本申请请求序列号60/806,711的美国临时申请作为优先权，申请日为2006 年7月6日，其内容在此列为参考。
发明领域
本发明涉及用于血管造影术的组合物和用于检测血管泄漏和血流量的方 法。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法能用来评估血-视网膜屏障的完 整性和/或定量测定血-视网膜屏障内的损坏程度。因此，本发明的组合物可以在 二维，三维成像和相似的技术中当做造影剂使用。
发明背景
视网膜血管造影术是用于眼科学的一种研究眼的生理和病理状况的技术。 例如，已经证明血管造影术在研究和临床领域中对评估视网膜疾病有用，例如 糖尿病视网膜病和年龄相关的黄斑病变是两种导致失明的主要原因。常规的， 一种荧光物质，例如荧光素，静脉内给药至患者，然后通过血管造影术观察患 者的视网膜。在健康的眼睛里，眼睛屏障防止荧光素的泄漏通过视网膜血管进 入玻璃体或者其他眼睛组织。然而，在患病的眼睛中，血液视网膜屏障损坏， 在糖尿病视网膜病的情况下导致荧光素泄漏进玻璃体，或者在与年龄相关的黄 斑变性的情况下导致泄露至视网膜下间隙。
对常规使用的血管造影操作的限制之一是使用的荧光物质只提供泄漏存在 的一种“全或无”的判定，或者在最好实施例中，血视网膜屏障损坏的一次主观 评价。在血视网膜和血脑屏障中的损坏数量的定量测定将为疾病进展提供更好 的评估，提高我们选择适当治疗和剂量的能力，并且允许我们监控该治疗和剂 量的效果。
发明概述
本发明涉及多色血管造影术(PCA)，使用不同的标记物或粘附染料，吸附 到或者包裹在不同大小的颗粒、珠，胶体或者标记物的可溶缀合物。这样的标 记物/染料的颗粒、珠，胶体和可溶缀合物在此统称为颗粒。一组一定大小的颗 粒可以通过它们的标记物或染料与不同尺寸的另一组颗粒区分。多组颗粒的组 合能用来明确检测并且定量测定血屏障的泄漏或者损坏。因此，来自血屏障泄 漏的颗粒大小提供了一种测定血屏障损坏程度的方法。当除较小颗粒之外还有 较大颗粒泄露时，存在血屏障的较大损坏或机能障碍，反之，只有较小颗粒的 泄漏表明存在较小损坏或者机能障碍(参见，例如，附图4)。
因此，本发明的一方面是包括一系列颗粒组的组合物，每一颗粒组具有不 同的平均直径和提供独特信号的独特标记物(例如，在独特波长吸收或者发射 光的独特荧光基团)。
通常，在组合物里的每一颗粒组的颗粒可溶于一种水相环境。在一些实施 方案里，颗粒组使用可生物降解的颗粒。在其他实施方案里，颗粒由不能生物 降解的材料或者可生物降解和不能生物降解的材料的组合制成。例如，颗粒可 以由聚(丙交酯)、聚(乙交酯)、聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)、聚亚烷基 二醇、泊洛沙姆、聚乙烯吡咯烷、异丁烯酸酯、肽、蛋白质、类蛋白微球体、 脂质、脂质体或者多糖制成。用于本发明颗粒的多糖可以包括纤维素和衍生化 的纤维素(例如，由各种低级烷基取代的纤维素)，或者糖、苹果酸盐、琥珀酸 盐、柠檬酸盐、异柠檬酸盐，α-酮戊二酸、延胡索酸等其他聚合物。颗粒也可 包含聚合物，例如羟丙基异丁烯酸、马来酸酐的均聚物或者混合聚合物、琥珀 酸酐等等。
在不同颗粒组中的颗粒具有不同的分子量或者尺寸。例如，颗粒可能像500 道尔顿或者800道尔顿、或者1000道尔顿或者5000道尔顿一样小。颗粒也可 具有像100,000,000道尔顿或者1,000,000,000道尔顿一样大的分子量。在一些实 施方案中，颗粒具有最多3微米的直径。在其他实施方案中，颗粒能在尺寸方 面具有的直径，例如从大约3皮米到大约3微米，或者大约10皮米到大约2.5 微米，或者大约100皮米到大约2微米，或者大约1纳米到1微米。在一些实 例里，颗粒尺寸为至少大约10皮米、至少大约100皮米、至少大约1纳米和/ 或至少大约10纳米。
在颗粒组内的颗粒上使用不同染料和标记物。因此，例如颗粒能有荧光、 发光、红外、有磁性、放射性标记物或其组合。荧光标记物的实例包括荧光素、 异硫氰酸荧光素、吲哚菁绿(indocyanine green)、若丹明红(rhodamine red)、 太平洋蓝(pacific blue)、德克萨斯红(texas red)、alexa-532、羟基香豆素、氨 基香豆素、甲氧基香豆素、氨基甲基香豆素、级联蓝(cascade blue)、荧光黄(lucifer yellow)、P-藻红蛋白(P-phycoerythrin)、R-藻红蛋白(R-phycoerythrin)、丽丝 胺若丹明B(lissamine rhodamine B)、别藻蓝蛋白(allophycocyanin)、俄勒冈绿 (oregon green)、四甲基若丹明(tetramethylrhodamine)、丹磺酰、 monochlorobimane、荧光蛋白、钙黄绿素(calcein)或者其他连接其上的染料或 标记物，吸附其上或者包裹其中。在其他实施方案中，至少一个颗粒组的标记 物是铬(III)、锰(II)、铁(III)、铁(II)、钴(II)、镍(II)、铜(II)、钕(III)、 钐(III)、镱(III)、钆(III)、钒(II)、铽(III)、镝(III)、钬(III)、铒(III)、 镧(III)、金(III)、铅(II)、铋(III)、碘131、碘123、碘125、锝99、铟111、磷 32、铼188、铼186、镓67、硫35、铜67、钇90、氚3或者砹211。
本发明的另一方面是一种在哺乳动物中用于定量测定血管泄漏的方法，包 括：(a)将本发明的颗粒组合物给药至哺乳动物；(b)观察哺乳动物的血管外 部是否放出信号；以及(c)如果信号随着哺乳动物的血管外部发出，在哺乳动 物体内确定在哺乳动物血管外面放出信号的类型以定量测定血管泄漏。在一些 实施方案中，血管泄漏包括通过哺乳动物的血视网膜屏障的泄漏。例如，当观 察或者定量测定通过这种血视网膜屏障的血管泄漏时，这个信号可能是荧光信 号并且确定发射信号的类型可以包括确定信号的吸收或者发射波长。在其他实 施方案中，血管泄漏可以包括通过哺乳动物的血脑屏障的泄漏。当观察或者定 量测定通过血脑屏障的血管泄漏时，信号可能是顺磁性或者放射性的信号。
在哺乳动物中用于定量测定血管泄漏的方法，也可包括定量测定血管泄漏 的一个步骤，通过将发出该信号的颗粒组的粒径范围与信号关联，以在引起泄 漏的血管里鉴定孔径大小，并且给该孔径大小赋予数值。
本发明的另一方面是一种在哺乳动物中用于定量测定血管泄漏的方法，包 括：(a)将本发明的多色颗粒组合物给药至哺乳动物；(b)观察哺乳动物的血 管外部是否放出色信号；以及(c)如果放出色信号，检测色信号吸收或者发射 波长，从而定量测定哺乳动物内的血管泄漏；其中多色颗粒组合物包括一系列 颗粒组，每一颗粒组具有不同的平均直径和独特的色信号。如果哺乳动物的血 管外部发出色信号，一个或多个色颗粒已经从血管外渗(即，泄漏)。在一些实 施方案中，例如，血管泄漏包括通过哺乳动物的血脑屏障的泄漏。在其他实施 方案中，例如，血管泄漏包括通过哺乳动物的血视网膜屏障的泄漏。本发明的 方法可进一步包括定量测定血管泄漏，通过将颗粒组的粒径范围与色信号的吸 收或者发射波长关联，在引起泄漏的血管里发射该波长以鉴定孔径大小，并且 给孔径大小赋予数值。在鉴定孔径大小之后，合适的治疗剂和/或程序可以被给 药和/或执行。
本发明的另一方面是一种用于观察血在哺乳动物中流过血管的方法，包括： (a)将本发明的标记颗粒组合物给药至哺乳动物；(b)在哺乳动物的血管内观 察信号；以及(c)检测信号的类型以确定哺乳动物中血流的速度和/或血管的大 小；其中被标记的颗粒组合物包括一系列颗粒组，每一颗粒组具有不同的平均 直径和独特的标记物或者信号。这种方法可适于允许血流动问题的鉴定，例如 血管的部分或者全部阻塞。阻塞的程度或者血管的直径可以通过观察哪种类型 的标记物或者信号存在于血管被确定。血管里的阻塞可以通过观察在一个独特 的位点流过血管的粒径的较大颗粒的阻滞而鉴定。
本发明的另一方面是一个试剂盒或者制造的产品，含有包括一系列颗粒组 的组合物，每一颗粒组具有独特的直径粒径范围和独特的标记物或者染料(例 如，荧光团，其在独特的波长吸收或者发射光)，以及使用组合物的说明书。在 一些实施方案中，说明书描述怎样在哺乳动物中发现和/或定量测定血管泄漏。 在其他实施方案中，说明书描述怎样检测血流量，血管直径和/或血管阻塞(既 包括部分也包括实质上完全的血管阻塞)。试剂盒也可包含其他有用的工具，例 如注射器、针头、药签、导管或者抗菌溶液)。
本发明的另一方面是一种用于在哺乳动物的血管里观察血流量和/或血流速 的方法，其包括将本发明的组合物之一给药至哺乳动物的血管，并检测来自血 管里组合物的至少一组颗粒组的至少一个信号。方法也能包括使信号与发射的 颗粒组的粒径范围相关联，鉴定血管的直径的那个信号。另外，这种方法可包 括鉴定血管的直径是否沿着血管的长度改变，或在随后的时间改变。这种方法 也可包括鉴定血管是否有部分阻塞。
附图简述
附图1A-D描述了视网膜血管造影术的性质，根据普通有效的操作使用荧光 素钠(102)完成，其中荧光素(102)的分子量和有效粒径为376道尔顿。荧 光素钠(102)具有橙-棕色的颜色，最大λabs为492nm，以及最大λem为518nm。 视网膜(106)将含有内部视网膜血管和外部视网膜血管的脉络膜分开。附图1A 是显示荧光素和血浆蛋白质(104)的混合物(100A)的图解，说明20-30％的 荧光素分子(102)是非结合的，而70-60％结合在血浆蛋白质(104)上。附图 1B是在正常视网膜(100B)里的荧光素(102)行为的图解，并且显示从脉络 膜血管泄露到脉络膜的游离荧光素分子(102)引起的背景荧光。附图1C显示 来自脉络膜或者外部血视网膜屏障(100C)的泄漏，而附图1D显示来自血视 网膜屏障内部(100D)的泄漏。因此，附图1C和D说明不同的荧光素泄漏模 式和不同程度的血视网膜屏障机能障碍。
附图2A-D描述来通过吲哚菁绿(202；ICG)进行的血管造影术，根据常 规的有效操作并且证明有效粒径(30-70千道尔顿)的概念，在那里含有98％的 小吲哚菁绿分子(202)，其只有775道尔顿的分子量，被结合在更大的蛋白质、 脂蛋白和磷脂类(204)上。注意到吲哚菁绿(202)具有绿颜色，最大λabs为 800nm，以及最大λem为825nm。在这张图解里，视网膜(206)将含有内部视 网膜血管和外部视网膜血管的脉络膜分开。附图2A显示吲哚菁绿分子(202) 和血浆蛋白质和其他等离子体颗粒(204)的混合物(200A)，说明几乎所有的 吲哚菁绿分子(202)被结合在血浆蛋白质和其他等离子体颗粒(204)上，并 且这些大蛋白质(204)通常在正常的视网膜内防止ICG(202)从血视网膜屏 障里泄漏，如附图2B中所示。附图2C显示来自脉络膜或者外部血视网膜屏障 (200C)的泄漏，而附图2D显示来自内部(200D)血视网膜屏障的泄漏。因此， 附图1C和D说明不同的荧光素泄漏模式和不同程度的血视网膜屏障机能障碍。
附图3描述来本发明的一个实施方案-组合物(300B)包含被结合在不同粒 径的颗粒(302，312，314和316)上的一系列荧光团，其中颗粒表示为大白环， 以及荧光团表示为小圆点(302，304，306和308)。如图所示，最终组合物由 含有不同粒径颗粒的不同荧光团(302，304，306和308)的一系列单独混合物 (300A)制成。在混合并将荧光团和颗粒(310)结合起来之后，三个荧光团被 结合在不同粒径的颗粒上(312，314，316，例如，具有从大约500个道尔顿至 1微米的粒径范围)。一个荧光团(302)是未结合的并且形成最小种类的颗粒。 因此，组合物(300B)包括众多颗粒种类，每个都具有控制粒径，每个都具有 不同的标记物(或者荧光团)(302，312，314，316)，其中标记物或者荧光团 类型标志了珠粒的大小。
附图4描述了本发明组合物的效用，为确定在血管机能障碍度或者在像血 视网膜屏障那样的各种各样的血屏障里的机能障碍程度。使用的组合物(300B) 具有在这张示意图内说明的相同的标记物颗粒(302，312，314，316)，与如附 图3显示的那些相同。因此，在正常的健康血管(400A)里，实质上没有标记 颗粒逃脱血管，基本上没有机能障碍存在，以及机能障碍的程度能够，例如， 被标记为第0阶段或者(没有机能障碍)。如果，最小机能障碍存在(400B)， 非常小的珠粒(302)逃脱血管。这表明存在一些小程度的机能障碍能够，例如， 作为最小或者第1等级机能障碍分级。如果中等机能障碍存在(400C)，有点更 大珠粒以及非常小的颗粒(302和312)逃脱血管。这表明有点较大程度的机能 障碍能够，例如，被标记为中等或者第2等级机能障碍。如果严重的机能障碍 存在(400D)，有点更大的颗粒(314)和更小的以前提及颗粒(302和312)逃 脱血管。这表明存在较大程度机能障碍的能够，例如，被标记为严重或者第3 等级机能障碍。如果，非常严重机能障碍存在(400E)，十分大的颗粒(316) 以及较小颗粒逃脱血管(302，312和314)，存在更巨大程度机能障碍的能够， 例如，被标记为非常严重或者第4等级机能障碍。
附图5描述了在体外实验过程中用不同的发色团显示不同粒径的颗粒制备 的分离，其中分离是通过具有0.2微米大小孔径的膜过滤实现。制备三组染料/ 混合物，其由被结合在尺寸不到0.2微米的PLGA颗粒上的荧光素，结合至尺 寸大于0.2微米PLGA颗粒的吲哚菁绿(ICG)以及两种类型颗粒的混合物组成。 将每组分两个等分进行测试。一个等分经0.2微孔过滤器滤过，以及第二等分没 被过滤。这排图像底部从左到右显示非过滤的荧光素PLGA颗粒，非过滤的荧 光素PLGA和吲哚菁绿PLGA混合物的颗粒和非过滤的吲哚菁绿PLGA颗粒。 上排图像从左到右显示被过滤的荧光素PLGA颗粒(自由地通过过滤器)，被过 滤的混合物，其中荧光素PLGA颗粒自由地通过过滤器，而吲哚菁绿PLGA颗 粒被阻断以及被过滤的吲哚菁绿PLGA颗粒，其被过滤器全部阻断。这一体外 实验过程证明选择性泄漏的概念。
附图6A和6B比较由使用吲哚菁绿(ICG)操作(附图6A)和由靛青(ICG) 常规操作的结合PLGA颗粒(附图6B)获得的血管造影图像。对于附图6A实 验来说，用1毫升生理盐溶液的2.5毫克ICG给药至兔，和对于图6B的实验， 用1毫升生理盐溶液的2.5毫克ICG颗粒(装载3.3％的ICG)给药至兔。然后 观察染料和/或颗粒在兔内视网膜的体内行为。如附图6B中所示，颗粒结合的 ICG引起更明亮，更独特的图像。因为游离ICG结合至组织，而颗粒结合的ICG 不会结合，颗粒结合ICG的使用提供了改进的、清晰的、独特的血管图像。
附图7A和7B比较由使用常规可用的游离荧光素血管造影术(附图7A) 或者使用常规的操作被结合在颗粒上的荧光素血管造影(附图7B)获得的图像。 两种荧光素产物给药至兔并观察染料/颗粒在兔视网膜内的体内行为。正如所示， 颗粒结合的荧光素使得图像没有显著的背景。因为游离荧光素结合组织，而颗 粒结合的荧光素不结合组织，颗粒结合荧光素的使用提供了改进的、清晰的、 独特的没有背景荧光的血管图像。
附图8A-F描述了将组合物的混合物给药至兔后，粒径的不同标记组在视网 膜中的选择性泄漏。附图8A-C在一种ICG结合颗粒和游离荧光素的混合物的 给药之后，健康的视网膜血管的血管造影图像。在附图8B里发现ICG结合颗 粒，而在图8C里发现荧光素结合颗粒。附图8A显示在正常的兔视网膜里从ICG 结合颗粒和游离荧光素发现荧光。附图8D-F是在对一只兔的ICG结合颗粒和 游离荧光素的混合物的给药之后，中等机能障碍的视网膜的血屏障的血管造影 图像。在兔体内通过LPS(脂多糖20纳克)的玻璃体体内注射，引起中等血视 网膜屏障机能障碍。在附图8E检测到该ICG结合颗粒，而在附图8F中检测到 游离荧光素。附图8D显示在这只中等机能障碍的兔视网膜的血屏障里从ICG 结合颗粒和游离荧光素发现荧光。注意，在正常兔视网膜内(附图8A-C)都没 染料泄漏，而在中等机能障碍的血视网膜屏障模型里，更小的未结合的荧光素 颗粒从视网膜的血管泄漏(附图8D和8F的绿色着色)，而颗粒结合的ICG(在 附图8D&E里的红色)没有泄漏。
发明详述
本发明涉及一种不同的清楚大小基团并且清楚地标记颗粒或者小珠的组合 物。本发明的组合物可以用于定量评价血屏障(例如，血视网膜屏障)完整性 的方法，通过检测在血屏障(例如，在玻璃体里)外边发现颗粒的粒径。颗粒 的大小通过观察哪种类型的染料或者标记物在血屏障的外部上存在而被鉴定。 本发明的组合物也可用于确定或者检测通过血管的血流量的方法(例如，和在 血流量方面鉴定部分或者完全阻塞，或由于全身或者局部的问题减少血流的速 度)，通过检测颗粒流过血管的速度和粒径。因此，血管的部分阻塞可以经通过 观察血管的粒径突然改变而检测。为检测这些事件(例如，泄漏，部分阻塞)， 将不同的染料或者标记结合到，吸附到或者加载到不同尺寸颗粒上，以产生本 发明的组合物。
根据本发明，在血屏障中的破裂程度通过观察从该血屏障中泄露的较大颗 粒的程度进行评价。例如，在血视网膜屏障(BRB)轻微机能障碍的情况下只 有较小的颗粒泄漏，而当BRB机能障碍更严重时，较大粒径的颗粒泄漏。颗粒 的大小通过观察逃脱血屏障的标记物或者染料来测定。血屏障泄露或者机能障 碍的严重程度可以通过血屏障泄漏的粒径将其分级。泄漏的颗粒在此反映血屏 障中孔的大小。在血管里的大多数组合物颗粒的存在是血管实质上完整的证据。 因此，治疗剂和操作可用来恰当处理被检测血管泄漏的程度。
经过血管的血流量(以及在血流中可能的阻塞)也能使用本发明的颗粒组 合物进行评价。因此，当使用本发明的组合物观察血流量时，在较大的血管里 将会检测到较大颗粒和较小颗粒的混合物，但是在更小的血管里可能观察到较 小的颗粒。然而，如果在较大血管里已经发生阻塞，将会在阻塞下游观察到粒 径方面的变化。特别地，与阻塞的上游观察相比，将在阻塞的下游观察到较大 比例的较小颗粒。
颗粒
如上所述，本发明的组合物含有被标记的不同大小的颗粒。特别地，组合 物包含一系列颗粒组，每一颗粒组具有在组合物里不同于其他颗粒组平均直径 的平均直径。而且，每一颗粒组具有独特的标记物，其发射在组合物里可容易 同其他颗粒组的标记物/信号区分的特别信号。
选择颗粒组尺寸以允许进行血屏障或者血管泄漏的严重程度的评价。因此， 使用多种的尺寸。通常，组合物使用大约2到大约20或者大约2到大约10种 不同的颗粒组尺寸。在一些实施方案中，组合物中使用大约2到大约8，或者大 约2到大约6种不同的颗粒组尺寸。粒径能随分子量或者尺寸(例如直径)而 变化。例如，颗粒可能像500道尔顿、或者800道尔顿、或者1000道尔顿或者 5000道尔顿一样小。颗粒也能具有像100,000,000道尔顿或者1,000,000,000道 尔顿一样大的分子量。在一些实施方案中，颗粒具有高至约3微米，或者高至 约2微米或者高至约1微米的直径。在其他实施方案中，颗粒能例如，具有直 径像大约10皮米一样小，或者大约100皮米，或者大约1纳米。因此，例如， 珠粒在尺寸方面范围为从大约10皮米到大约3微米，或者大约100皮米到大约 2微米，或者大约1纳米至大约1微米。在一些实施方案中，颗粒能在大约10 皮米到900纳米直径或者大约1纳米到大约1微米的范围内。
例如，在本发明的组合物里一组颗粒能有大约1-2微米的平均直径，在组合 物里的另一组颗粒能有大约400-600纳米的平均直径，又一组颗粒能有大约 100-200纳米的平均直径，另一组颗粒能有大约40-60纳米的平均直径，更进一 步的组能有大约5-20纳米的平均直径，以及一个最终的组能由一类游离标记物 组成。
颗粒可以由可生物降解材料制成，其将逐渐在活体的身体里溶解。或者， 颗粒可以由不能生物降解的材料或者可生物降解和不能生物降解的材料的组合 制成。而且，用于本发明颗粒的材料基本上没有任何毒性或者其他对主体有害 的影响。通常，在颗粒中使用的颗粒和/或材料不充分疏水，以致吸收或者吸附 到组织和生物分子上。本发明的颗粒优选容易悬浮或者溶解于水性溶液，且在 需要执行本发明诊断方法的时间内(例如，约6到约24个小时)基本上不会损 失标记物/染料或其整体结构。
合适的可生物降解材料能在体内(例如通过酶促作用)分解或者溶于身体 的水相环境。合适的可生物降解材料的例子包括多糖、聚亚烷基二醇、蛋白质、 肽、类蛋白微球体等等。在一些实施方案中，使用聚(D，L-丙交酯-共-乙交酯) (PLGA)、聚乳酸、聚乙醇酸、双乳酸和乳酸乙醇酸共聚物，其可购自Poly Sciences Incorporated，Moorington，PA或者Birmingham Polymers(Durect Corporation， Pelham，AL)。也可使用其他生物可降解聚合物，例如，聚亚烷基二醇(例如， 聚乙二醇)、蛋白质、类蛋白微球体(热处理的氨基酸混合物)、脂质体等等。
正如此处所述，载有荧光素钠和吲哚菁绿的聚(D，L-丙交酯-共-乙交酯) (PLGA)纳米颗粒已经成功生产并用于检测血视网膜屏障泄露。
在本发明的组合物中不同颗粒组的浓度可以根据本领域技术人员的期望而 改变。在一些实施方案中，组合物包含大约相同数量的每一颗粒组，象以颗粒 数目或者以标记物信号评价的那样。因此，组合物可具有颗粒组，其中每一颗 粒组具有大约相同数目的颗粒。可选择地，当各种各样的颗粒组包含有不同信 号强度的不同标记物时，颗粒组的组合物可以被调整，以便每一颗粒组发射大 约相同数量的信号，不管颗粒数目。
标记物
多种标记物可用于本发明的颗粒上。基本上任何类型的标记物均可以使用。 然而，它可能是便于全部能被单个的设备检测的各种各样的颗粒组选择使用的 标记物。因此，例如，不同的荧光团或者发光分子可以混入各种各样颗粒组中， 或者不同放射性同位素，或者不同金属，或者不同有磁性或者顺磁性原子，或 者不同的红外线或者紫外线辐射吸收或者发射分子，或者不同的酶制剂都能用 于颗粒。
在一些实施方案中，不同的荧光团用于不同的颗粒组。例如，颗粒组可具 有荧光素、异硫氰酸荧光素、吲哚菁绿、若丹明红、太平洋蓝、德克萨斯红、 alexa-532、羟基香豆素、氨基香豆素、甲氧基香豆素、氨基甲基香豆素、级联 蓝、荧光黄、P-藻红蛋白、R-藻红蛋白、丽丝胺若丹明B、别藻蓝蛋白、俄勒冈 绿、四甲基若丹明、丹磺酰、monochlorobimane、钙黄绿素和其他荧光团标记物。
当前，视网膜血管造影术通常涉及荧光素血管造影术(FA)和/或吲哚菁绿 血管造影术(ICGA)。荧光素钠，用于FA的染料是376.27D橙褐色染料，其 是70-80％结合在血浆蛋白上，而其余20-30％是游离的。荧光素的最大吸收波 长是492nm，以及它的最大发射波长是518。另一方面，大约98％的吲哚菁绿 (ICG)-775D结合在血浆蛋白质、脂蛋白和磷脂类上，未结合的染料数量很少。 吲哚菁绿的最大吸收和发射波长分别是800nm和825nm。这两种染料在吸收和 发射光谱上的差异，在血管造影术中描述它们的能见度中起主要作用。视网膜 色素上皮(RPE)层堵塞荧光素的短波长发光，因此脉络膜血管不可见，只有 视网膜的血管可能被看见。另一方面，吲哚菁绿有更长的发光范围并且没有因 为RPE层被堵塞。这些性质允许另外用吲哚菁绿将脉络膜除视网膜血管之外的 血管可视化。
两种颜料之间的第二种差异是其结合特性。在视网膜中，染料分配的运动， 部分取决于它的有效粒径，特别是它的分子大小，如果未结合，或者在染料结 合的情况下颗粒染料的复合尺寸。ICG几乎完全结合至蛋白质、脂蛋白和磷脂 类上并且因此跟随这些颗粒的分配。另一方面，荧光素只是70-80％结合在血浆 蛋白质上，剩下20-30％的分子是未结合的，并且有能力渗透结合的ICG不能逃 脱的小孔(例如，来自不可透ICG的多孔的脉络膜毛细血管的荧光素的泄漏)。 染料的结合与它们的物理化学结构有关。然而，当加载到颗粒上后，染料失去 其结合血浆蛋白质的能力。因此，当结合至本发明的颗粒时，与染料的组织吸 收相关的问题，包括高的背景信号和使用染料的高剂量的需要，得以解决。
当荧光的标记物用于确定血管位置以便荧光团能吸收并且发射光时，很多 血管不被那么方便地定位，以致于没有侵入性的操作，就可检测这一荧光信号。 因此，非荧光的标记物和染料也能用于本发明的颗粒上，这些非荧光标记物的 信号和染料可以被非侵入性操作检测，例如放射线照相术、超声波、磁共振等 等。
例如，颗粒可以被可并入颗粒内腔的以下物质标记，放射性标记物、有磁 性的标记物、顺磁标记物、造影剂和/或气体。
就顺磁离子而论，本领域技术人员可选择的离子例如，举例而言，铬(III)、 锰(II)、铁(III)、铁(II)、钴(II)、镍(II)、铜(II)、钕(III)、钐(III)、 镱(III)、钆(III)、钒(II)、铽(III)、镝(III)、钬(III)和铒(III)，其中优 选钆。适用于其他上下文内容的离子，例如X射线成像，包括，但是不限于镧 (III)、金(III)、铅(II)，以及特别是铋(III)。
就为诊断应用的放射性同位素而论，本领域技术人员可以使用碘131、碘123、 碘125、锝99、铟111、磷32、铼188、铼186、镓67、硫35、铜67、钇90、氚3或者砹 211。
标记物可通过可用的操作被吸附或者共价连接至颗粒。在一些实施方案中， 颗粒同时形成并且被标记。在其他实施方案中，生产颗粒以及在随后的时间增 加标记物。标记物和染料可直接吸附或者附着至颗粒，或者那些标记物和染料 可通过连接基团或者合适附着的基团间接附着。
因此，例如，纳米颗粒可以使用纳米沉降技术(Chorny et al.，2002，Journal of Controlled Release 83：389-400和401-414)或者其变体进行制备。例如，聚合物 (如聚(D，L-丙交酯-共-乙交酯)(PLGA))和标记物可以溶于一种溶剂混和物(例 如丙酮、乙醇和二氯甲烷)，然后倒入在漏斗内的含1％聚乙酸乙烯酯(PVA) 的水相中，使用适度搅拌蒸馏水。过夜蒸发有机相之后，过滤悬浮混悬液并离 心分离。颗粒球团可在水中再混悬并冻干。颗粒可被重新悬浮在合适的生理溶 剂中，例如水或者磷酸缓冲生理盐水。
可选择地，在生产期间可将合适的连接基团增加到颗粒。例如，可以用于 连接基团和/或标记物和染料附着的官能团。能形成共价键的官能团包括，例如， -COOH和-OH；-COOH和NH2；以及-COOH和-SH。例如，连接基团可方便 地与检测的标记物或染料连接，通过：1)酰胺(-N(H)C(＝O)-，-C(＝O)N(H)-)， 2)酯(-OC(＝O)-，-C(＝O)O-)，3)醚(-O-)，4)硫醚(-S-)，5)亚硫酰(-S(O)-)， 或者6)磺酰基(-S(O)2)。这样的连接可以使用本领域公知的合成工艺由适 当的功能化起始原料制备。
血屏障机能障碍的检测
根据本发明，在哺乳动物中的血屏障机能障碍可以被检测并且通过观察从 哺乳动物血管中逸出的颗粒确定数量。在颗粒上的不同标记物允许检测逃脱颗 粒，并且那些逃脱颗粒的不同尺寸允许诊断血屏障机能障碍的程度。因此，在 血屏障外边检测标记物的类型和在一些实施方案中，标记物的浓度使这样的诊 断变得容易。
对定量测定这样的机能障碍，可以基于逃脱的颗粒的类型来分配数值。因 此，如果基本上没有检测到颗粒逃脱，这个血屏障可鉴定为具有0级，或者没 有血屏障机能障碍。如果较小的颗粒逃离血管，血屏障可以鉴定为级别1或者 轻度血屏障机能障碍。如果稍微有点更大的颗粒逃离血管，血屏障可以鉴定为 级别2或者中度血屏障机能障碍。如果有点更大的颗粒逃离血管，血屏障可以 鉴定为级别3或者有点严重血屏障机能障碍。如果更大颗粒逃离血管，血屏障 可以鉴定为级别4或者非常严重血屏障机能障碍，等等。
逃离血屏障的颗粒可以通过任何方便的方式进行检测。例如，颗粒的逃脱 可以通过以下方法检测，使用断层摄影术，改良的断层摄影术，改良的光学结 合性断层摄影术(Optical Coherence Tomography)(OCT)，改良的共焦扫描激光 眼底检查法(SLO)，改良的复合装置(SLOIOCT)或者能够在体内检测标记物 或者染料(例如荧光团)的任何其他设备。
可在多种组织里检测血屏障机能障碍，例如，在眼、脑和其他组织里。在 一些实施方案中，本发明的组合物和方法用来检测血视网膜屏障完整和/或机能 障碍。
本发明的组合物和方法可以检测很多类型的血屏障机能障碍。可以检测的 血屏障机能障碍的例子包括，例如，糖尿病视网膜病、黄斑变性、CMV眼感染、 视网膜炎、脉络膜局部缺血、急性的扇形脉络膜局部缺血、缺血性视神经萎缩 和其他疾病。
方法
如上所述，本发明的一方面是一种在哺乳动物中用于定量测定血管泄漏的 方法，包括：(a)向哺乳动物给药多色颗粒的组合物；(b)观察是否对哺乳动 物的血管外部发出色信号；以及(c)如果色信号被发射，确定是什么发出的色 信号，并由此定量测定哺乳动物内的血管泄漏；其中多色颗粒的组合物包括一 系列颗粒组，每个颗粒组有一个独特的直径粒径范围和提供独特信号的独特发 色团。如果色信号发射于哺乳动物的血管外部，一个或多个已经由血管外渗(即， 泄漏)。
本发明更进一步为鉴定能调节血屏障完整的试剂提供方法。这样的方法可 以不仅用于鉴定提高血屏障完整的有益试剂，还用于评估试剂是否有毒或者导 致血屏障机能障碍。
因此，本发明的一方面是用于鉴定能在哺乳动物中调节血屏障完整的试剂 的方法，其包括向哺乳动物给药测试试剂和本发明的颗粒组合物，并且定量测 定逃离哺乳动物血屏障的颗粒，与向哺乳动物给药仅有本发明的颗粒组合物(如 果没有测试试剂)时所观察到的颗粒逃离相比较。增加颗粒逃脱的测试试剂可 能是有毒的。
可选择地，减少颗粒逃脱的测试试剂可以是用于血屏障机能障碍和不适当 血管泄漏治疗的有益治疗剂。因此，在一些实施方案中，哺乳动物能具有机能 障碍的血屏障(例如，机能障碍的视网膜的血屏障)，并且该方法用来筛选改进 血障碍功能的测试试剂(即，抑制颗粒逃脱)。因此，本发明的另一方面是用于 鉴定能在哺乳动物中促进血屏障完整的试剂的方法，其包括向哺乳动物给药测 试试剂和本发明的颗粒组合物，并且定量测定逃离哺乳动物血屏障的颗粒，与 向哺乳动物给药仅有本发明的颗粒组合物(如果没有测试试剂)时所观察到的 颗粒逃离相比较。在本发明的筛选过程中，患有血屏障机能障碍的哺乳动物显 示颗粒逃离自血屏障。
本发明的另一方面是检测和/或监控在哺乳动物中经过血管的血流量的方 法。这种方法包括把本发明的颗粒组合物给药至哺乳动物，之后观察在哺乳动 物中通过血管的颗粒流的速度和类型。
虽然当光能够通过血管(例如，视网膜血管)时，颗粒可以用荧光染料标 记，但是当血管没那么容易被观察时可以使用非荧光标记物。因此，没有侵入 性的操作，光不可能从脑、心脏、附肢和其他组织里的血管以容易能检测的方 式吸收并且发射。为避免这样的侵入性的操作，颗粒可以由以下可并入颗粒内 腔的物质标记：放射性标记物、有磁性的标记物、顺磁标记物、造影剂和/或气 体。
就顺磁离子而论，本领域技术人员可选择的离子例如，举例而言，铬(III)、 锰(II)、铁(III)、铁(II)、钴(II)、镍(II)、铜(II)、钕(III)、钐(III)、 镱(III)、钆(III)、钒(II)、铽(III)、镝(III)、钬(III)和铒(III)，优选钆。 适用于其他上下文的离子，例如X射线图像，包括，但不限于镧(III)、金(III)、 铅(II)，以及特别是铋(III)。而且，就为诊断应用的放射性同位素而论，本领 域技术人员可以使用碘131、碘123、碘125、锝99、铟111、磷32、铼188、铼186、镓 67、硫35、铜67、钇90、氚3或者砹211。
因此，本发明的组合物能用于确定或者监护血管中的血流量。例如，可以 监控心脏、大脑、内脏(例如肝、肾、肠、胃)，以及附肢中的血流量。另外， 使用本发明的组合物和方法，也能够监控通往心脏、大脑、内脏(例如肝、肾、 肠、胃)以及附肢的血管中的血流量。
可以用于测试、检查或者诊断的哺乳动物包括人和家畜，例如兔、小鼠、 大鼠、狗、猫、绵羊、山羊、牛、马和动物园的动物。
组合物
给药本发明被标记的颗粒组合物，以允许血屏障的完整和/或机能障碍的分 析和/或监控血流量。
为了允许分析，组合物通常以单个剂量或者两个剂量或者分开的剂量给药。 剂量可以变化，例如，可以至少是大约0.01毫克/千克到大约500至750毫克/ 千克，至少大约0.01毫克/千克到大约300至500毫克/千克，至少大约0.1毫克 /千克到大约100至300毫克/千克或者至少大约1毫克/千克到大约50到100毫 克/千克颗粒组合物每体重，尽管其他剂量可以提供有益效果。给药量将依赖各 种各样的因素而变化，包括但不限于，什么类型的标记物用于颗粒、给药途径、 血屏障损坏的进展或缺乏进展、体重、血压、物理条件、健康以及病人的年龄。 临床医师可以使用动物模型或者其他本领域常规的测试系统容易的确定这些因 素。
组合物可以通过在此描述的方法或者通过本领域常规的步骤制备，并且根 据需要或者想要的那样纯化。之后，将该颗粒组合物冻干或者稳定；它们的浓 度可以被调整至合适的量，并且可以任选的加入其他试剂。因此，给出的颗粒 组或者其组合物的绝对重量，是可以大幅度地变化的剂量单位。例如，大约0.01 至大约2个克，或者大约0.1至大约500毫克，其中两个颗粒组至少可以被给药。 可选择地，单位剂型可以变化，至少两颗粒组从大约0.01克到大约50克，从大 约0.01克到大约35克，从大约0.1克到大约25克，从大约0.5克到大约12克， 从大约0.5克到大约8克，从大约0.5克到大约4克，或者从大约0.5克到大约 2克。
本发明的颗粒组中可以包含药学上可接受的载体。“药学上可接受”，它的 意思是载体、稀释剂、赋形剂、和/或盐与制剂的其他成分相容，而对其受体无 毒。在本发明组合物中使用的非限制的载体和/或稀释剂的例子，包括水、水溶 性糖溶液、生理学可接受的缓冲生理盐水，例如，pH值7.0-8.0的磷酸盐缓冲生 理盐水等等。
本发明的组合物可以制备为静脉内、动脉内或者内部血管给药。
试剂盒
本发明进一步关于包装的组合物，例如试剂盒或者为检测血屏障健全和/或 损坏或者为检测血流量的其他容器。试剂盒或者容器装有包括一系列颗粒组的 组合物，每一颗粒组具有不同的平均直径和独特的标记物。在试剂盒或者容器 里提供用于检测血屏障健全和/或血屏障损坏的说明书。
可选择地，这个试剂盒可设计为用于检测和/或监控血流量和适合检测血流 量的问题。试剂盒或者容器装有包括一系列颗粒组的组合物，每一颗粒组具有 不同的平均直径和独特的标记物。试剂盒或者容器里提供用于检测和/或监控血 流量和检测血流量问题的说明书。
本发明的试剂盒也可包括用于给药本发明组合物的工具。这样的工具包括 注射器、药签、导管、抗菌溶液等等。
下列实施例更进一步说明本发明并且目的不在于限制本发明。
实施例1材料和方法
材料：聚(D，L-丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)，Mw＝10,000Da(固有粘度： 0.17dL/g)，购自Birmingham Polymers(Durect Corporation，Pelham，AL)。 吲哚菁绿，荧光素钠和聚(乙烯醇)(PVA)得自Sigma-Aldrich(St Louis，MO)。 二氯甲烷得自Acros(Morris Plains，NJ)。全部其他化学制品为分析等级并且得自 地方来源。
纳米颗粒制剂：用稍加改良的纳米沉淀技术(Chorny et al.，2002，Journal of Controlled Release)制备PLGA纳米颗粒。简单的说，将聚合物(70毫克)和 吲哚菁绿或者荧光素(30毫克)溶于15.5毫升丙酮、4毫升乙醇和0.5毫升二 氯甲烷的混合物中，并且倒入滤出的1％PVA水相中，在适度搅拌下加入蒸馏水 (40毫升)。在加热的水浴器(Buchi Heat Bath B490)内使用Rotovap(Buchi Rotavapor R200，Buchi Analytical Inc.，New Castle，DE)37℃下过夜蒸发有机相之 后，将混悬液通过0.2μm过滤器(Fisher Scientific，Pittsburgh，PA)过滤，随后在 4℃下35,000g离心分离30分钟。颗粒片状物在双蒸水(20ml)中再混悬并冷冻 干燥。
纳米颗粒表征：
粒径分析：在双蒸水内稀释的颗粒悬浮液以高速离心(Vortex Genie， Scientific Industries，Bohemia，NY)使颗粒再悬浮变得容易。使用ζ分粒器检测粒 径，大小分布和正电势，基于动态的光散射的粒径分析器(Brookhaven Instruments Co.，Holtsville，NY)。
药物装载：在玻璃Kimble管中，向1毫克冻干的吲哚菁绿或者荧光素装载 的PLGA颗粒，加入1毫升二氯甲烷并将试管密封。将试管高速(Vortex Genie， Scientific Industries，Bohemia，NY)离心。离心1小时之后，使用N-Evap蒸发二 氯甲烷萃取物。残余物质在1毫升双蒸水中经5分钟高速离心重构。然后使用 紫外分光光度计或者荧光分光光度计分析溶液。在二氯甲烷中的含有或不含聚 合物的相同量染料对照品(吲哚菁绿或者荧光素)也进行同样的处理，并确保 溶质的接近完整的回收。
动物研究：
Male Dutch Belted兔用于动物研究。分别使用一氯胺酮和赛拉嗪的组合物 35和5毫克/千克体重将兔麻醉。使用托吡卡胺和脱羟肾上腺素扩大每只兔的 右眼。然后通过近耳的叶脉注入荧光素，吲哚菁绿、荧光素PLGA、吲哚菁绿 PLGA或其组合。通过HRAH激光扫描眼底检查法(Heidelberg Engineering， Heidelberg Germany)同时使用荧光素和靛青模块捕获并且记录图像和录像。在 一些实例里，更进一步使用Adobe Photoshop(7.0)增强视网膜血管造影照片。 全部动物根据Columbia University Institutional Animal Care and Use Committee和 Association of Research in Vision和Ophthalmology的指导方针进行处理。
实施例2：检测血视网膜屏障机能障碍
这个实施例显示使用不同大小、不同标记的颗粒的组合物来检测血-视网膜 屏障损坏。
过滤研究说明不同的粒径
如图5中所示，不同粒径的颗粒制剂与不同的发色团一起产生。不同粒径 的颗粒的分离和检测受到具有不同孔径大小的膜的过滤的影响。因此，制备了 两个颗粒组的组合物，如图5中所示(下排，最右侧)。该组合物显示于图5(下 排，中间)。组合物包含较小的，荧光素标记的PLGA颗粒以分开的形式显示于 图5(下排，左)，和较大的吲哚菁绿PLGA颗粒显示于图5(底部，右侧)。因 此，组合物包含荧光素PLGA和吲哚菁绿PLGA混合物和吲哚菁绿PLGA。
图5的上排说明荧光素标记的颗粒是较小的颗粒和吲哚菁绿标记的颗粒是 较大的颗粒。因此，荧光素PLGA颗粒自由地滤过0.2微孔的过滤器(图5，上， 左)，而吲哚菁绿PLGA未通过0.2微孔的过滤器(图5，上，右)。当两个颗粒 的混合物被过滤时，吲哚菁绿PLGA未通过，但是荧光素PLGA通过(图5， 上，中间)。因此，吲哚菁绿PLGA颗粒具有平均直径比0.2微米大，而荧光素 PLGA颗粒具有比0.2微米小的平均直径。
本发明的组合物检测血视网膜屏障机能障碍
图6显示通过常规可行操作的以本发明的组合物和方法检测的健康的，0 级血视网膜屏障对照图。图6A显示使用常规可用的操作制备和游离吲哚菁绿 (ICG)获得的一系列血管造影图像。图6B显示使用有靛青(ICG)结合PLGA 颗粒的常规操作获得的一系列血管造影图像。这两个ICG制剂被给药至兔的耳 静脉，并在兔视网膜里观察该ICG产物的体内行为。正如所示，颗粒结合的ICG 引起更明亮，更独特的图像。因为游离ICG结合组织，而颗粒结合的ICG不， 颗粒结合的ICG的使用提供改进的清楚和独特的血管图像。
图7显示血管造影图像的比较，通过常规可用的游离荧光素血管造影术(图 7A)或者本发明的组合物，其中荧光素被结合在颗粒上(图7B)获得。两种荧 光素制剂被给药至兔的耳静脉，并观察在兔视网膜内的体内行为。颗粒结合的 荧光素引起图像没有显著的背景(图7B)。因为游离荧光素结合组织，而颗粒 结合的荧光素不，颗粒结合荧光素的使用，提供了改进的、清晰的、独特的没 有背景荧光的血管图像。
图8A-F说明组合物的混合物给药至兔后，不同粒径标记组在视网膜内的选 择性泄漏。图8A-C为在ICG结合颗粒和游离荧光素的混合物给药之后，健康 的视网膜血管的血管造影图像。在图8B里，检测ICG结合颗粒，而在图8C里 检测荧光素结合的颗粒。附图8A显示正常的兔视网膜里从ICG结合颗粒和游 离荧光素检测荧光。图8D-F为在对正常兔的ICG结合颗粒和游离荧光素的混 合物给药之后，轻度机能障碍视网膜的血屏障的血管造影图像。通过玻璃体内 注射LPS(脂多糖20纳克)诱导Uvietis，在兔中引起轻微视网膜的血屏障机能 障碍。在图8E里检测游离荧光素，而在图8E里检测ICG结合颗粒。图8D显 示在这只轻度机能障碍的兔视网膜的血屏障里从ICG结合颗粒和游离荧光素检 测荧光。注意，在正常兔视网膜内(附图8A-C)没有染料泄漏，当在轻度机能 障碍的血视网膜屏障模型里时，从视网膜血管中泄漏最小的未结合荧光素颗粒 (在图8D和8F血管外的亮区(在原物里的绿色))，而颗粒结合的ICG(附8D& E中较亮的血管(在原物里的红色))未泄漏。
用兔执行下一步操作，其用于说明在血视网膜屏障里的第3等级的机能障 碍。用单独的游离荧光素或者与吲哚菁绿PLGA颗粒和游离荧光素的组合物来 检测这样的机能障碍。通过玻璃体内注射LPS(脂多糖20纳克)诱导Uvietis， 在兔中引起视网膜的血屏障机能损坏。当给药游离荧光素和吲哚菁绿PLGA颗 粒时，仅有游离的未结合的荧光素渗透出血视网膜屏障，而吲哚菁绿颗粒没有 泄漏。
此处引用或者提及的全部专利和出版物都预示着本发明所述技术领域的普 通技术人员的技术水平，并且每一篇引用的专利或出版物在此引入作为参考， 就像其已经通过分别引用全部合为一体或全文陈列于此。申请人保留完全的向 本说明书并入来自任何上述引用的专利或者出版物的任意和全部材料和信息的 权利。
在此描述的具体方法和成分是优选实施例的代表，并且是可以效仿的并且 不会成为对本发明范围的限制。本领域普通技术人员通过考虑本发明可以想到 其他物体，方面和实施方案，并且包含在如权利要求定义范围的本发明的精神 之内。此处公开的本发明的变化置换和改良对本领域普通技术人员是显而易见 的，其不会超出本发明的范围和精神。本发明在此说明性质描述可以在缺乏一 种或任意元素、限制条件的情况下适当进行，其作为基础不在此处特定公开。 在此说明性质描述的方法和过程，可以按照不同的步骤顺序执行，并且没有必 要限制到此处说明的步骤顺序或者权利要求。如此处所用以及在所附权利要求 中，除非上下文中有明确的指示，否则“一”、“一种”和“一个”包括复数引用。因 此，例如，提到“寄主细胞”包括复数的这种寄主细胞(例如，细胞培养或者种 群)，等等。本申请无论如何不可以被解释为局限于在此明确公开的具体实施例 或者实施方案或者方法。本申请无论如何不愿被任何审查员或者专利和商标局 的任何其他官员或者雇员解释为被任何陈述限制，除非这些陈述是申请人在答 复中明确而且在限制之外或明确保留性采用。
已经被使用的那些术语和表达方式被用作描述术语而不是限制，并且，在 使用这样的术语和表达方式过程中没有目的排除任何由此显示和描述的特征或 者其中部分的等价物，但是公认的是，如权利要求所述本发明范围内的各种各 样的改良是可能的。因此，可以理解为虽然本发明已经明确公开为优选实施例 和可选择的特征，本领域技术人员能够胜任改进和变化此处公开的概念，并且 这些改进和变化认为是在本发明范围内，正如附加权利要求所定义。
本发明已经被广泛而通俗的在此描述。属于普通的公开的每个更狭窄的种 类和亚属的基团也成为本发明的一部分。这包括申请的非专利性描述，包括在 此被明确列举的从种类中条件或负限制排除的主题，不管是否被删除的材料。
另外，本发明的特征或者方面被依据马库什族描述，本领域普通技术人员 将认识到，本发明也因此描述为依据马库什族成员的任何个别的成分或者亚类 型。
其他实施方案在如下内容权利要求内。另外，本发明的特征或者方面被依 据马库什族描述，本领域普通技术人员将认识到，本发明也因此描述为依据马 库什族成员的任何个别的成分或者亚类型。