101683331 B 15 。