具有纤溶亢进的凝血病的治疗 【技术领域】
本发明涉及具有纤溶亢进的凝血病的领域。更具体而言， 本发明涉及治疗血友病 疾病， 诸如血友病 A 或血友病 B。 【背景技术】
血友病是损伤身体的控制血凝固或凝血的能力的一组遗传性遗传病症， 所述凝血 在血管破裂时用于停止出血。血友病 A， 最常见的形式， 产生自因子 VIII 的基因突变 ； 血友 病 B， 也称为 Christmas 病， 产生自因子 IX 的基因突变。血友病 B， 如血友病 A， 是 X 连锁的 及占血友病病例的约 12％。症状与血友病 A 的相同 ： 损伤之后过量的出血 ； 及自发出血， 尤 其进入承重关节， 软组织及粘液膜。 重复的出血进入关节导致关节积血， 导致常常使需要关 节置换的疼痛致残关节病。软组织中的血肿可导致坏死性凝集的血组成的假肿瘤 ； 它们可 阻碍， 压缩或破裂到相邻器官和可导致感染。一旦形成， 血肿难以治疗， 甚至用手术。压缩 之后的神经恢复差， 导致麻痹。如果不检测， 涉及消化道， 中枢神经系统， 或气道 / 腹膜后空 间的那些出血发作可导致死亡。颅内出血是血友病患者死亡的主要原因。
在美国估计有 100,000 例先天性血友病。这些中， 约 20,000 是血友病 B 的情况， 该患者的血或者完全缺乏因子 IX， 或血浆因子 IX 组分严重地缺陷。 因此疾病存在改变程度 的严重性， 需要从每周达一年一次或两次的治疗。 完全缺陷情况需要每周一次替代治疗 ； 部 分缺陷情况需要仅当出血发作发生时治疗， 其可稀少至一年一次。 先天性， 部分缺陷情况中 的出血发作通常由暂时获得的感受性而非由损伤单独导致。 静脉内注射足够大量的新鲜血 浆， 或相当的量的新鲜血暂时校正缺陷受试者的缺陷。有益效应常常持续 2 或 3 周， 尽管通 过对患者的血体外测试测量的凝固缺陷呈现改善仅 2 或 3 天。
该用新鲜血浆或新鲜血的治疗有效， 但其具有几个严重的缺点 ： (1) 其需要大量 的新鲜血浆的现成可利用性 ； (2) 需要血浆施用的住院治疗 ； (3) 大量的患者成为致敏于重 复的血或血浆输注及最终遭遇致死的输注反应 ； (4) 至好血浆可仅部分缓和缺乏 ； 及 (5) 延 长的治疗或手术是不可能的， 因为需要的大量的血或血浆会导致急性和致死的水肿。
改善的治疗包括用因子 VIII 或因子 IX 浓缩物静脉内替代治疗。但是， 此治疗 也有几个缺点 ： (1) 当治疗主要出血发作时， 甚至在迅速检测和治疗之后仍保留组织损伤 ； (2) 大量的患者成为用凝血因子难治， 且发展针对凝血因子的抑制性抗体 ( 所谓的具有抑 制物的血友病 ) ； (3) 尽管改善的病毒灭活方法， 仍有增加的被致死的病毒诸如 HIV 和丙型 肝炎污染的风险 ( 在 USA， 估计大于 50％的血友病群， 超过 10,000 人， 自变质的血供给感染 HIV) ； (4)， 在发展中国家， 分离的且尤其重组体凝血因子非常昂贵， 且通常不可利用。
在替代治疗外治疗或预防出血是挑战， 因为在血友病中出血是可归因于如下三重 缺陷的复合病理生理过程 ： (1) 减少的经低组织因子浓度的外在通路的凝血酶产生， (2) 减 少的经固有通路的凝血酶产生的次级爆发， 及 (3) 纤溶系统被固有通路的缺陷性下调。
通常接受这样的事实， 减少的凝血酶产生导致减少的凝固倾向， 由此导致增加的 出血风险。但是， 过去的几十年的工作表明， 纤溶的缺陷下调也可在血友病中起到作用。结果， 血友病也可分类为具有纤溶亢进的凝血病。
新近出版物通过体外显示， 当在因子 VIII 耗竭的及补充了组织纤溶酶原活化 物 tPA 的血浆 (FVIII-DP) 中形成凝块时， 纤溶不充分下调， 结果凝块溶解提前， 从而支 持 此 推 定 (Broze and Higuchi， Blood1996， 88 ： 3815-3823 ； Mosnier et al. ； Thromb. Haemost.2001， 86 ： 1035-1039)。此外， 可显示， 此 “成熟前溶解” 是由于凝血酶 - 可活化的 纤溶抑制剂 (TAFI) 的减少的或缺乏的活化 (Broze 和 Higuchi， 1996)， 且显示， 在 FVIII-DP 中， 含有活化的 TAFI 的混合物增加凝块溶解时间。从而得出， 稳定的 TAFI 可用于治疗血友 病 (WO02/099098)。
TAFI 在纤溶下调中起到关键的作用， 其为稳定的凝块形成所需要。也称为血浆羧 肽酶原 B2 或羧肽酶原 U 的 TAFI 是血浆酶原， 当其暴露于凝血酶 - 血栓调节素复合物时， 在 92 Arg 通过蛋白水解转变为碱性羧肽酶 (TAFIa 或活化的 TAFI)， 其抑制纤溶。其通过自纤维 蛋白去除 C- 端赖氨酸和精氨酸残基有利地衰减纤溶， 所述纤维蛋白对于结合及活化纤溶 酶原重要。
如上所述， 与凝血酶复合的血栓调节素 (TM) 负责 TAFI 活化。血栓调节素是发挥 衬于血管的内皮细胞上的凝血酶受体的作用的膜蛋白。凝血酶是凝血级联中的中心酶， 其 将纤维蛋白原转变为纤维蛋白， 基质凝块形成。 起初， 局部损伤导致小量的凝血酶从其无活 性前体凝血酶原产生。 进而， 凝血酶活化血小板， 且其次， 某些凝血因子包括因子 V 和 VIII。 后来的作用产生所谓的凝血酶爆发， 大量活化的额外的凝血酶原分子， 其最终导致稳定的 凝块形成。 但是， 当结合到血栓调节素时， 凝血酶活性趋势性变化 ： 凝血酶 - 血栓调节素复合 物的主要特征是其活化蛋白 C 的能力， 其然后通过蛋白水解地灭活必要的辅因子因子 Va 和 因子 VIIIa 下调凝血级联 (Esmon et al.， Ann.N.Y.Acad.Sci.(1991)， 614 ： 30-43)， 由此提 供抗凝活性。凝血酶 - 血栓调节素复合物也能活化凝血酶 - 可活化的纤溶抑制剂 (TAFI)， 其然后拮抗纤溶 ( 见以上 )。
成熟人 TM 由 559 个残基的单多肽链组成， 及由具有下列位置 (SEQ ID NO ： 1 或 SEQ ID NO ： 3 给出的氨基酸位置 ) 的 5 个结构域组成 ： 氨基末端″凝集素 - 样″结构域， 包含 6 个表皮生长因子 (EGF)- 样重复子的″ 6EGF- 样重复结构域″， O- 糖基化结构域， 跨膜结构 域和细胞质结构域 ：
大致氨基酸位置 -18--1 1-226 227-462 463-497 498-521 结构域 信号序列 N- 端结构域 ( 凝集素 - 样 ) 6EGF- 样重复结构域 O- 连接的糖基化 跨膜结构域细胞质结构域使用兔 TM 或重组人 TM 的缺失突变体的蛋白水解片段的各种结构 - 功能研究已将 其活性定位到最后 3 个 EGF- 样重复子。能有效促进 TAFI 活化的最小突变体含有包括表皮 生长因子 -3(EGF3) ～ EGF6 的 c- 环的残基。此突变体相比活化 C 的最小突变体长 13 个残 基； 后者由自连接 EGF3 和 EGF4 ～ EGF6 的域间环的残基组成。
如上所述， 用于治疗凝血障碍诸如血友病的替代治疗不符合医学需求。 重要的是， 无除了用于替代治疗的凝血因子的药物可在预防或治疗血友病患者中利用。
由此， 尽管长期需求开发预防或治疗具有纤溶亢进的凝血病， 尤其是血友病的治 疗， 进展慢， 及仍无保险和有效的治疗剂。
【发明内容】
由此， 本发明的目的是提供用于治疗具有纤溶亢进的凝血病的新手段。
通过提供治疗哺乳动物中， 尤其是人中具有纤溶亢进的凝血病的药物来解决此目 的， 包含以治疗有效剂量呈现抗纤维蛋白溶解效应的血栓调节素类似物。 此新方法基于惊人的发现， 血栓调节素可以呈现甚至以高血浆浓度， 尤其是以大 于 15nM， 尤其是大于 20， 30， 40 或 50nM( 至少达 100nM) 的浓度发挥其致纤溶活性的抗纤维 蛋白溶解活性的方式修饰。因此这些 TM 类似物呈现抗纤维蛋白溶解效应， 且由此适于本发 明的用途。
此抗纤维蛋白溶解效应显示于自血友病患者 ( 其耗竭因子 VIII ； FVIII-DP) 的血 浆。由此展示， 可将该血栓调节素类似物用作治疗剂。
至今， 血栓调节素用于治疗血友病的治疗性用途不被认为是实际选项， 因为从 兔肺血栓调节素 (rlTM) 已知， 其总是甚至在相当低的浓度具有抗 - 及致纤溶活性 ( 见 Mosnier and Bouma ； Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.2006 ； 26 ： 2445-2453 ； 尤其图 5)。 在小于 15nM 的血浆浓度， rlTM 增加凝块溶解时间， 然而在大于 15nM 的血浆浓度， 展示溶解 时间的显著降低 (Mosnier et al.， 2001， Mosnier and Bouma， 2006)， 如最终结果的致纤溶 效应。此在更高浓度的致纤溶效应抑制血友病中的任何治疗用途， 由于潜在过量施剂或感 受性的个体变异会致命地恶化， 延长或甚至导致出血事件。
根据本发明， 存在产生呈现抗纤维蛋白溶解效应的 TM 类似物的各种选项， 由此适 于本发明的治疗。
在一实施方式中， 血栓调节素类似物可以减少的与凝血酶的结合亲和力使用。因 而， 它们可延长正常血浆和 FVIII-DP 中的凝块溶解， 例如达 100nM( 图 4)。
这些发现的重要性是， 这些血栓调节素类似物甚至以高浓度也无有害的致纤溶效 应地呈现抗纤维蛋白溶解效应。此浓度超过最治疗有效剂量。因此， TM 类似物致使治疗具 有纤溶亢进的凝血病。
不受此理论束缚， 发明人显示， TM 类似物的此治疗性潜力可被它们显示显著减 小 的 与 凝 血 酶 的 亲 和 性 解 释。 此 通 过 Bajzar et al 显 示。(J.Biol.Chem 1996 ； 271 ： 16603-16608)， 其发现观察到用于凝血酶和兔肺血栓调节素之间结合的对比 0.2nM 的 KD 值
的 23nM 的 KD 值 (Esmon et al.， Ann.NY.Acad.Sci.1986， 485 ： 215-220)。
因此， 根据本发明的一实施方式， 血栓调节素类似物可用于治疗具有纤溶亢进的 凝血病， 其相比兔肺血栓调节素具有减小的与凝血酶的结合亲和力。
尤其是， 可使用血栓调节素类似物， 其呈现大于 0.2nM， 优选大于 1nM， 2nM， 4nM， 5nM， 7.5nM， 10nM， 12.5nM， 15nM， 17.5nM， 20nM， 22.5nM 或 25nM 的用于凝血酶结合的 KD， 且更 优选 KD 取值跨 10 和 30nM 或更大之间。
在本发明的进一步实施方式中， 血栓调节素类似物的减小的致纤溶活性可由于减 小的活化蛋白 C 的能力 ( 所谓的 “辅因子活性” )。由于蛋白 C 活化导致纤溶上调 (Mosnier 等人， 2001)， 减小的辅因子活性会延长凝块溶解时间。本领域技术人员知道减小血栓调节 素的辅因子活性的几个策略， 诸如例如蛋白的糖基化， 二级或三级结构的变化， 或优选一级 结构的变化， 例如通过一个或更多氨基酸的突变。
在再一实施方式中， 可使用 TM 类似物， 其相比血栓调节素类似物 TMEM388L 具有减 小的辅因子活性， 其中 TME 表示仅由 6 个 EGF 结构域组成的类似物。
根据本发明， 也可使用血栓调节素类似物其具有增加的活化 TAFI 的能力 ( 所谓的 “TAFI 活化活性” )， 由于 TAFI 活化导致纤溶下调 (Mosnier 和 Bouma， 2006)。对于本领域技 术人员， 有几个通过血栓调节素增加 TAFI 活化活性的策略， 诸如蛋白的糖基化， 二级或三 级结构的变化， 或优选一级结构的变化， 例如通过一个或更多氨基酸的突变。 特别， 本发明也提供血栓调节素类似物， 其相比血栓调节素类似物 TMEM388L 具有 显著增加的 TAFI 活化活性与辅因子活性比。
显著地， 根据本发明， 用于治疗凝血病的 TM 类似物具有一种或更多种以上描述的 特征， 即：
(i) 与凝血酶的结合亲和力相比兔肺血栓调节素降低， 和 / 或具有大于 0.2nM 的 kD 值的与凝血酶的结合亲和力 ；
(ii) 相比 TM 类似物 TMEM388L 的辅因子活性减小的辅因子活性， 或者
(iii) 相比 TM 类似物 TMEM388L 增加的 TAFI 活化活性与辅因子活性比。
在本发明的实施方式中， 血栓调节素可用于治疗患有以相比正常受试者显著地或 甚至稍微减小的纤溶发生的任何凝血病的人患者。尤其是， 用血栓调节素类似物可治疗下 列疾病 ： 血友病 A， 血友病 B， 血友病 C， von Willebrandt 病 (vWD)， 获得性 von Willebrandt 病， 因子 X 缺乏， 副血友病， 凝血因子 I， II， V 或 VII 的遗传性病症， 循环抗凝剂所致的出血 性病症 ( 包括针对凝血因子诸如因子 VIII 的自身抗体 ) 或获得性凝血缺乏。
会理解， 可通过本发明治疗维持或达到的治疗性成功依赖于任何特定患者中疾病 的性质和程度。
本发明的特定实施方式涉及预防性治疗凝血病， 以阻止出血或当出血发生时 ( “按 需” ) 急性治疗。待用血栓调节素类似物治疗的出血事件可在生物中的每种器官或组织中 发生， 最重要的是在中枢神经系统中发生， 例如颅内出血， 在关节， 肌肉， 消化道， 呼吸道， 腹 膜后空间或软组织中。
对于预防性治疗而言， 可将 TM 类似物跨延伸的时期以规则间隔给予患者。但是， 在相当局限的时期多个施剂 (“亚慢性治疗” ) 也是可能的。
在本发明的一实施方式中， 血栓调节素类似物在更高出血风险， 例如手术或拔牙
之前给予。
在本发明的进一步实施方式中， 血栓调节素类似物施用给用标准治疗诸如血或血 浆输注或使用凝血因子的替代治疗难治的患者。
根据本发明， TM 类似物可以多剂量施用， 优选在跨不到 1 周至 4 周的整个时期每 天而且每两天， 或每 3 天， 每 4 天， 每 5 天， 每 6 天或每 7 天一次， 更优选作为慢性施用。由 此， 提供根据本发明药物组合物， 其适于允许血栓调节素类似物的多施用。
TM 类似物优选非 - 经口给予， 如肠胃外应用， 例如通过静脉内或皮下应用。 静脉内 或皮下推注应用是可能的。 由此， 提供根据本发明药物组合物， 其适于血栓调节素的肠胃外 施用。
在本发明的一实施方式中， 血栓调节素类似物是可溶性 TM 类似物， 尤其是其中细 胞质结构域缺失及跨膜结构域完全或部分缺失的 TM 类似物。
在本发明的优选的实施方式中， 血栓调节素类似物包含选自下列的至少一种结构 域： EGF3， EGF4， EGF5 或 EGF6， 优选 EGF 结构域 EGF1 ～ EGF6， 更优选 EGF 结构域 EGF3 ～ EGF6， 以及最优选 EGF 结构域 EGF4 ～ EGF6 和特别是包括表皮生长因子 -3(EGF3) ～ EGF6 的 c- 环的片段。
本领域技术人员已知可溶性血栓调节素的各种形式， 例如 Asahi 公司 (Tokyo， Japan) 开发的所谓的 ART-123 或 PAION DeutschlandGmbH， Aachen( 德国 ) 的目前尚未开 发完全的重组体可溶性人血栓调节素 Solulin。 重组体可溶性血栓调节素， 即无氨基酸序列 修饰的可溶性血栓调节素是 Asahi 专利 EP0312598 的主题。
Solulin 是可溶性的， 且是蛋白酶和人血栓调节素的耐氧化的类似物， 由此呈现长 体内生命。Solulin 的主要特征在于由于其不完全抑制凝血酶的其广作用机理。其也活化 TAFI 和天然的蛋白 C/ 蛋白 S 通路。结果， 其减小的凝血酶结合 Solulin 抑制纤溶甚至达高 浓度。
Solulin 尤其是欧洲专利 0641215B1， EP 0544826B1 以及 EP 0527821B1 的主题。 Solulin 相比天然人血栓调节素的序列 (SEQ ID NO ： 1) 在下列位置含有修饰 ： G-3V， 去除氨 基酸 1 ～ 3， M388L， R456G， H457Q， S474A 和在 P490 终止。此编号系统是根据 SEQ ID NO ： 1 和 SEQ ID NO ： 3 的天然血栓调节素。作为本发明的一个优选的实施方式的 Solulin 的序列 显示于 SEQ ID NO ： 2。
但是， 显著地， 根据本发明也可使用血栓调节素类似物， 其仅包含一种或更多种以 上提及的性质， 或以上提及的欧洲专利文献 EP 0544826B1， EP 0641215B1 和 EP 0527821B1 中描述的性质。
可根据本发明应用的特别优选的血栓调节素类似物是具有一个或更多下列特征 的那些 ：
(i) 它们呈现氧化抗性，
(ii) 它们呈现蛋白酶抗性，
(iii) 它们具有同质 N- 或 C- 端，
(iv) 它们已翻译后修饰， 例如， 通过天然血栓调节素 (SEQ IDNO ： 1) 的至少一些糖 基化位点的糖基化，
(v) 它们具有线性双倒数凝血酶结合性质，(vi) 它们以相对低量的去污剂在水溶液中是可溶性的和一般缺乏跨膜序列，
(vii) 它们缺少葡萄糖氨基聚糖链。
本发明中使用的这些类似物的生产公开于以上提及的欧洲专利文献。
在本发明的一实施方式中， 可使用 Solulin 的仅 6 个 EGF 结构域， 尤其是由 EGF4 ～ EGF6 结构域组成的 Solulin 片段。
在一个实施方式中， 可使用如从 WO93/25675 知道的具有减小的辅因子活性的血 栓调节素类似物。本文描述了一系列血栓调节素类似物， 其具有对照人可溶性血栓调节素 (TMEM388L) 的约 50％或更小的辅因子活性。
更特别地， 所述血栓调节素类似物在与凝血酶结合时， 相比与 TMEM388L 结合呈现 小于或等于 50％的修饰的辅因子活性， 所述类似物在对应于 SEQ ID NO ： 1 或 SEQ ID NO ： 3 给出的氨基酸位置的一个或更多位置具有氨基酸取代 ：
(aa)349Asp ；
(bb)355Asn ；
(ac)357Glu ；
(ad)358Tyr ；
(ae)359Gln ； (af)363Leu ； (ai)368Tyr ； (aj)371Val ； (ak)374Glu ； (al)376Phe ； (am)384His ； (an)385Arg ； (ba)387Gln ； (bb)389Phe ； (bc)398Asp ； (bd)400Asp ； (be)402Asn ； (bf)403Thr ； (bg)408Glu ； (bh)411Glu ； (bi)413Tyr ； (bj)414Ile ； (bk)415Leu ； (bl)416Asp ； (bm)417Asp ； (bn)420Ile ； (ca)423Asp ； (cb)424Ile ；(cc)425Asp ； (cd)426Glu ； (ce)428Glu ； (cf)429Asp ； (cg)432Phe ； (ch)434Ser ； (ci)436Val ； (cj)438His ； (ck)439Asp ； (cl)440Leu ； (cm)443Thr ； (cn)444Phe ； (co)445Glu ； (cp)456Arg ； (cq)458Ile ； 或者(cr)461Asp。
最优选仅具有以上列的取代之一的 TM 类似物。为便利， 左侧标识， 例如 (aa) 同于 各修饰的位点。第 1 字母代表 EGF 结构域， 其中 a 是 EGF4 ； b 是 EGF5 和 c 是 EGF6。第 2 字 母代表就列中的其他残基的相对修饰位置。本文也提供编码上述 TM 类似物的核酸。
下列类似物构成以上给的类似物的优选的子集， 其中类似物具有 25％或更小的对 照， TMEM388L 的辅因子活性。这些类似物具有一个或更多氨基酸取代， 优选仅一个 (SEQ ID NO ： 1 或 SEQ ID NO ： 3 给出的氨基酸位置 ) ： 349
(aa) Asp ；
(ac)357Glu ；
(ad)358Tyr ；
(ae)359Gln ；
(aj)371Val ；
(ak)374Glu ；
(al)376Phe ；
(bc)398Asp ；
(bd)400Asp ；
(be)402Asn ；
(bg)408Glu ；
(bi)413Tr ；
(bj)414Ile ；
(bk)415Leu ；
(bl)416Asp ；
(bm)417Asp ；
(bo)423Asp ；(bp)424Ile ；
(bq)425Asp ；
(cd)426Glu ；
(ce)429Asp ；
(ck)439Asp ；
(cn)444Phe ； 或者 461
(cr) Asp。
以上就蛋白酶活性， 脂肪族取代， 氧化抗性和统一的末端所示的修饰也可应用于 具有小于 50％的对照的辅因子活性的以上类似物。
优选的是以上所列具有小于 30％的对照的活性的那些。这些类似物通过结构域 4 中的突变呈现。这些类似物具有一个或更多氨基酸取代， 优选仅一个 (SEQ ID NO ： 1 或 SEQ ID NO ： 3 给出的氨基酸位置 ) ：
(aa)349Asp ；
(ac)357Glu ；
(ad)358Tyr ； (ae)359Gln ；
(aj)371Val ； 或者 376
(al) Phe。
本文也述具有相比 TMEM388L 基本上未修饰的 KD 值的类似物。 EGF5 和 EGF6 已知在 与凝血酶的高亲和性结合中起到重要作用， 然而 EGF4 在结合中具有欠关键作用对于给 TM/ 凝血酶复合物赋予辅因子活性是关键的。由此原因， 那些在 EGF 重复子 5 和 6 中具有修饰 的类似物可具有几乎相同的辅因子活性， 但相比 TMEM388L 减小的 KD， 例如 (S406A)。以下列 出导致减小的辅因子活性的在 EGF 重复子 5 和 6 中具有修饰的类似物。这些类似物具有一 个或更多氨基酸取代， 优选仅一个 (SEQ ID NO ： 1 或 SEQ ID NO ： 3 给出的氨基酸位置 ) ： 398
(bc) Asp ；
(bd)400Asp ；
(be)402Asn ；
(bf)403Thr ；
(bg)408Glu ；
(bi)413Tyr ；
(bj)414Ile ；
(bk)415Leu ；
(bl)416Asp ；
(bm)417Asp ；
(ca)423Asp ；
(cb)424Ile ；
(cc)425Asp ；
(cd)426Glu ；
(cf)429Asp ；
(ck)439Asp ；
(cn)444Phe ； 或者 461
(cr) Asp。
以上类似物也可通过它们的相应结构域 ( 即， EGF4， EGF5 或 EFG6) 以及通过它们的 相应相对活性分组。例如， 具有约 50％的对照辅因子活性的 EGF4 的类似物是 (SEQ ID NO ： 1 或 SEQ ID NO ： 3 给出的氨基酸位置 ) ： 349
(aa) Asp ；
(bb)355Asn ；
(ac)357Glu ；
(ad)358Tyr ；
(ae)359Gln ；
(af)363Leu ；
(ai)368Tyr ；
(aj)371Val ；
(ak)374Glu ；
(al)376Phe ；
(am)384His ； 或者 385
(an) Arg。
最优选具有仅一个以上所列的取代的 TM 类似物。
具有小于 25％的对照的辅因子活性的 EGF4 中的那些是 (SEQ IDNO ： 1 或 SEQ ID NO ： 3 给出的氨基酸位置 ) ：
(aa)349Asp ；
(ac)357Glu ；
(ad)358Tyr ；
(ae)359Gln ；
(aj)371Val ； 或者 376
(al) Phe。
最优选具有仅一个以上所列的取代的 TM 类似物。
在 EGF5 中， 下列修饰导致具有至少 50％辅因子活性减小的类似物 (SEQ ID NO ： 1 或 SEQ ID NO ： 3 给出的氨基酸位置 ) ： 398
(bc) Asp ；
(bd)400Asp ；
(be)402Asn ；
(bf)403Thr ；
(bg)408Glu ；
(bh)411Glu ；
(bi)413Tyr ；
(bj)414Ile ；
(bk)415Leu ；(bl)416Asp ；
(bm)417Asp ； 或者 420
(bn) Ile。
最优选具有仅一个以上所列的取代的 TM 类似物。这些类似物中尤其是类似物相 比 TMEM388L 具有基本上未修饰的 kCat/Km 的那些。
在 EGF5 中， 类似物还可根据导致具有至少 75％辅因子活性减小的类似物的那些 修饰亚分组 (SEQ ID NO ： 1 或 SEQ ID NO ： 3 给出的氨基酸位置 ) ： 398
(bc) Asp ；
(bd)400Asp ；
(be)402Asn ；
(bg)408Glu ；
(bi)413Tyr ；
(bj)414Ile ；
(bk)415Leu ；
(bl)416Asp ； 或者 417
(bm) Asp。
最优选具有仅一个以上所列的取代的 TM 类似物。这些类似物中尤其是相比 TMEM388L 具有基本上未修饰的 kCat/Km 的那些。也提供编码以上类似物的核酸。
就 EGF6， 提供以下组。具有小于对照的 50％的辅因子活性的那些是 (SEQ ID NO ： 1 或 SEQ ID NO ： 3 给出的氨基酸位置 ) ： 423
(ca) Asp ；
(cb)424Ile ；
(cc)425Asp ；
(cd)426Glu ；
(ce)428Glu ；
(cf)429Asp ；
(cg)432Phe ；
(ch)434Ser ；
(ci)436Val ；
(cj)438His ；
(ck)439Asp ；
(cl)440Leu ；
(cm)443Thr ；
(cn)444Phe ；
(co)445Glu ；
(cp)456Arg ；
(cq)458Ile ； 或者 461
(cr) Asp。
最优选具有仅一个以上所列的取代的 TM 类似物。具有小于对照的 25％的辅因子活性的那些是 (SEQ ID NO ： 1 或 SEQ ID NO ： 3 给出 的氨基酸位置 ) ：
(ca)423Asp ；
(cb)424Ile ；
(cc)425Asp ；
(cd)426Glu ；
(cf)429Asp ；
(ck)439Asp ；
(cn)444Phe ； 或者 461
(cr) Asp。
最优选具有仅一个以上所列的取代的 TM 类似物。优选的类似物是以上所示的具 有就溶解度， 蛋白酶抗性， 氧化抗性以及统一的末端的额外的修饰的那些。 编码这些类似物 的核酸也是要求保护的发明的一部分。有关其他组， 这些类似物包括其中所述类似物具有 相比 TMEM388L 基本上未修饰的 kCat/Km 的那些。
类似物可根据在某些位置具有修饰的氨基酸的那些进一步亚分组， 其中所述类似 物具有相比在所述位置具有天然残基的类似物基本上相当的对于凝血酶的 KD， 其中所述位 置对应于 (SEQ ID NO ： 1 或 SEQ ID NO ： 3 给出的氨基酸位置 ) ： 349
(aa) Asp ；
(bb)355Asn ；
(ac)357Glu ；
(ad)358Tyr ； 或者 359
(ae) Gln。
最优选具有仅一个以上所列的取代的 TM 类似物。这些类似物可具有小于对照的 30％的修饰的 kCat/Km。
下列位点包含具有相比在所述位置具有天然残基的类似物修饰的 KD 或 kCat/Km 的描述的类似物， 其中所述位置对应于 (SEQ ID NO ： 1 或 SEQ ID NO ： 3 给出的氨基酸位置 ) ： 363
(af) Leu ；
(aj)371Val ；
(ak)374Glu ；
(al)376Phe ；
(am)384His ；
(an)385Arg ；
(bc)398Asp ；
(bd)400Asp ； 或者 402
(be) Asn。
最优选具有仅一个以上所列的取代的 TM 类似物。这些还包括具有修饰的 KD 和 kCat/Km 的那些类似物， 尤其已修饰至少 20％的那些。
下列位点描述具有相比在所述位置具有天然残基的类似物基本上相当的更低的 辅因子活性和 KD 或 kCat/Km 的类似物， 其中所述位置对应于 (SEQ ID NO ： 1 或 SEQ ID NO ：3 给出的氨基酸位置 ) ：
(bg)408Glu ；
(bh)411Glu ；
(bi)413Tyr ；
(bj)414Ile ；
(bk)415Leu ；
(bl)416Asp ；
(bm)417Asp ；
(bn)420Ile ；
(ca)423Asp ；
(cb)424Ile ；
(cc)425Asp ；
(cd)426Glu ；
(ce)428Glu ；
(cf)429Asp ； (cg)432Phe ；
(ch)434Ser ；
(ci)436Val ；
(cj)438His ；
(ck)439Asp ；
(cl)440Leu ；
(cm)443Thr ；
(cn)444Phe ；
(co)445Glu ；
(cp)456Arg ；
(cq)458Ile ； 或者 461
(cr) Asp。
最优选具有仅一个以上所列的取代的 TM 类似物。
下列位置描述导致至少 75％辅因子活性减小， 但 kcat/Km 基本上少变化的那些修 饰的亚分组 (SEQ ID NO ： 1 或 SEQ ID NO ： 3 给出的氨基酸位置 ) ： 408
(bg) Glu ；
(bi)413Tyr ；
(bj)414Ile ；
(bk)415Leu ；
(bl)416Asp ；
(bm)417Asp ；
(ca)423Asp ；
(cb)424Ile ；
(cc)425Asp ；
(cd)426Glu ；
(cf)429Asp ；
(ck)439Asp ；
(cn)444Phe ； 或者 461
(cr) Asp。
最优选具有仅一个以上所列的取代的 TM 类似物。进一步亚分组可由对于凝血酶 的 KD 被修饰至少 30％的以上修饰造成。
本发明还提供方法。 本文更特别描述有用于筛选呈现对于凝血酶结合的修饰的 Kd 的血栓调节素类似物的方法， 包括下列步骤 ：
(a) 在下列位置制造氨基酸取代 (SEQ ID NO ： 1 或 SEQ ID NO ： 3 给出的氨基酸位 置)：
(bg)408Glu ；
(bi)413Tyr ；
(bj)414Ile ；
(bk)415Leu ；
(bl)416Asp ；
(bm)417Asp ；
(bn)420Ile ；
(ca)423Asp ；
(cb)424Ile ；
(cc)425Asp ；
(cd)426Glu ；
(ce)428Glu ；
(cf)429Asp ；
(cg)432Phe ；
(ch)434Ser ；
(ci)436Val ；
(cj)438His ；
(ck)439Asp ；
(cl)440Leu ；
(cm)443Thr ；
(cn)444Phe ；
(co)445Glu ；
(cp)456Arg ；
(cq)458Ile ；
(cr)461Asp ； 以及
(b) 与对照分子比较对于凝血酶的 KD。
如这些方法中所使用的， 优选具有仅一个氨基酸取代的 TM 类似物。本发明的各种 实施方式包括其中所述 KD 被修饰至少 33％， 或其中所述修饰是氨基酸取代， 或其中所述对照分子是 TMEM388L 的那些。用于方法的优选的修饰分组是 (SEQ ID NO ： 1 或 SEQ ID NO ： 3 给出的氨基酸位置 ) ：
(bg)408Glu ；
(bi)413Tyr ；
(bj)414Ile ；
(bk)415Leu ；
(bl)416Asp ；
(bm)417Asp ；
(ca)423Asp ；
(cb)424Ile ；
(cc)425Asp ；
(cd)426Glu ；
(cf)429Asp ；
(ck)439Asp ；
(cn)444Phe ； 或者 461
(cr) Asp。
如这些方法中所使用的， 优选具有仅一个氨基酸取代的 TM 类似物。
本文描述用于筛选与凝血酶结合时具有修饰的辅因子活性的血栓调节素类似物 的另一方法， 包括下列步骤 ：
(a) 在下列位置制造氨基酸取代 (SEQ ID NO ： 1 或 SEQ ID NO ： 3 给出的氨基酸位 置)：
(aa)349Asp ；
(bb)355Asn ；
(ac)357Glu ；
(ad)358Tyr ；
(ae)359Gln ； 以及
(b) 与凝血酶结合时， 比较辅因子活性的速度和对照分子的速度。
如这些方法中所使用的， 优选具有仅一个氨基酸取代的 TM 类似物。
在本发明的优选的实施方式中， 血栓调节素类似物在第 376 位 (SEQ ID NO ： 1或 SEQ ID NO ： 3) 具有苯丙氨酸残基的修饰。 此残基可通过本领域技术人员熟知的方法化学或 生物化学地修饰或删除。 苯丙氨酸残基优选取代为脂肪族氨基酸， 更优选取代为甘氨酸， 丙 376 氨酸， 缬氨酸， 亮氨酸或异亮氨酸， 以及最优选取代为丙氨酸。展示， Phe 被丙氨酸的取代 (“F376A” ) 基本上降低血栓调节素类似物的辅因子活性而保存 TAFI 活化活性 ( 见图 7)。 结果， F376A-TM 类似物具有增加的 TAFI 活化活性对比辅因子活性的比。
在本发明的进一步实施方式中， 血栓调节素类似物在第 387 位 (SEQ ID NO ： 1或 SEQ ID NO ： 3) 具有谷氨酰胺残基的修饰。谷氨酰胺残基优选取代为下列氨基酸， 以得到的 突变 Gln387X-TM 类似物的降低的辅因子活性顺序排列 ( 见图 8A) ： Met， Thr， Ala， Glu， His， Arg， Ser， Val， Lys， Gly， Ile， Tr， Tyr， Leu， Asn， Phe， Asp， Cys。
在本发明的另一实施方式中， 血栓调节素类似物具有第 388 位 (SEQ ID NO ： 1或SEQ ID NO ： 3) 的甲硫氨酸残基的修饰。甲硫氨酸残基优选取代为下列氨基酸， 以得到的突 变 Met388X-TM 类似物的降低的辅因子活性顺序排列 ( 见图 8B) ： Gln， Tyr， Ile， Phe， His， Arg， Pro， Val， Thr， Ser， Ala， Trp， Asn， Lys， Gly， Glu， Asp， Cys。
在本发明的进一步实施方式中， 血栓调节素类似物在第 389 位 (SEQ ID NO ： 1或 SEQ ID NO ： 3) 具有苯丙氨酸残基的修饰。苯丙氨酸残基优选取代为下列氨基酸， 以得到的 突变 Phe389X-TM 类似物的降低的辅因子活性顺序排列 ( 见图 8C) ： Val， Glu， Thr， Ala， His， Trp， Asp， Gln， Leu， Ile， Asn， Ser， Arg， Lys， Met， Tyr， Gly， Cys， Pro。 387 388
在本发明的另一实施方式中， 由 3 个氨基酸 Gln ， Met 和 Phe389 组成的 TM 的域 间环部分或完全删除或插入一个或更多氨基酸， 优选插入丙氨酸残基 ( 见图 8D)。 376 387 388
对于这些在位置 Phe ， Gln ， Met 或 Phe389 具有修饰的优选的 TM 类似物， TM 类似物可为全长或可溶性 TM 类似物， 包含 EGF 结构域 EGF1 ～ EGF6， 优选包含 EGF 结构域 EGF3 ～ EGF6。在优选的实施方式中， 这些类似物含有 TM 类似物 Solulin 给予的取代。在 更优选的实施方式中， 这些源于 Solulin 的 TM 类似物仅由 EGF1 ～ EGF6 组成， 尤其是仅由 EGF 结构域 EGF3 ～ EGF6 组成。
在本发明的实施方式中， 血栓调节素类似物以其氧化的形式使用。本领域技术人 员已知几种用于蛋白的控制的氧化的技术。TM 类似物优选使用氯胺 T， 过氧化氢或高碘酸 钠氧化。
本发明还涉及有用于筛选用于治疗具有纤溶亢进的凝血病的 TM 类似物的方法。 此方法包括通过一个或更多氨基酸的插入， 缺失或取代修饰血栓调节素的氨基酸序列的第 1 步骤， 优选在 EGF 结构域 EGF1 ～ EGF6 中， 更优选在 EGF 结构域 EGF3 ～ EGF6 中， 及最优选 349 461 氨基酸位置 Asp 和 Asp 之间。对于本领域技术人员， 已知修饰蛋白序列的几种技术， 例 如通过定点诱变或伴随随后选择的随机诱变。
在第 2 步骤中， 就一个或更多选自下列的特征将修饰的 TM 类似物与对照蛋白比 较： 与凝血酶的结合亲和力 (KD 值 )， 辅因子活性， TAFI 活化活性或 TAFIa 势， TAFI 活化活 性和辅因子活性的比， 蛋白氧化的效应， 体外测定中对及时凝块溶解的效应， 或在凝血 - 关 联的动物模型中的效应。
作为对照蛋白， 使用血栓调节素蛋白或类似物， 优选兔肺血栓调节素或包含 6 个 EGF 结构域的人 TM 类似物。TM 类似物可具有天然氨基酸序列或替代性地可具有一个或更 多修饰， 诸如 M388L 取代。
本发明还涉及治疗具有纤溶亢进的凝血病的方法， 包括施用治疗有效量的呈现抗 纤维蛋白溶解效应的血栓调节素类似物。
特别是， 此治疗方法包括相比对照蛋白呈现一个或更多下列特征的 TM 类似物 ： 降 低的与凝血酶的结合亲和力， 具有大于 0.2nM 的 kD 值的与凝血酶的结合亲和力， 显著减小 的辅因子活性， 或增加的 TAFI 活化活性与辅因子活性比。作为对照蛋白， 使用血栓调节素 蛋白或类似物， 优选兔肺血栓调节素或包含 6 个 EGF 结构域的人 TM 类似物。TM 类似物可具 有天然氨基酸序列或替代性地可具有一个或更多修饰， 诸如 M388L 取代。
【定义】
如在本发明的情景中使用， 术语 “抗纤维蛋白溶解效应” 应指相比未添加血栓调节 素类似物的同一测定条件血栓调节素类似物延长凝块溶解时间的能力 ( 如实施例 I 中所述 )。 抗纤维蛋白溶解效应是由于相比其致纤溶活性的 TM 类似物的抗纤维蛋白溶解活性的 流行。
如本文所用， 术语 “致纤溶效应” 应指在体外测定中， 相比未添加血栓调节素类似 物的同一测定条件， 血栓调节素类似物显著减小凝块溶解时间的能力 ( 如实施例 I 中所 述 )。
如本文所用， 术语 “显著减小” 和 “显著延长” 指凝块溶解时间的以 p ＝ 0.1 水平 显著不同于基础值的延长或减小， 和 / 或指超过 10％， 优选 20％， 更优选 30％， 以及最优选 40％， 50％， 60％， 70％， 80％ 100％， 150％或 200％的延长或减小。
如在本发明的情景中使用， 词汇″治疗 (treat)″、″治疗 (treating)″或 “治 疗 (treatment)″指使用本发明的 TM 类似物或包含它们的任何组合物来预防性地阻止出 血事件， 或来缓和， 改善或停止出血事件。 它们包括治愈或治愈以及缓和， 缓解或防止， 除非 另外明确地提及。而且， 如本文所用， 词汇″患者″指哺乳动物， 包括人。
如本文所用， 术语 “具有纤溶亢进的凝血病” 应指作为影响血凝固性的疾病的凝血 病， 其中显著增加的纤溶导致， 恶化或延久出血事件。
如在本发明的情景中使用， 术语 “血栓调节素类似物” 指与膜结合或可溶性血栓调 节素具有相同的特征生物学活性的蛋白和肽。 生物学活性是发挥凝血酶的受体的作用及增 加 TAFI 的活化的能力， 或与天然血栓调节素关联的其他生物学活性。
本文所用的术语 “结合亲和力” 指血栓调节素类似物和凝血酶之间的亲和性的强 度， 及通过解离常数 KD 描述。凝血酶与血栓调节素之间的结合亲和力的 KD 值可通过下列方 法测定 ： 例如平衡方法 ( 例如酶联免疫吸附试验 (ELISA) 或放射免疫测定 (RIA)) 或动力学 ( 例如 BIACORETM 分析 )。结合亲和性优选使用如本发明的实施例 II 中所述的动力学检定 分析。
“KD” 指 TM 类似物和凝血酶之间的相对结合亲和力。高 KD 值代表低结合亲和力。 实施例 II 中提供用于测定 KD 的精确的测定和设施。
如本文所用， 术语 “辅因子活性” 指血栓调节素类似物与凝血酶复合的能力及增强 凝血酶活化蛋白 C 的能力。本发明的实施例 III 中给出用于测量辅因子活性的检定过程。
如本文所用， 术语 “TAFI 活化活性” 指血栓调节素类似物与凝血酶复合的能力及增 强凝血酶活化 TAFI 的能力。本发明的实施例 IV 中给出用于测量 TAFI 活性的检定过程。
″ Km″指米氏常数及以通过测量以不同底物浓度测量的催化的速度的标准方式 推演。其等同于反应速度是其最大值的一半时的底物浓度。本发明的 TM 类似物的 “Km” 通过将凝血酶浓度保持在恒定水平 ( 例如 1nM) 及使用依赖于 KD 的 TM 的饱和度水平 ( 例 如 100nM 或更大 ) 测定。反应使用增加浓度的蛋白 C( 例如， 1 ～ 60μM) 进行。然后使用 Lineweaver-Burke 标绘图或非线性回归分析测定 Km 及 kcat。
″ TME″指由 6 个 EFG 重复子 ( 根据 SEQ ID NO ： 1 或 SEQ ID NO ： 3 的氨基酸 227 ～ 462) 组成的 TM 的类似物。
″ TMEM388L″指由 6 个 EFG 重复子 (aa 227 ～ 462) 组成的 TM 的类似物， 其第 388 位 ( 基于 SEQ ID NO ： 3) 的天然甲硫氨酸被亮氨酸残基取代。
术语 “治疗有效量” 定义为会减小与具有纤溶亢进的凝血病关联的症状， 诸如出血 事件的活性成分的量。 “治疗有效” 也指相比未治疗的病症严重性， 发病频度或持续时间的任何改善。 【实施例】
【实施例 I. 人血浆中的凝块溶解检定】
使用体外凝块溶解模型， 测试了可溶性血栓调节素 (Solulin) 降低或增加正常血 浆和因子 VIII 缺陷血浆的混合物中的凝块溶解时间的能力。
【1. 测试系统】
在血浆组合物之中， 通过混合凝血酶 ( 因子 IIa)， 氯化钙和磷脂酰胆碱 / 磷脂酰丝 氨酸 (PCPS) 囊泡体外起始凝血。用浊度测定， 及使用 “TAFIa 势” 的功能测定测定凝固及纤 溶的时间进程。
【2. 实验过程】
材料。如 Walker 等人 (J.Biol.Chem.1999 ； 274 ： 5201-5212) 中所述制备凝血酶 和纤维蛋白原， 一个例外是 ： 对于纤维蛋白原制备， 通过向水中添加 40％ (w/v)PEG-8000， 随后 β- 丙氨酸沉淀， 代替 2％ PEG-8000 而将溶液制成 1.2％ PEG-8000。此流程变化允许 纤维蛋白原的更大产率。TAFIa 测定中使用的 QSY-FDP( 共价附接到猝灭剂， QSY9C5- 马来 酰亚胺的纤维蛋白降解产物 ) 和 TAFIa 标准物如 (Kimet al.， 2008 ； Anal.Biochem 372 ： 32-40 ； Neill et al.， 2004 ； Anal.Biochem.330 ： 332-341) 所述制备， 和重组人 Pg(S741C) 和荧光素衍生物 (5IAF-Pg) 如 Horrevoets 等人 (J.Biol.Chem 1997 ； 272 ： 2176-2182) 所述 制备。将 S525C- 凝血酶原纯化及用 5- 碘氨基荧光素 (5IAF) 荧光标记， 如之前 Brufatto 等人 (J.Biol.Chem.2001 ； 276 ： 17663-17671) 所述。QSY9C5- 马来酰亚胺和 5- 碘氨基荧 光素购自 Invitrogen Canada Inc.(Burlington， ON， Canada)。纤溶酶购自 Haematologic Technologies Inc.(Essex Junction， VT， USA)， 重组人可溶性血栓调节素 (Solulin ； sTM) 由 Paion Deutschland GmbH(Aachen， 德国 ) 提供。正常人合并的血浆 (NP) 从 Kingston， Ontario， Canada 的 Kingston General Hospital(KGH) 的血库的健康供体得到， FVIII- 缺 陷型血浆 (FVIII-DP) 购自 Affinity Biologicals， Inc.(Hamilton， ON， Canada)。TAFI- 缺 陷型血浆 (TDP) 通过在固定的抗 - 人 TAFI 单克隆抗体的柱上的正常血浆的亲和层析 制 备， 如 Schneider 等 人 (J.Biol.Chem.2002 ； 277 ： 1021-1030) 所 述。 纤 溶 酶 抑 制 剂 D-Val-Phe-Lys 氯甲基酮 (VFKck)， 凝血酶抑制剂 D-Phe-Pro-Arg 氯甲基酮 (PPAck) 和马铃 薯块茎羧肽酶抑制剂 (PTCI) 购自 Calbiochem(San Diego， CA， USA)。组织 - 类型纤溶酶原 活化物 (Activase ； tPA) 购自 KGH 的药房 (Kingston， ON， Canada)。全部其他试剂是分析质 量的。
【3. 方法】
【凝块溶解测定和样品制备以测定 TAFI 活化的程度】
将 FVIII-DP 与 NP 混合， 从而 NP 的最终百分率是 0， 1， 6， 10， 50 或 100％ (0 ～ 100％ NP)。混合之前， 将各血浆稀释成 32 的光密度及添加到等同体积的存在或缺失 20nM 凝血酶 的含有 1.5nM tPA， 40μM PCPS 和 20mM CaCl2 的溶液 ( 终浓度 ： 0.75nM tPA， 20μM PCPS， 10mM CaCl2， ±10nM 凝血酶 )， 将样品分入多个 Eppendorf 管， 及放入 37℃水浴。通过在各 时间点添加 10μM PPAck 和 10μM VFKck 来停止这些管中凝固及溶解， 以分别选择性地抑 制凝血酶和纤溶酶。 将样品剧烈混合， 然后以 16000g( 室温 ) 离心 30s， 和立即放置在冰上，以阻止 TAFIa 的热灭活。将各样品的上清液用 TAFI- 缺陷型血浆连续稀释 5 倍， 并且使用 Kim 等人所述的功能测定测量 TAFIa(Anal.Biochem 2008 ； 372 ： 32-40)。在有盖的， 96- 孔 板中进行同一实验， 和使用 SpectraMax Plus 分光光度计 (Molecular Devices， Sunnyvale， CA， USA) 在 400nm 处经时监控浊度， 以测定凝固及纤溶的时机。在存在或缺失 4 个 tPA 浓 度 (0.25， 0.75， 1.5 和 3nM) 的可溶性血栓调节素 (0 ～ 100nM) 的情况下进行类似实验， 以 测定 sTM 对 TAFI 活化和溶解时间的效应。也在存在 5μM PTCI 下进行这些实验， 以在正常 和 FVIII- 缺陷型血浆中显示溶解的 TAFIa 依赖性延长。
【正常和 FVIII- 缺陷型血浆中凝血酶原活化的时间进程的确定】
向正常和 FVIII- 缺陷型血浆 (0 ～ 100％ NP) 在 10nM 凝血酶存在下补充凝血酶 原衍生物 (5IAF-II ； 300nM 最终 ) 以及 20μM PCPS 和 10mM CaCl2， 以起始凝固。在不透明 的， 塑料 - 覆盖的 96- 孔板中进行这些实验。SpectraMax GeminiXS(Molecular Devices， Sunnyvale， CA， USA) 用于于 37℃， 用分别 495nm 和 535nm 的激发和发射波长， 采用 530nm 发 射截止滤光片经时监控荧光强度。将荧光标准化 (0 ～ 1)， 以反映基线和最大荧光， 将其与 全凝血酶原活化关联。
【TAFIa 势的确定】 在实验过程中， 将 TAFIa 标绘图下的面积选择作为定量 TAFIa 效应的参数。通过 用 Hemker 等人 (Thromb.Haemost.1993 ； 85 ： 5-11) 定义的 “凝血酶势” 模拟将此参数指定为 “TAFIa 势” 。TAFIa 势， 如凝血酶势， 正比于切割的底物量， 及如下数学解析 ：
其中 dS/dt 是底物消耗的速度， S 是底物。 如果 S 是常数 ( 即 S 的限制的消耗 )，对于一些间隔 0 ～ t，意识到， 方程 (4) 中右侧积分是 TAFIa 标绘图下的面积， ( 曲线下面积 )(5) (TAFIa 势 )(6)【4. 结果】
【通过将正常血浆添加到 FVIII- 缺陷型血浆来增加凝块溶解时间】
用 10nM 因子 IIa， 10mM CaCl2 和 20μM PCPS 囊泡起始凝固， 以创建其中凝块结构 不敏感于 FVIII 浓度的模型。 因为无论 FVIII 浓度， 凝块结构类似， 可测定 FVIII 对 tPA- 依 赖性 (0.75nM) 凝块溶解的效应。使用此溶解模型， 溶解时间随着正常血浆的百分率的增加 而增加。图 1 显示 FVIII-DP 用 0 ～ 100％添加的正常血浆的凝块溶解特征， 和溶解时间总结于图 1( 插图 )。在 FVIII-DP 中， 溶解时间是 37min， 且通过添加正常血浆可增加约 50％。
【10％正常血浆足以恢复 FVIII-DP 中的凝块溶解】
以 10％正常血浆， 将与 FVIII-DP 关联的缩短的溶解时间修正到在正常血浆中观 察到的 ( 见图 1， 插图 )。
【50％的 TAFIa 势足以恢复 FVIII-DP 中的凝块溶解】
在正常， FVIII- 缺陷型及混合的血浆中测量 TAFI 活化， 以定量 FVIII 对活化的时 间进程的效应。在凝固的时间进程， 将功能测定用于测量 TAFIa， 及溶解和结果显示于图 2。 当在 FVIII-DP 中将凝血酶， 钙离子和 PCPS 用于起始凝固时， 5min 后测量到约 30pM TAFIa。 随着正常血浆的百分率增加， TAFIa 的峰浓度也增加。尽管溶解时间通过向 FVIII-DP 补充 10％正常血浆来修正， 此不足以完全校正 TAFI 活化。通过计算 TAFIa 时间进程标绘图下面 积 ( 图 2A)， 确定在正常血浆和 50％正常血浆中， 在前 50min 达到大致相同的 TAFIa 势 ( 图 2B)( 分别 16800pM min 及 14100pM min， )， 但与 10％正常血浆混合的 FVIII-DP 血浆具有 仅 50％正常血浆中的 TAFIa 势的 TAFIa 势。
【溶解时间和 TAFIa 势之间有强关联】
为了定量溶解时间和 TAFI 活化之间的关系， 跨 0 ～ 100％ FVIII， 标绘对数溶解时 间对比对数 TAFIa 势 ( 图 2B， 插图 )。如预期， 数据显示在含有 0 ～ 100％ FVIII 的血浆中 溶解时间和 TAFIa 势之间的强阳性关联。图 2A 中的 TAFI 活化谱可通过分析血浆中的凝血 酶原活化来合理化 ( 图 3)， 因为凝血酶是 TAFI 的活化物。一般趋势是， 随着正常血浆的百 分率增加， 凝血酶原活化速度也增加 ( 其可通过检查图 3 中曲线的斜率来测定 )。正常血 浆中有例外发生。在正常血浆中， 凝血酶原活化速度低于与 50％正常血浆混合的 FVIII-DP 中的速度。而正常血浆中的速度更慢， 凝血酶原活化持续与 50％正常血浆混合的 FVIII-DP 中的约两倍。在每个实验中， 凝血酶原活化的时间与 TAFI 活化良好对应。使用钙离子和 PCPS， 正常血浆也凝固， 无需添加的凝血酶。钙 - 诱导的凝固不立即发生 ； 正常血浆中凝块 形成耗时约 15min。此时， 凝血酶原活化进入扩大期， 结果， TAFI 活化。有关凝块形成的 TAFI 活化的程度及时间相同， 无论在存在或缺失添加的凝血酶的情况下起始凝固， 这提示， TAFI 活化是原位产生的凝血酶的结果， 且不是添加凝血酶而诱导凝固。相比凝血酶缺失下 的 14,150pMmin， 在凝血酶的存在下， 有 16,800pM min 的 TAFIa 势。
【可溶性血栓调节素在正常和 FVIII- 缺陷型血浆中延长凝块溶解】
在正常血浆中， 峰 TAFIa 水平和 TAFIa 势， 在 sTM 缺失下， 分别从 600pM 和 16800pM min， 在 10nM sTM 存在下， 增加到分别约 6000pM 和 150,000pM min。此 TAFI 活化的增加导 致溶解时间的 70％增加。 10nM sTM 对 FVIII-DP 中溶解的相对延长的效应类似于正常血浆， 其中当 FVIII-DP 凝固及在 sTM 存在下溶解时溶解延长 65％。在 10nM sTM 存在下， 相比在 sTM 缺失下的 30pM， 在峰 TAFIa 浓度存在 750pM TAFIa。 自凝块起始到凝块溶解时间， TAFIa 势测量为， 相比在 sTM 缺失下的 600pM min， 在 10nM sTM 存在下 12800pMmin。
【正常和 FVIII- 缺陷型血浆中的凝块溶解时间的增加依赖于 tPA 和 sTM 浓度】
跨一系列 tPA 和 sTM 浓度分析 TAFI 活化对溶解时间的效应， 以测定是否 FVIII-DP 中的溶解缺陷可通过刺激 TAFI 活化来修正。图 4 中总结的溶解时间相对于自含有 PTCI 的 类似实验的溶解时间， 所述 PTCI 是 TAFIa 的抑制剂。在 PTCI 存在下， 无有功能的 TAFIa， 从 而图 4 中显示的相对溶解时间代表溶解的 TAFIa- 依赖性延长。 当将 1nM sTM 加入正常血浆时， 以最低浓度的 tPA(0.25nM)， 观察到溶解的最大 TAFIa- 依赖性延长 (2 倍 )。 补充 sTM 的 FVIII-DP 导致溶解时间的剂量 - 依赖性延长 ( 图 4)。 当将 100nM sTM 加入 FVIII-DP 时， 溶 解时间完全校正为见于正常血浆的。随着 tPA 浓度增加， 需要更高浓度的 sTM， 以获得溶解 的最大 TAFIa- 依赖性延长。例如， 当存在 1.5nM tPA( 图 4) 时， 需要 25nM sTM， 以最大化正 常血浆中溶解的 TAFIa 依赖性延长， 和在 FVIII-DP 中需要 100nM sTM。 而且， 随着在这些凝 块溶解实验中 tPA 增加， TAFIa 呈现出对溶解时间具有大得多的效应 ( 相比以 0.25nM tPA 的 2.3 倍， 以 1.5nM tPA 达 5.2 倍 )。呈现， 随着 tPA 浓度增加， 获得任何溶解的 TAFIa- 依 赖性延长需要的 sTM 浓度也增加。以 0.25nM tPA， 不需要 sTM 来获得在正常血浆中溶解的 延长， 然而当将 3nM tPA( 图 4) 加入正常血浆时， 需要 25nMsTM 来获得溶解的延长。为了显 示如何实际溶解时间被 tPA 和 sTM 影响， 抑制的正常和 FVIII- 缺陷型血浆的 TAFIa 中的溶 解时间显示于表 1。
【血栓调节素在正常和 FVIII- 缺陷型血浆中非常基本上促进 TAFI 活化及延长溶 解】
在正常血浆中， TAFI 活化显示为， 相比 sTM 缺失下 ( ○ ； 600pMTAFIa ； 见图 5A)， 在 10nM sTM 存在下 ( ● ； 在其峰水平 6000pMTAFIa) 显著增加。伴随凝块 - 溶解谱揭示， 10nM sTM 的添加导致溶解时间 70％增加。在补充了 10nM sTM 的 FVIII-DP 中， TAFIa 测量为， 相 比在 sTM 缺失下 30pM， 在其峰为 750pM( 见图 5B)。相比缺少 sTM 的 FVIII-DP， TAFI 活化的 增加导致溶解的 60％延长。
【实施例 II. 凝血酶和血栓调节素之间的结合亲和力的分析】
使用荧光动力学检定， 测定表示为 KD 值的凝血酶和血栓调节素类似物之间的结合 的亲和性。
【1. 测试系统】
使用荧光动力学测定来测定凝血酶和血栓调节素类似物之间的结合亲和性及表 示为 KD 值。
【2. 实验过程】
【材料】
如 Bajzar 等 人 所 述 从 血 浆 分 离 人 凝 血 酶 (J.Biol.Chem.1995 ； 270 ： 14477-14484)。 从 PAION Deutschland GmbH(Aachen， 德国 ) 得到重组体可溶性血栓调节素 (Solulin)。全部其他试剂从 Sigma 以分析质量得到。
【方法】
【凝血酶与血栓调节素和 TAFI 的结合的测量】
如平衡结合测定测量凝血酶与血栓调节素的结合。将在 0.02MTris-HCl， 0.15M NaCl， 5.0mM CaCl2， 0.01％ Tween 80， pH7.4 中含有凝血酶 (20nM)， 血栓调节素 (1.54μM)， 及 DAPA(20nM， 丹磺酰精氨酸 N-3-( 乙基 -1， 5- 戊烷二基 ) 酰胺， 荧光， 可反转的凝血酶抑制 剂 ) 的溶液以小连续等分加入缺乏血栓调节素的别的同一溶液。添加在 Perkin-Elmer 模 型 LS50B 荧光分光计的样品隔室中的安装磁搅拌器的比色杯中进行。用分别 280 和 545nm 的激发和发射波长连续记录强度值。将 430nm 截止滤光片用于发射光束。如下分析数据。 荧光强度， I， 推定为是自凝血酶 -DAPA(T·D) 和凝血酶 - 血栓调节素 -DAPA(T·TM·D) 的 强度的和。即， I ＝ i1·[T·D]+i2·[T·TM·D]， 其中 i1 和 i2 是 T·D 和 T·TM·D 的荧光系数 ( 由于激发在在 280nm 处， 自游离的 DAPA 的发射可忽略 )。因为 TM 就蛋白 C 活化或 TAFI 活化不略微改变 Km( 见 Bajzar et al.， 1996 ； J.Biol.Chem.271 ： 16603-16608)， 可推 定， 其不改变凝血酶 -DAPA 相互作用的亲和性。
由此 [T·D] ＝ ([T]+[T·D])/(1+KDAPA/[DAPA])
且 [T·TM·D] ＝ ([T·TM]+[T·TM·D])/(1+KDAPA/[DAPA])，
其中 KDAPA 是凝血酶 -DAPA 相互作用的解离常数。
因此，
I ＝ i1·([T]+[T·D])/(1+KDAPA/[DAPA])+i2([T·TM]+[T·TM·D])/(1+KDAPA/ [DAPA])。
如果 f 和 b 分别被定义为凝血酶的级分， 游离的及结合到血栓调节素的， 及 [T]0 是 凝血酶的总浓度， 则 f ＝ ([T]+[T·D])/[T]0， b ＝ ([T·TM]+[T·TM·D])/[T]0 和 f+b ＝ 1。 则通过 I ＝ i1· f[T]0/(1+KDAPA/[DAPA])+i2· b[T]0/(1+KDAPA/[DAPA]) 给予荧光强度。当未添 加血栓调节素时， 如果 I0 定义为初始强度， 则 f ＝ 1 和 I0 ＝ i1[T]0/(1+KDAPA/[DAPA])。类似 地， 如果 Imax 定义为凝血酶用血栓调节素饱和时的强度， 则 b ＝ 1 和 Imax ＝ i2[T]0/(1+KDAPA/ [DAPA])。由此， I ＝ I0·f+Imax·b。用 1-b 带入 f 则给出 ： I ＝ I0+(Imax-I0)·b 或 ΔI ＝ ΔImax·b。标准化到初始强度给 (ΔI/I0) ＝ (ΔImax/I0)·b。如果 DAPA 以等同亲和性结合 T 和 T·TM， 则 TM 以等同亲和性结合 T 和 T·D。
因此， kTM 定义为凝血酶 - 血栓调节素相互作用的解离常数， [T][TM] ＝ KTM[T· TM] ； [T·D][TM] ＝ KTM[T·TM·D] ； 及 ([T]+[T·D])·[TM] ＝ KTM([T·TM]+[T·TM·D])。最后 表达式等于 f·[TM] ＝ KTM·b。由于 f ＝ 1-b 和 [TM] ＝ [TM]0-b·[T]0， 其中 [TM]0 是总和 血栓调节素浓度， 得到下列方程 ： (1-b)([TM]0-b·[T]0) ＝ KTM·b。此是 b 的二次方程， 当 对其求解及代入以上 (ΔI/I0) 的表达式， 给出方程 ： (ΔI/I0) ＝ (ΔImax/I0)· 0.5· (KTM+[T] 2 1/2 [T]0· [TM]0) )。 此后来的方程表达荧光强度值， 血栓调节素 0+[TM]0-((KTM+[T]0+[TM]0) -4· 及凝血酶的标称浓度， 凝血酶 - 血栓调节素相互作用的解离常数， 及表征血栓调节素与凝 血酶 -DAPA 的相互作用的荧光强度增量之间的关系。将强度数据以 [TM]0 作为自变量和 KTM 及 ΔImax 作为最佳 - 拟合参数通过非线性回归分析拟合到以上方程。
【3. 结果】
【凝血酶以 KD ＝ 23±14nM 的亲和性结合可溶性血栓调节素】
通过 DAPA 的荧光扰动测量凝血酶与可溶性血栓调节素的结合。如图 6 所示， 滴定 曲线显示相对荧光的 0 和 75nM 之间的可溶性血栓调节素浓度范围的增加。数据分析显示， 与可溶性血栓调节素结合的凝血酶特征在于 KD ＝ 23±14nM。
【实施例 III. 突变的血栓调节素类似物的辅因子活性的分析】
使用荧光动力学检定来测定表示为 KD 值的凝血酶和血栓调节素类似物之间的结 合的亲和性。
【1. 实验过程】
【材料和方法】
在 shockate 中直接测定 TM 突变体发挥蛋白 C 的凝血酶 - 介导的活化的辅因子的 作用的能力。重组人蛋白 C 来自 Dr.John McPherson， Genzyme Corp.， Framingham， MA.， 及 如 (BioTechnology 1990 ； 8： 655-661) 所述纯化。 将 25μl 的各 shockate 在微孔板中与等同体积的重组人蛋白 C(0.3μM 的终浓度 ) 和 1nM 终浓度的人 α 凝血酶 (SigmaChemicals， St.Louis， MO) 混合。将使用的全部试剂稀释于 20mM 含有 5mg/ml 牛血清白蛋白的 Tris， pH7.4/100mM NaCl/3.75mMCaCl2/0.1％ NaN3(w/V)。将混合物于 37℃温育 1 小时， 和通过添 加 25μl 的 800U/ml 的水蛭素 (Sigma Chemicals， St.Louis， MO) 来终结反应。通过添加 100μl 的发色底物 D- 缬氨酰 -L- 亮氨酰 -L- 精氨酸 -p- 硝基酰苯胺 (S-2266)(1mM) 来测 定活化的蛋白 C 的量。通过使用平板读数仪在 405nm 处的吸光度测量随时间的变化。数据 记录为 milliOD 单元 /min 及通过使用 Molecular Devices 平板读数仪每 10s 测量吸光度持 续 15 分钟来对各样品测定。全部测定含有三重 shockate 样品， 各 DH5α 细胞用 pSELECT-1 载体 ( 无 TM)， pTHR211( 野生型 ) 或 pMJM57( 在 388 位甲硫氨酸改变为亮氨酸的 pTHR211) 转染， 作为内部对照。TM 突变体的辅因子活性表示为对 pMJM57 获得的活性的平均值。
【统计学分析】
测定各突变体活性至少两次 ( 仅分离 2 个阳性克隆的那些突变体是 3 次 )， 及全部 数据使用 Student 氏 t 检验包括在差异的显著性的确定中。板之间的差异系数是 16.7％ (n ＝ 18)。
【蛋白印迹分析】
在 10％ Tris-tricine SDS PAGE 中， 在还原的条件下， 根据制造商的说明书 (Novex Inc.， San Diego， CA) 运行大肠埃希氏菌 (E.coli)shockate。通过将在含有 10mM 二硫苏糖 醇的样品缓冲液 (62.5mMTris， pH6.8， 2％ SDS， 10％甘油， 0.0025％溴酚蓝 ) 中的 shockate 煮沸 10 分钟来制备还原的及烷基化的样品， 然后是与 50mM 碘乙酰胺温育。
将蛋白转移到 4 ℃的转移缓冲液 (192mM 甘氨酸， 25mM Tris， pH8.3， 20 ％甲醇 ) 中的硝酸纤维素滤膜。将硝酸纤维素滤膜用阻断缓冲液 (10mM Tris， pH7.5， 0.9％ NaCl， 0.05％ NaN3 中 1％牛血清白蛋白 ) 阻断， 然后在阻断缓冲液中与小鼠多克隆抗血清 ( 针对 人血栓调节素的还原的及烷基化的 EGF 结构域产生 ) 温育。用洗涤缓冲液 (10mM Tris， pH7.5， 0.9％ NaCl， 0.05％ NaN3， 0.05％ Tween 20) 洗涤之后， 将滤膜在含有 0.05％ Tween 20 的阻断缓冲液中与生物素化的山羊抗 - 小鼠 IgG 抗体温育。使用 Vectastain ABC 溶 液 (VectorLaboratories， Burlingame， CA) 和 ECL 检 测 系 统 (AmershamCorporation， Arlington Heights， IL) 根据制造商的说明书检测蛋白。
【实施例 IV. 对于 TAFI 和蛋白 C 活化的血栓调节素类似物的分析】
使用荧光动力学检定来测定表示为 KD 值的凝血酶和血栓调节素类似物之间的结 合的亲和性。
【1. 实验过程】
【蛋白和试剂】
如 Parkinson 等 人 所 述 制 备 包 含 Solulin( 残 基 4-490)， TME( 残 基 227-462)， TMEc- 环 3-6( 残 基 333-462)， 及 TMEi4-6( 残 基 345-362) 的 截 短 的 形 式 的 血 栓 调 节 素 (Biochem.Biophys.Res.Commun.1992 ； 185 ： 567-576)。将 Sf9 细胞用 TM 构建体转染， 及将 蛋白通过利用阴离子交换， 凝胶过滤和凝血酶亲和性的层析过程的组合从培养基分离。通 过 SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染色评定的纯度是 95％或更大。如 Bajzar 等人所述分 离人血浆 TAFI(J.Biol.Chem.1995 ； 270 ： 14477-14484)。如 Bajzar 和 Nesheim 所述制备人 蛋白 C 和凝血酶 (J.Biol.Chem.1993 ； 268 ： 8608-8616)。如 Nesheim 等人所述合成凝血酶抑制剂丹磺酰精氨酸 N-(3- 乙基 -1， 5- 戊烷二基 ) 酰胺 (DAPA)(Biochemistry 1979 ； 18 ： 996-1003)。从 TMEM388L 构建体产生由丙氨酸扫描所致的点突变体。将蛋白在大肠埃希氏 菌 (Escherichia coli) 表达。周质提取物的过程和制备如 Nagashima 等人所述 (J.Biol. Chem.1993 ； 268 ： 8608-8616)。HEPES， 碱性羧肽酶底物马尿酰 - 精氨酸， 氰尿酰氯， 及 1， 4- 二噁烷从 Sigma 得到。全部其他试剂是分析质量的。
【用血栓调节素类似物的点突变体的蛋白 C 和 TAFI 活化速度的测量】
对于 TAFI 的活化， 将 20μl 等份的各周质提取物与凝血酶 (13nM 最终 ) 在 20mM HEPES， pH7.5， 150mM NaCl， 5mM CaCl2 中于室温预温育 5min。然后将混合物与纯化的重组 TAFI(18nM 最终 ) 和底物， 马尿酰 - 精氨酸 (1.0mM 最终 ) 以 60μl 的总体积温育 60min。通 过测量马尿酰 - 精氨酸向马尿酸的水解， 然后是用 80μl 的磷酸盐缓冲液 (0.2M， pH8.3) 和 在二噁烷 (w/v) 中的 60μl 的 3％氰尿酸将马尿酸转变为色原， 从而定量活化的 TAFI 的量。 充分混合之后， 在 382nm 处测量澄清的上清液的吸光度。对于各突变体， 通过减去凝血酶缺 失下产生的背景吸光度来计算 TAFI 的凝血酶 - 依赖性活化的量。蛋白 C 被 TMEM388L- 丙 氨酸突变体的活化测定如下。
将全部样品和试剂稀释于 APC 检定稀释剂 (20mM Tris-HCl， pH7.4， 100mM NaCl， 2.5mM CaCl2， 0.5％ BSA)。将样品和 TM 标准物 (0 ～ 1nM) 以 60μl 总体积于 37℃在 96- 孔 板中与 0.5μM 蛋白 C 和 1nM 凝血酶温育 60min， 以产生 APC， 然后用 20μl 的水蛭素 (0.16U/ μl， 570nM) 淬 灭。 通 过 以 1min 间 隔 在 405nm 处 使 用 平 板 读 数 仪 (Molecular Devices Corp.， Menlo Park， CA) 监控 S-2266(100μl 的 1mM) 的水解来测定形成的 APC 的量。1U 的 活性产生 1pmol 的活化的蛋白 C/min(37℃ )。
全部测定含有用 pSelect-1 载体 ( 无 TME) 转染的 DH5α 细胞的提取物， 野生型 TME(M388) 或 TME(M388L) 作为内部对照。TME(M388L) 丙氨酸突变体的辅因子活性表达为 TME(M388L) 的活性的百分率。使用提取物的 3 个独立制备物以一式两份测定各 TM 突变体 的蛋白 C 和 TAFI 活化。
【2. 结果】
用 TM 突变体获得的结果 ( 图 7) 表明， 8 个突变体中的 5 个具有基本上减小的辅因 子活化。从这 5 个突变体， 4 个突变体也显示 TAFI 的相伴的减小的活化活性。仅在 F376A 的突变导致蛋白 C 活化的深刻的损失， 但仅在 TAFI 活化中适度减小。有趣地， 对于 TAFI 和 376 蛋白 C 活化的 Phe 的重要性的差异提示， 当蛋白 C 是凝血酶 - 血栓调节素复合物的底物 时， 对血栓调节素结构的需求更受约束。
【实施例 V. 就氧化的蛋白 C 活化的 Met- 特异性 TM 突变体的分析】
使用血栓调节素类似物的特定甲硫氨酸突变体， 还就蛋白氧化使用蛋白 C 活化测 定分析对于辅因子活化的这些残基的作用。
【1. 实验过程】
【蛋白和试剂】
人 重 组 蛋 白 C 来 自 Genzyme Corp.(Boston， MA)。 牛 凝 血 酶 来 自 Miles Laboratories Inc.(Dallas， TX)。D-Val-Leu-L-Arg-p- 硝基酰苯胺如 Glaser 等人所述制 备 (Prep.Biochem.11975 ； 5： 333-348)。 人 α- 凝血酶 (4,000NIH U/mg)， 牛血清白蛋白 ( 级 分 V) 和氯胺 T 来自 Sigma Chemical Co.(St.Louis， MO)。全部过程于 4℃进行。将编码 TM 的 6 个 EGF- 样重复子 ( 氨基酸 227-462) 的 DNA 序列连接到昆虫蛋白酶的信号序列， 皮下素 (hypodermin)A 和杂交体基因在杆状病毒穿梭 载体 pTMHY101 中放置在多角体基因启动子控制下。使用标准技术产生重组病毒。通过使 用诱变物定点诱变试剂盒 (Stratagene， Inc.， La Jolla， CA) 制备描述的突变类似物， 和制 备病毒， 用于通过相同的方法在杆状病毒系统中表达。
【用氯胺 T 的纯化和氧化】
通过离心澄清含有 TME(Sf9) 的分泌的突变体的生长培养基， 冷冻干燥及再溶解 于 1 ∶ 10 体积的 0.2％ NEM-Ac， pH7 和 0.008％ Tween 80。用 5μl 的 H2O 或 5μl 的 100mM 氯胺 T 处理等份 ； 于室温温育 20min ； 通过稀释去除氧化剂 ； 在 NAP-5 柱 (20mM Tris-HCl， 0.1MNaCl， 2.5mM CaCl2， 5mg/ml BSA， pH7.4 ； Pharmacia Inc.) 上脱盐 ； 及如下检定蛋白 C 的 活化。
【TM 辅因子活性的测量 (APC 测定 )】
将全部样品和试剂稀释于 APC 检定稀释剂 (20mM Tris-HCl， pH7.4， 100mM NaCl， 2.5mM CaCl2， 0.5％ BSA)。 将样品和 TM 标准物 (0 ～ 1nM) 以 60μl 总体积于 37℃在 96- 孔板 中与 0.5μM 蛋白 C 和 1nM 凝血酶温育 60min， 产生 APC， 然后用 20μl 的水蛭素 (0.16U/μl， 570nM) 淬灭。通过以 1min 间隔在 405nm 处使用平板读数仪 (Molecular Devices Corp.， Menlo Park， CA) 监控 S-2266(100μl 的 1mM) 的水解测定形成的 APC 的量。1U 的活性产生 1pmol 的活化的蛋白 C/min(37℃ )。
【2. 结果】
【通过 Met388 的氧化的 TM 的减小的辅因子活性】
在昆虫细胞中表达突变体和野生型 TME(Sf9)， 用氯胺 T 处理， 检定辅因子活性和 比较结果 ( 表 2)。 当将 TME 用氧化剂诸如氯胺 T 处理时， 其缓和约 85％的其辅因子活性 ( 见 291 388 表 2)。Met 和 Met 的定点突变展示， TME(Sf9) 的灭活是由于单甲硫氨酸的氧化。将保 388 留 Met 的衍生物通过氯胺 T 灭活到类似程度 ( ＞ 80％ )， 然而 Met388Leu 突变体是抗性 291 的。Met 被取代的突变活跃的， 但对氧化灭活不是抗性的。
【实施例 VI. 具有 EGF4 和 EGF5 之间的域间环的突变 (Gln387， Met388， Phe389) 的 TM 类似物的分析】
对于血栓调节素类似物的单特异性突变体， 使用蛋白 C 活化测定分析这些残基和 它们的氧化的作用。
【1. 实验过程】
质粒构建 . 仅由 EGF- 样结构域 (TME) 组成的血栓调节素片段如下在大肠杆菌 (E.coli) 中表达， 通过聚合酶链反应从人基因组 DNA， 使用引物
5‘-CCGGGATCCTCAACAGTCGGTGCCAATGTGGCG-3’ 和
5‘-CCGGGATCCTGCAGCGTGGAGAACGGCGGCTGC-3’得 到 编 码 全 长 TM 的 TME( 残 基 227-462) 的 DNA 片段。此片段在 pKT279 中放置在 β- 内酰胺酶启动子和信号测序控制下。 然后将得到的质粒的 EcoRV-BglII 片段和含有 f1 复制原点的 pGEM3zf 的 ScaI-SacI 片段 分别在 EcoRV-BamHI 和 ScaI-SacI 位点插 pSelect-1 载体， 以构建大肠杆菌 (E.coli) 表 达质粒 pTHR211。使用在 vitor 诱变试剂盒中改变的位点中描述的定点诱变过程， 用单链
pTHR211DNA 模板构建编码在第 387， 388 或 389 位突变的 TM 突变体的质粒。通过限制性分 析确认定点突变的各引物。
为了测量突变体的辅因子活性， 将表达突变蛋白的个体大肠杆菌 (E.coli) 培养 物离心， 洗涤的， 及将细胞沉淀在 20％蔗糖， 300mMTris-HCl， pH8.0， 1mM EDTA， 0.5mM MgCl2 中温育 (10min， 4℃ )。通过用 0.5mM MgCl2 处理的细胞沉淀的离心制备 shockate(10min， 4℃ )， 及在 APC 测定中检定。数据是产生自各 3 个独立克隆的平均。
【TM 辅因子活性的测量 (APC 测定 )】
将全部样品和试剂稀释于 APC 检定稀释剂 (20mM Tris-HCl， pH7.4， 100mM NaCl， 2.5mM CaCl2， 0.5％ BSA)。将样品和 TM 标准物 (0 ～ 1nM) 以 60μl 总体积于 37℃在 96- 孔 板中与 0.5μM 蛋白 C 和 1nM 凝血酶温育 60min， 以产生 APC， 然后用 20μl 的水蛭素 (0.16U/ μl， 570nM) 淬 灭。 通 过 以 1min 间 隔 在 405nm 处 使 用 平 板 读 数 仪 (Molecular Devices Corp.， Menlo Park， CA) 监控 S-2266(100μl 的 1mM) 的水解来测定形成的 APC 的量。1U 的 活性产生 1pmol 的活化的蛋白 C/min(37℃ )。
【2. 结果】
【通过环间结构域的突变的 TM 的减小的辅因子活性】
使用定点诱变， 表达在第 387， 388 或 389 位具有改变的氨基酸， 缺失或插入的 TM 突变体 ( 图 8)。TM 突变体的辅因子活性是从 3 个独立克隆获得的平均值， 及表达为对于 TME(Sf9)WT 发现的活性的百分率。 使用针对 TM 的多克隆抗体， 对在第 388 位的全部新突变 体及对在第 387 位的选择的突变体进行对于蛋白印迹的凝胶扫描。这些扫描给大致相当的 量的 TM， 表明表达差异不可解释观察的活性差异。此外， 在第 387 位 ( 图 8A)， 388( 图 8B)， 389( 图 8C) 的独立取代， 或结构域间环内任何处的插入和缺失 ( 图 8D) 产生通常是在 APC 测定中相比野生型 TME 更差的辅因子的类似物。 Gln387 被 Thr， Met 或 Ala 取代的类似物保留 ＞ 70％辅因子活性， 但用 Glu 取代将此减小到对照的 58％， 及全部其他氨基酸导致＞ 50％ 388 损失。仅 Met 用 Leu 的取代导致相比野生型基本上更高辅因子活性 (1.8 倍 )。Met388 除 了 Gln 和 Tyr 之外的全部其他取代导致辅因子活性的＞ 50％损失。TM 辅因子活性欠敏感 于 Phe389 的氨基酸取代， 和此位置的点突变中的 9 种保留见于对照的＞ 70％的活性。在任 何位置的 Pro 或 Cys 取代减小活性至＞ 10％， 除了 Met388Pro 之外， 其保留 30％活性。通 过删除个体氨基酸或将 Ala 插入各 4 个可能的位置改变 EGF4 和 EGF5 之间的域间环的长度 导致具有小于野生型 TME 的 10％的活性的突变体。 【附图说明】
图1： 因子 VIII 缺陷血浆 (FVIII-DP)， 正常血浆 (NP) 和与 NP 混合的 FVIII-DP 的 凝块 - 溶解特征和溶解时间。凝块溶解特征显示为 0(-)， 1(· · · · )， 6(---)， 10(-· · -· · -)， 50(---) 和 100％ (-· -· -)NP。从凝块 - 溶解特征， 通过取凝块降解到其最高光密度的 1/2 的时间来测定溶解时间。在插图中， 总结了溶解时间， 一般趋势是溶解时间增加， 随着 NP 的 百分率 ( 及因而 FVIII 的量 ) 增加。添加 NP 对溶解时间的效应达到 10％ NP 的平台期。
图2： 含有各种百分率的 FVIII 的血浆中凝血酶可活化的纤溶抑制剂 (TAFI) 活 化： (A) 当将 FVIII- 缺陷型血浆 (FVIII-DP) 与正常血浆 (NP) 混合时， TAFI 活化增强。在 FVIII-DP 中， 相比在 50 ％ NP( □ ) 和 100 ％ NP( △ ) 中～ 600pM TAFIa， 仅在其峰测量到30pMTAFIa( ● )。这些实验以一式三份进行， 和数据代表平均值 ±SE。TAFIa 势 (B)， 在此 定义为在活化标绘图 (A) 自凝块起始时间到最后时间点的时间进程下面积， 随着 NP 的百分 率增加而增加到 50％ NP 的平台期。50％ NP 和 100％ NP 的 TAFIa 势类似 ( 分别 14,100pM min 及 16,800pM min， )， 尽管它们的相应 TAFI 活化标绘图的形状相当地不同。使用对数溶 解时间对比对数 TAFIa 势的标绘图显示溶解时间 ( 图 1， 插图 ) 及 TAFIa 势之间的关系， 如 其有关 FVIII 水平 ( 图 2B， 插图 )。如预期， 数据显示， 在含有 0 ～ 100％ FVIII 的血浆中溶 解时间和 TAFIa 势之间的强阳性关联。
图3： 对于与 0( ● )， 1( ■ )， 6( ▲ )， 10( ○ )， 50( □ ) 和 100％ NP( △ ) 混合的 FVIIIDP 显示含有各种百分率的 FVIII 的血浆中的凝血酶原活化。凝血酶原活化的时间进 程。一般而言， 凝血酶原活化速度随着 NP 的百分率增加而增加。以 50％ NP， 以高速发生凝 血酶原活化 ( 如通过检查各标绘图的斜率测定 ) 及呈现为在 15min 内， 然而 100％ NP 具有 在更长时期的更慢凝血酶原活化的速度。
图4： 在 正 常 血 浆 (NP) 和 因 子 VIII 缺 陷 血 浆 (FVIII-DP) 中， 以各种浓度的 sTM(0 ～ 100nM) 和 tPA(0.25 ～ 3nM)， sTM 对凝血酶可活化的纤溶抑制剂 (TAFI) 活化的效 应。FVIII-DP 中的延长溶解中的 TAFIa- 依赖性缺陷通过将 100nM sTM 添加到含有 0.25nM tPA 的血浆中来修正。随着 tPA 的浓度增加， 在 100nM sTM 存在下观察到 FVIII-DP 中溶解 缺陷的仅部分修正。在这些实验中， 马铃薯块茎羧肽酶抑制剂 (PTCI) 用于创建无有功能的 TAFIa 的条件。因此， 如以溶解时间 / 溶解时间 +PTCI 比显示的任何溶解的增加是 TAFIa 依 赖性的。
图5： 在正常血浆 (NP)(A) 和 FVIII- 缺陷型血浆 (FVIII-DP)(B) 中， 在 10nM 血栓 调节素 ( ● ) 存在下或无血栓调节素 ( ○ ) 的情况下， TAFI 活化和凝块溶解表征。(-) 显 示伴随凝块 - 溶解特征， 和对于无 sTM 的凝块溶解特征显示作为参照 (---)。 这些实验以一 式三份进行， 和数据代表平均值 ±SE。
图6： 与血栓调节素结合的凝血酶。通过滴定由在 20mM Tris·HCl， 150mM NaCl， 2+ 5.0mM Ca ， 0.01 ％ Tween 80 中的凝血酶 (20nM) 和 DAPA(20nM) 和在同一溶液中含有的 1.54μM 血栓调节素组成的 1.5ml 的溶液来测定凝血酶与血栓调节素的结合。荧光强度测 量 (λex ＝ 280nm， λem ＝ 545nm)。
图7： TAFI 和蛋白 C 活化中的点突变的相对辅因子活性。将丙氨酸 - 扫描诱变用 于在可溶性血栓调节素中制备点突变。对于 TAFI( 实心条 ) 和蛋白 C( 斜线纹条 ) 显示蛋 白 C 和 TAFI 活化速度 ( 相对于用突变 TMEM388L 的活化速度 )。
图8： EGF4 和 EGF5 之间的域间环的突变。在大肠杆菌 (E.coli) 中， 对于各突变体 构建 3 种独立质粒。 制备 shockate， 通过 APC 测定检定辅因子活性， 及在蛋白印迹上分析样 品 ( 不显示的 )。活性值是自 3 个分离克隆的平均。小图 A， 在 Gln387 的取代突变 ； 小图 B， 在 Met386 的取代 ； 小图 C， 在 Phe389 的取代突变 ； 小图 D， 域间环内的缺失和丙氨酸插入。 显 示测量来自用缺少 TM 插入子的对照质粒， pSelect 转染的大肠杆菌 (E.coli) 的 shockate 的活性。对于额外的细节见 Clarke 等人 (J.Biol.Chem.1993 ； 268 ： 6309-6315)。
图9 ： 血栓调节素的促 - 及抗纤维蛋白溶解效应的示意性模式图 ( 根据 Mosnier 和 Bouma 修饰的， Arterioscler.Thomb.Vasc.Biol.2006 ； 26 ： 2445-2453)。以低 TM 浓度凝块 溶解时间的增加可归因于 TAFI 活化的刺激， 及例证 TM 的抗纤维蛋白溶解活性。以更高浓度的兔肺 TM， 凝块溶解时间降低， 因为蛋白 C 的活化和 TAFI 活化的抑制 ； 例证兔肺 TM 的致 纤溶活性 ( 实线 )。注意， 兔肺 TM 的 15nM 以上的致纤溶活性超过抗纤维蛋白溶解活性， 导 致总体致纤溶效应。相反， 可溶性 TM 类似物显示仅抗纤维蛋白溶解效应 ( 虚线 )。
【附表说明】
表1： 数据的总结用于构建图 4， 包括 PTCI 存在下的绝对溶解时间， 以致使在各条 件下确定溶解时间。在全部情况中， 溶解时间相对于在 TAFIa 抑制剂， PTCI 存在下获得的 时间表示。TAFI， 凝血酶可活化的纤溶抑制剂 ； PTCI， 马铃薯块茎羧肽酶抑制剂。
表2： TME(Sf9) 的定点突变类似物的氯胺 T 氧化
本发明涉及具有纤溶亢进的凝血病的领域。更具体而言， 本发明涉及治疗血友病 疾病， 诸如血友病 A 或血友病 B。 【背景技术】
血友病是损伤身体的控制血凝固或凝血的能力的一组遗传性遗传病症， 所述凝血 在血管破裂时用于停止出血。血友病 A， 最常见的形式， 产生自因子 VIII 的基因突变 ； 血友 病 B， 也称为 Christmas 病， 产生自因子 IX 的基因突变。血友病 B， 如血友病 A， 是 X 连锁的 及占血友病病例的约 12％。症状与血友病 A 的相同 ： 损伤之后过量的出血 ； 及自发出血， 尤 其进入承重关节， 软组织及粘液膜。 重复的出血进入关节导致关节积血， 导致常常使需要关 节置换的疼痛致残关节病。软组织中的血肿可导致坏死性凝集的血组成的假肿瘤 ； 它们可 阻碍， 压缩或破裂到相邻器官和可导致感染。一旦形成， 血肿难以治疗， 甚至用手术。压缩 之后的神经恢复差， 导致麻痹。如果不检测， 涉及消化道， 中枢神经系统， 或气道 / 腹膜后空 间的那些出血发作可导致死亡。颅内出血是血友病患者死亡的主要原因。
在美国估计有 100,000 例先天性血友病。这些中， 约 20,000 是血友病 B 的情况， 该患者的血或者完全缺乏因子 IX， 或血浆因子 IX 组分严重地缺陷。 因此疾病存在改变程度 的严重性， 需要从每周达一年一次或两次的治疗。 完全缺陷情况需要每周一次替代治疗 ； 部 分缺陷情况需要仅当出血发作发生时治疗， 其可稀少至一年一次。 先天性， 部分缺陷情况中 的出血发作通常由暂时获得的感受性而非由损伤单独导致。 静脉内注射足够大量的新鲜血 浆， 或相当的量的新鲜血暂时校正缺陷受试者的缺陷。有益效应常常持续 2 或 3 周， 尽管通 过对患者的血体外测试测量的凝固缺陷呈现改善仅 2 或 3 天。
该用新鲜血浆或新鲜血的治疗有效， 但其具有几个严重的缺点 ： (1) 其需要大量 的新鲜血浆的现成可利用性 ； (2) 需要血浆施用的住院治疗 ； (3) 大量的患者成为致敏于重 复的血或血浆输注及最终遭遇致死的输注反应 ； (4) 至好血浆可仅部分缓和缺乏 ； 及 (5) 延 长的治疗或手术是不可能的， 因为需要的大量的血或血浆会导致急性和致死的水肿。
改善的治疗包括用因子 VIII 或因子 IX 浓缩物静脉内替代治疗。但是， 此治疗 也有几个缺点 ： (1) 当治疗主要出血发作时， 甚至在迅速检测和治疗之后仍保留组织损伤 ； (2) 大量的患者成为用凝血因子难治， 且发展针对凝血因子的抑制性抗体 ( 所谓的具有抑 制物的血友病 ) ； (3) 尽管改善的病毒灭活方法， 仍有增加的被致死的病毒诸如 HIV 和丙型 肝炎污染的风险 ( 在 USA， 估计大于 50％的血友病群， 超过 10,000 人， 自变质的血供给感染 HIV) ； (4)， 在发展中国家， 分离的且尤其重组体凝血因子非常昂贵， 且通常不可利用。
在替代治疗外治疗或预防出血是挑战， 因为在血友病中出血是可归因于如下三重 缺陷的复合病理生理过程 ： (1) 减少的经低组织因子浓度的外在通路的凝血酶产生， (2) 减 少的经固有通路的凝血酶产生的次级爆发， 及 (3) 纤溶系统被固有通路的缺陷性下调。
通常接受这样的事实， 减少的凝血酶产生导致减少的凝固倾向， 由此导致增加的 出血风险。但是， 过去的几十年的工作表明， 纤溶的缺陷下调也可在血友病中起到作用。结果， 血友病也可分类为具有纤溶亢进的凝血病。
新近出版物通过体外显示， 当在因子 VIII 耗竭的及补充了组织纤溶酶原活化 物 tPA 的血浆 (FVIII-DP) 中形成凝块时， 纤溶不充分下调， 结果凝块溶解提前， 从而支 持 此 推 定 (Broze and Higuchi， Blood1996， 88 ： 3815-3823 ； Mosnier et al. ； Thromb. Haemost.2001， 86 ： 1035-1039)。此外， 可显示， 此 “成熟前溶解” 是由于凝血酶 - 可活化的 纤溶抑制剂 (TAFI) 的减少的或缺乏的活化 (Broze 和 Higuchi， 1996)， 且显示， 在 FVIII-DP 中， 含有活化的 TAFI 的混合物增加凝块溶解时间。从而得出， 稳定的 TAFI 可用于治疗血友 病 (WO02/099098)。
TAFI 在纤溶下调中起到关键的作用， 其为稳定的凝块形成所需要。也称为血浆羧 肽酶原 B2 或羧肽酶原 U 的 TAFI 是血浆酶原， 当其暴露于凝血酶 - 血栓调节素复合物时， 在 92 Arg 通过蛋白水解转变为碱性羧肽酶 (TAFIa 或活化的 TAFI)， 其抑制纤溶。其通过自纤维 蛋白去除 C- 端赖氨酸和精氨酸残基有利地衰减纤溶， 所述纤维蛋白对于结合及活化纤溶 酶原重要。
如上所述， 与凝血酶复合的血栓调节素 (TM) 负责 TAFI 活化。血栓调节素是发挥 衬于血管的内皮细胞上的凝血酶受体的作用的膜蛋白。凝血酶是凝血级联中的中心酶， 其 将纤维蛋白原转变为纤维蛋白， 基质凝块形成。 起初， 局部损伤导致小量的凝血酶从其无活 性前体凝血酶原产生。 进而， 凝血酶活化血小板， 且其次， 某些凝血因子包括因子 V 和 VIII。 后来的作用产生所谓的凝血酶爆发， 大量活化的额外的凝血酶原分子， 其最终导致稳定的 凝块形成。 但是， 当结合到血栓调节素时， 凝血酶活性趋势性变化 ： 凝血酶 - 血栓调节素复合 物的主要特征是其活化蛋白 C 的能力， 其然后通过蛋白水解地灭活必要的辅因子因子 Va 和 因子 VIIIa 下调凝血级联 (Esmon et al.， Ann.N.Y.Acad.Sci.(1991)， 614 ： 30-43)， 由此提 供抗凝活性。凝血酶 - 血栓调节素复合物也能活化凝血酶 - 可活化的纤溶抑制剂 (TAFI)， 其然后拮抗纤溶 ( 见以上 )。
成熟人 TM 由 559 个残基的单多肽链组成， 及由具有下列位置 (SEQ ID NO ： 1 或 SEQ ID NO ： 3 给出的氨基酸位置 ) 的 5 个结构域组成 ： 氨基末端″凝集素 - 样″结构域， 包含 6 个表皮生长因子 (EGF)- 样重复子的″ 6EGF- 样重复结构域″， O- 糖基化结构域， 跨膜结构 域和细胞质结构域 ：
大致氨基酸位置 -18--1 1-226 227-462 463-497 498-521 结构域 信号序列 N- 端结构域 ( 凝集素 - 样 ) 6EGF- 样重复结构域 O- 连接的糖基化 跨膜结构域细胞质结构域使用兔 TM 或重组人 TM 的缺失突变体的蛋白水解片段的各种结构 - 功能研究已将 其活性定位到最后 3 个 EGF- 样重复子。能有效促进 TAFI 活化的最小突变体含有包括表皮 生长因子 -3(EGF3) ～ EGF6 的 c- 环的残基。此突变体相比活化 C 的最小突变体长 13 个残 基； 后者由自连接 EGF3 和 EGF4 ～ EGF6 的域间环的残基组成。
如上所述， 用于治疗凝血障碍诸如血友病的替代治疗不符合医学需求。 重要的是， 无除了用于替代治疗的凝血因子的药物可在预防或治疗血友病患者中利用。
由此， 尽管长期需求开发预防或治疗具有纤溶亢进的凝血病， 尤其是血友病的治 疗， 进展慢， 及仍无保险和有效的治疗剂。
【发明内容】
由此， 本发明的目的是提供用于治疗具有纤溶亢进的凝血病的新手段。
通过提供治疗哺乳动物中， 尤其是人中具有纤溶亢进的凝血病的药物来解决此目 的， 包含以治疗有效剂量呈现抗纤维蛋白溶解效应的血栓调节素类似物。 此新方法基于惊人的发现， 血栓调节素可以呈现甚至以高血浆浓度， 尤其是以大 于 15nM， 尤其是大于 20， 30， 40 或 50nM( 至少达 100nM) 的浓度发挥其致纤溶活性的抗纤维 蛋白溶解活性的方式修饰。因此这些 TM 类似物呈现抗纤维蛋白溶解效应， 且由此适于本发 明的用途。
此抗纤维蛋白溶解效应显示于自血友病患者 ( 其耗竭因子 VIII ； FVIII-DP) 的血 浆。由此展示， 可将该血栓调节素类似物用作治疗剂。
至今， 血栓调节素用于治疗血友病的治疗性用途不被认为是实际选项， 因为从 兔肺血栓调节素 (rlTM) 已知， 其总是甚至在相当低的浓度具有抗 - 及致纤溶活性 ( 见 Mosnier and Bouma ； Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.2006 ； 26 ： 2445-2453 ； 尤其图 5)。 在小于 15nM 的血浆浓度， rlTM 增加凝块溶解时间， 然而在大于 15nM 的血浆浓度， 展示溶解 时间的显著降低 (Mosnier et al.， 2001， Mosnier and Bouma， 2006)， 如最终结果的致纤溶 效应。此在更高浓度的致纤溶效应抑制血友病中的任何治疗用途， 由于潜在过量施剂或感 受性的个体变异会致命地恶化， 延长或甚至导致出血事件。
根据本发明， 存在产生呈现抗纤维蛋白溶解效应的 TM 类似物的各种选项， 由此适 于本发明的治疗。
在一实施方式中， 血栓调节素类似物可以减少的与凝血酶的结合亲和力使用。因 而， 它们可延长正常血浆和 FVIII-DP 中的凝块溶解， 例如达 100nM( 图 4)。
这些发现的重要性是， 这些血栓调节素类似物甚至以高浓度也无有害的致纤溶效 应地呈现抗纤维蛋白溶解效应。此浓度超过最治疗有效剂量。因此， TM 类似物致使治疗具 有纤溶亢进的凝血病。
不受此理论束缚， 发明人显示， TM 类似物的此治疗性潜力可被它们显示显著减 小 的 与 凝 血 酶 的 亲 和 性 解 释。 此 通 过 Bajzar et al 显 示。(J.Biol.Chem 1996 ； 271 ： 16603-16608)， 其发现观察到用于凝血酶和兔肺血栓调节素之间结合的对比 0.2nM 的 KD 值
的 23nM 的 KD 值 (Esmon et al.， Ann.NY.Acad.Sci.1986， 485 ： 215-220)。
因此， 根据本发明的一实施方式， 血栓调节素类似物可用于治疗具有纤溶亢进的 凝血病， 其相比兔肺血栓调节素具有减小的与凝血酶的结合亲和力。
尤其是， 可使用血栓调节素类似物， 其呈现大于 0.2nM， 优选大于 1nM， 2nM， 4nM， 5nM， 7.5nM， 10nM， 12.5nM， 15nM， 17.5nM， 20nM， 22.5nM 或 25nM 的用于凝血酶结合的 KD， 且更 优选 KD 取值跨 10 和 30nM 或更大之间。
在本发明的进一步实施方式中， 血栓调节素类似物的减小的致纤溶活性可由于减 小的活化蛋白 C 的能力 ( 所谓的 “辅因子活性” )。由于蛋白 C 活化导致纤溶上调 (Mosnier 等人， 2001)， 减小的辅因子活性会延长凝块溶解时间。本领域技术人员知道减小血栓调节 素的辅因子活性的几个策略， 诸如例如蛋白的糖基化， 二级或三级结构的变化， 或优选一级 结构的变化， 例如通过一个或更多氨基酸的突变。
在再一实施方式中， 可使用 TM 类似物， 其相比血栓调节素类似物 TMEM388L 具有减 小的辅因子活性， 其中 TME 表示仅由 6 个 EGF 结构域组成的类似物。
根据本发明， 也可使用血栓调节素类似物其具有增加的活化 TAFI 的能力 ( 所谓的 “TAFI 活化活性” )， 由于 TAFI 活化导致纤溶下调 (Mosnier 和 Bouma， 2006)。对于本领域技 术人员， 有几个通过血栓调节素增加 TAFI 活化活性的策略， 诸如蛋白的糖基化， 二级或三 级结构的变化， 或优选一级结构的变化， 例如通过一个或更多氨基酸的突变。 特别， 本发明也提供血栓调节素类似物， 其相比血栓调节素类似物 TMEM388L 具有 显著增加的 TAFI 活化活性与辅因子活性比。
显著地， 根据本发明， 用于治疗凝血病的 TM 类似物具有一种或更多种以上描述的 特征， 即：
(i) 与凝血酶的结合亲和力相比兔肺血栓调节素降低， 和 / 或具有大于 0.2nM 的 kD 值的与凝血酶的结合亲和力 ；
(ii) 相比 TM 类似物 TMEM388L 的辅因子活性减小的辅因子活性， 或者
(iii) 相比 TM 类似物 TMEM388L 增加的 TAFI 活化活性与辅因子活性比。
在本发明的实施方式中， 血栓调节素可用于治疗患有以相比正常受试者显著地或 甚至稍微减小的纤溶发生的任何凝血病的人患者。尤其是， 用血栓调节素类似物可治疗下 列疾病 ： 血友病 A， 血友病 B， 血友病 C， von Willebrandt 病 (vWD)， 获得性 von Willebrandt 病， 因子 X 缺乏， 副血友病， 凝血因子 I， II， V 或 VII 的遗传性病症， 循环抗凝剂所致的出血 性病症 ( 包括针对凝血因子诸如因子 VIII 的自身抗体 ) 或获得性凝血缺乏。
会理解， 可通过本发明治疗维持或达到的治疗性成功依赖于任何特定患者中疾病 的性质和程度。
本发明的特定实施方式涉及预防性治疗凝血病， 以阻止出血或当出血发生时 ( “按 需” ) 急性治疗。待用血栓调节素类似物治疗的出血事件可在生物中的每种器官或组织中 发生， 最重要的是在中枢神经系统中发生， 例如颅内出血， 在关节， 肌肉， 消化道， 呼吸道， 腹 膜后空间或软组织中。
对于预防性治疗而言， 可将 TM 类似物跨延伸的时期以规则间隔给予患者。但是， 在相当局限的时期多个施剂 (“亚慢性治疗” ) 也是可能的。
在本发明的一实施方式中， 血栓调节素类似物在更高出血风险， 例如手术或拔牙
之前给予。
在本发明的进一步实施方式中， 血栓调节素类似物施用给用标准治疗诸如血或血 浆输注或使用凝血因子的替代治疗难治的患者。
根据本发明， TM 类似物可以多剂量施用， 优选在跨不到 1 周至 4 周的整个时期每 天而且每两天， 或每 3 天， 每 4 天， 每 5 天， 每 6 天或每 7 天一次， 更优选作为慢性施用。由 此， 提供根据本发明药物组合物， 其适于允许血栓调节素类似物的多施用。
TM 类似物优选非 - 经口给予， 如肠胃外应用， 例如通过静脉内或皮下应用。 静脉内 或皮下推注应用是可能的。 由此， 提供根据本发明药物组合物， 其适于血栓调节素的肠胃外 施用。
在本发明的一实施方式中， 血栓调节素类似物是可溶性 TM 类似物， 尤其是其中细 胞质结构域缺失及跨膜结构域完全或部分缺失的 TM 类似物。
在本发明的优选的实施方式中， 血栓调节素类似物包含选自下列的至少一种结构 域： EGF3， EGF4， EGF5 或 EGF6， 优选 EGF 结构域 EGF1 ～ EGF6， 更优选 EGF 结构域 EGF3 ～ EGF6， 以及最优选 EGF 结构域 EGF4 ～ EGF6 和特别是包括表皮生长因子 -3(EGF3) ～ EGF6 的 c- 环的片段。
本领域技术人员已知可溶性血栓调节素的各种形式， 例如 Asahi 公司 (Tokyo， Japan) 开发的所谓的 ART-123 或 PAION DeutschlandGmbH， Aachen( 德国 ) 的目前尚未开 发完全的重组体可溶性人血栓调节素 Solulin。 重组体可溶性血栓调节素， 即无氨基酸序列 修饰的可溶性血栓调节素是 Asahi 专利 EP0312598 的主题。
Solulin 是可溶性的， 且是蛋白酶和人血栓调节素的耐氧化的类似物， 由此呈现长 体内生命。Solulin 的主要特征在于由于其不完全抑制凝血酶的其广作用机理。其也活化 TAFI 和天然的蛋白 C/ 蛋白 S 通路。结果， 其减小的凝血酶结合 Solulin 抑制纤溶甚至达高 浓度。
Solulin 尤其是欧洲专利 0641215B1， EP 0544826B1 以及 EP 0527821B1 的主题。 Solulin 相比天然人血栓调节素的序列 (SEQ ID NO ： 1) 在下列位置含有修饰 ： G-3V， 去除氨 基酸 1 ～ 3， M388L， R456G， H457Q， S474A 和在 P490 终止。此编号系统是根据 SEQ ID NO ： 1 和 SEQ ID NO ： 3 的天然血栓调节素。作为本发明的一个优选的实施方式的 Solulin 的序列 显示于 SEQ ID NO ： 2。
但是， 显著地， 根据本发明也可使用血栓调节素类似物， 其仅包含一种或更多种以 上提及的性质， 或以上提及的欧洲专利文献 EP 0544826B1， EP 0641215B1 和 EP 0527821B1 中描述的性质。
可根据本发明应用的特别优选的血栓调节素类似物是具有一个或更多下列特征 的那些 ：
(i) 它们呈现氧化抗性，
(ii) 它们呈现蛋白酶抗性，
(iii) 它们具有同质 N- 或 C- 端，
(iv) 它们已翻译后修饰， 例如， 通过天然血栓调节素 (SEQ IDNO ： 1) 的至少一些糖 基化位点的糖基化，
(v) 它们具有线性双倒数凝血酶结合性质，(vi) 它们以相对低量的去污剂在水溶液中是可溶性的和一般缺乏跨膜序列，
(vii) 它们缺少葡萄糖氨基聚糖链。
本发明中使用的这些类似物的生产公开于以上提及的欧洲专利文献。
在本发明的一实施方式中， 可使用 Solulin 的仅 6 个 EGF 结构域， 尤其是由 EGF4 ～ EGF6 结构域组成的 Solulin 片段。
在一个实施方式中， 可使用如从 WO93/25675 知道的具有减小的辅因子活性的血 栓调节素类似物。本文描述了一系列血栓调节素类似物， 其具有对照人可溶性血栓调节素 (TMEM388L) 的约 50％或更小的辅因子活性。
更特别地， 所述血栓调节素类似物在与凝血酶结合时， 相比与 TMEM388L 结合呈现 小于或等于 50％的修饰的辅因子活性， 所述类似物在对应于 SEQ ID NO ： 1 或 SEQ ID NO ： 3 给出的氨基酸位置的一个或更多位置具有氨基酸取代 ：
(aa)349Asp ；
(bb)355Asn ；
(ac)357Glu ；
(ad)358Tyr ；
(ae)359Gln ； (af)363Leu ； (ai)368Tyr ； (aj)371Val ； (ak)374Glu ； (al)376Phe ； (am)384His ； (an)385Arg ； (ba)387Gln ； (bb)389Phe ； (bc)398Asp ； (bd)400Asp ； (be)402Asn ； (bf)403Thr ； (bg)408Glu ； (bh)411Glu ； (bi)413Tyr ； (bj)414Ile ； (bk)415Leu ； (bl)416Asp ； (bm)417Asp ； (bn)420Ile ； (ca)423Asp ； (cb)424Ile ；(cc)425Asp ； (cd)426Glu ； (ce)428Glu ； (cf)429Asp ； (cg)432Phe ； (ch)434Ser ； (ci)436Val ； (cj)438His ； (ck)439Asp ； (cl)440Leu ； (cm)443Thr ； (cn)444Phe ； (co)445Glu ； (cp)456Arg ； (cq)458Ile ； 或者(cr)461Asp。
最优选仅具有以上列的取代之一的 TM 类似物。为便利， 左侧标识， 例如 (aa) 同于 各修饰的位点。第 1 字母代表 EGF 结构域， 其中 a 是 EGF4 ； b 是 EGF5 和 c 是 EGF6。第 2 字 母代表就列中的其他残基的相对修饰位置。本文也提供编码上述 TM 类似物的核酸。
下列类似物构成以上给的类似物的优选的子集， 其中类似物具有 25％或更小的对 照， TMEM388L 的辅因子活性。这些类似物具有一个或更多氨基酸取代， 优选仅一个 (SEQ ID NO ： 1 或 SEQ ID NO ： 3 给出的氨基酸位置 ) ： 349
(aa) Asp ；
(ac)357Glu ；
(ad)358Tyr ；
(ae)359Gln ；
(aj)371Val ；
(ak)374Glu ；
(al)376Phe ；
(bc)398Asp ；
(bd)400Asp ；
(be)402Asn ；
(bg)408Glu ；
(bi)413Tr ；
(bj)414Ile ；
(bk)415Leu ；
(bl)416Asp ；
(bm)417Asp ；
(bo)423Asp ；(bp)424Ile ；
(bq)425Asp ；
(cd)426Glu ；
(ce)429Asp ；
(ck)439Asp ；
(cn)444Phe ； 或者 461
(cr) Asp。
以上就蛋白酶活性， 脂肪族取代， 氧化抗性和统一的末端所示的修饰也可应用于 具有小于 50％的对照的辅因子活性的以上类似物。
优选的是以上所列具有小于 30％的对照的活性的那些。这些类似物通过结构域 4 中的突变呈现。这些类似物具有一个或更多氨基酸取代， 优选仅一个 (SEQ ID NO ： 1 或 SEQ ID NO ： 3 给出的氨基酸位置 ) ：
(aa)349Asp ；
(ac)357Glu ；
(ad)358Tyr ； (ae)359Gln ；
(aj)371Val ； 或者 376
(al) Phe。
本文也述具有相比 TMEM388L 基本上未修饰的 KD 值的类似物。 EGF5 和 EGF6 已知在 与凝血酶的高亲和性结合中起到重要作用， 然而 EGF4 在结合中具有欠关键作用对于给 TM/ 凝血酶复合物赋予辅因子活性是关键的。由此原因， 那些在 EGF 重复子 5 和 6 中具有修饰 的类似物可具有几乎相同的辅因子活性， 但相比 TMEM388L 减小的 KD， 例如 (S406A)。以下列 出导致减小的辅因子活性的在 EGF 重复子 5 和 6 中具有修饰的类似物。这些类似物具有一 个或更多氨基酸取代， 优选仅一个 (SEQ ID NO ： 1 或 SEQ ID NO ： 3 给出的氨基酸位置 ) ： 398
(bc) Asp ；
(bd)400Asp ；
(be)402Asn ；
(bf)403Thr ；
(bg)408Glu ；
(bi)413Tyr ；
(bj)414Ile ；
(bk)415Leu ；
(bl)416Asp ；
(bm)417Asp ；
(ca)423Asp ；
(cb)424Ile ；
(cc)425Asp ；
(cd)426Glu ；
(cf)429Asp ；
(ck)439Asp ；
(cn)444Phe ； 或者 461
(cr) Asp。
以上类似物也可通过它们的相应结构域 ( 即， EGF4， EGF5 或 EFG6) 以及通过它们的 相应相对活性分组。例如， 具有约 50％的对照辅因子活性的 EGF4 的类似物是 (SEQ ID NO ： 1 或 SEQ ID NO ： 3 给出的氨基酸位置 ) ： 349
(aa) Asp ；
(bb)355Asn ；
(ac)357Glu ；
(ad)358Tyr ；
(ae)359Gln ；
(af)363Leu ；
(ai)368Tyr ；
(aj)371Val ；
(ak)374Glu ；
(al)376Phe ；
(am)384His ； 或者 385
(an) Arg。
最优选具有仅一个以上所列的取代的 TM 类似物。
具有小于 25％的对照的辅因子活性的 EGF4 中的那些是 (SEQ IDNO ： 1 或 SEQ ID NO ： 3 给出的氨基酸位置 ) ：
(aa)349Asp ；
(ac)357Glu ；
(ad)358Tyr ；
(ae)359Gln ；
(aj)371Val ； 或者 376
(al) Phe。
最优选具有仅一个以上所列的取代的 TM 类似物。
在 EGF5 中， 下列修饰导致具有至少 50％辅因子活性减小的类似物 (SEQ ID NO ： 1 或 SEQ ID NO ： 3 给出的氨基酸位置 ) ： 398
(bc) Asp ；
(bd)400Asp ；
(be)402Asn ；
(bf)403Thr ；
(bg)408Glu ；
(bh)411Glu ；
(bi)413Tyr ；
(bj)414Ile ；
(bk)415Leu ；(bl)416Asp ；
(bm)417Asp ； 或者 420
(bn) Ile。
最优选具有仅一个以上所列的取代的 TM 类似物。这些类似物中尤其是类似物相 比 TMEM388L 具有基本上未修饰的 kCat/Km 的那些。
在 EGF5 中， 类似物还可根据导致具有至少 75％辅因子活性减小的类似物的那些 修饰亚分组 (SEQ ID NO ： 1 或 SEQ ID NO ： 3 给出的氨基酸位置 ) ： 398
(bc) Asp ；
(bd)400Asp ；
(be)402Asn ；
(bg)408Glu ；
(bi)413Tyr ；
(bj)414Ile ；
(bk)415Leu ；
(bl)416Asp ； 或者 417
(bm) Asp。
最优选具有仅一个以上所列的取代的 TM 类似物。这些类似物中尤其是相比 TMEM388L 具有基本上未修饰的 kCat/Km 的那些。也提供编码以上类似物的核酸。
就 EGF6， 提供以下组。具有小于对照的 50％的辅因子活性的那些是 (SEQ ID NO ： 1 或 SEQ ID NO ： 3 给出的氨基酸位置 ) ： 423
(ca) Asp ；
(cb)424Ile ；
(cc)425Asp ；
(cd)426Glu ；
(ce)428Glu ；
(cf)429Asp ；
(cg)432Phe ；
(ch)434Ser ；
(ci)436Val ；
(cj)438His ；
(ck)439Asp ；
(cl)440Leu ；
(cm)443Thr ；
(cn)444Phe ；
(co)445Glu ；
(cp)456Arg ；
(cq)458Ile ； 或者 461
(cr) Asp。
最优选具有仅一个以上所列的取代的 TM 类似物。具有小于对照的 25％的辅因子活性的那些是 (SEQ ID NO ： 1 或 SEQ ID NO ： 3 给出 的氨基酸位置 ) ：
(ca)423Asp ；
(cb)424Ile ；
(cc)425Asp ；
(cd)426Glu ；
(cf)429Asp ；
(ck)439Asp ；
(cn)444Phe ； 或者 461
(cr) Asp。
最优选具有仅一个以上所列的取代的 TM 类似物。优选的类似物是以上所示的具 有就溶解度， 蛋白酶抗性， 氧化抗性以及统一的末端的额外的修饰的那些。 编码这些类似物 的核酸也是要求保护的发明的一部分。有关其他组， 这些类似物包括其中所述类似物具有 相比 TMEM388L 基本上未修饰的 kCat/Km 的那些。
类似物可根据在某些位置具有修饰的氨基酸的那些进一步亚分组， 其中所述类似 物具有相比在所述位置具有天然残基的类似物基本上相当的对于凝血酶的 KD， 其中所述位 置对应于 (SEQ ID NO ： 1 或 SEQ ID NO ： 3 给出的氨基酸位置 ) ： 349
(aa) Asp ；
(bb)355Asn ；
(ac)357Glu ；
(ad)358Tyr ； 或者 359
(ae) Gln。
最优选具有仅一个以上所列的取代的 TM 类似物。这些类似物可具有小于对照的 30％的修饰的 kCat/Km。
下列位点包含具有相比在所述位置具有天然残基的类似物修饰的 KD 或 kCat/Km 的描述的类似物， 其中所述位置对应于 (SEQ ID NO ： 1 或 SEQ ID NO ： 3 给出的氨基酸位置 ) ： 363
(af) Leu ；
(aj)371Val ；
(ak)374Glu ；
(al)376Phe ；
(am)384His ；
(an)385Arg ；
(bc)398Asp ；
(bd)400Asp ； 或者 402
(be) Asn。
最优选具有仅一个以上所列的取代的 TM 类似物。这些还包括具有修饰的 KD 和 kCat/Km 的那些类似物， 尤其已修饰至少 20％的那些。
下列位点描述具有相比在所述位置具有天然残基的类似物基本上相当的更低的 辅因子活性和 KD 或 kCat/Km 的类似物， 其中所述位置对应于 (SEQ ID NO ： 1 或 SEQ ID NO ：3 给出的氨基酸位置 ) ：
(bg)408Glu ；
(bh)411Glu ；
(bi)413Tyr ；
(bj)414Ile ；
(bk)415Leu ；
(bl)416Asp ；
(bm)417Asp ；
(bn)420Ile ；
(ca)423Asp ；
(cb)424Ile ；
(cc)425Asp ；
(cd)426Glu ；
(ce)428Glu ；
(cf)429Asp ； (cg)432Phe ；
(ch)434Ser ；
(ci)436Val ；
(cj)438His ；
(ck)439Asp ；
(cl)440Leu ；
(cm)443Thr ；
(cn)444Phe ；
(co)445Glu ；
(cp)456Arg ；
(cq)458Ile ； 或者 461
(cr) Asp。
最优选具有仅一个以上所列的取代的 TM 类似物。
下列位置描述导致至少 75％辅因子活性减小， 但 kcat/Km 基本上少变化的那些修 饰的亚分组 (SEQ ID NO ： 1 或 SEQ ID NO ： 3 给出的氨基酸位置 ) ： 408
(bg) Glu ；
(bi)413Tyr ；
(bj)414Ile ；
(bk)415Leu ；
(bl)416Asp ；
(bm)417Asp ；
(ca)423Asp ；
(cb)424Ile ；
(cc)425Asp ；
(cd)426Glu ；
(cf)429Asp ；
(ck)439Asp ；
(cn)444Phe ； 或者 461
(cr) Asp。
最优选具有仅一个以上所列的取代的 TM 类似物。进一步亚分组可由对于凝血酶 的 KD 被修饰至少 30％的以上修饰造成。
本发明还提供方法。 本文更特别描述有用于筛选呈现对于凝血酶结合的修饰的 Kd 的血栓调节素类似物的方法， 包括下列步骤 ：
(a) 在下列位置制造氨基酸取代 (SEQ ID NO ： 1 或 SEQ ID NO ： 3 给出的氨基酸位 置)：
(bg)408Glu ；
(bi)413Tyr ；
(bj)414Ile ；
(bk)415Leu ；
(bl)416Asp ；
(bm)417Asp ；
(bn)420Ile ；
(ca)423Asp ；
(cb)424Ile ；
(cc)425Asp ；
(cd)426Glu ；
(ce)428Glu ；
(cf)429Asp ；
(cg)432Phe ；
(ch)434Ser ；
(ci)436Val ；
(cj)438His ；
(ck)439Asp ；
(cl)440Leu ；
(cm)443Thr ；
(cn)444Phe ；
(co)445Glu ；
(cp)456Arg ；
(cq)458Ile ；
(cr)461Asp ； 以及
(b) 与对照分子比较对于凝血酶的 KD。
如这些方法中所使用的， 优选具有仅一个氨基酸取代的 TM 类似物。本发明的各种 实施方式包括其中所述 KD 被修饰至少 33％， 或其中所述修饰是氨基酸取代， 或其中所述对照分子是 TMEM388L 的那些。用于方法的优选的修饰分组是 (SEQ ID NO ： 1 或 SEQ ID NO ： 3 给出的氨基酸位置 ) ：
(bg)408Glu ；
(bi)413Tyr ；
(bj)414Ile ；
(bk)415Leu ；
(bl)416Asp ；
(bm)417Asp ；
(ca)423Asp ；
(cb)424Ile ；
(cc)425Asp ；
(cd)426Glu ；
(cf)429Asp ；
(ck)439Asp ；
(cn)444Phe ； 或者 461
(cr) Asp。
如这些方法中所使用的， 优选具有仅一个氨基酸取代的 TM 类似物。
本文描述用于筛选与凝血酶结合时具有修饰的辅因子活性的血栓调节素类似物 的另一方法， 包括下列步骤 ：
(a) 在下列位置制造氨基酸取代 (SEQ ID NO ： 1 或 SEQ ID NO ： 3 给出的氨基酸位 置)：
(aa)349Asp ；
(bb)355Asn ；
(ac)357Glu ；
(ad)358Tyr ；
(ae)359Gln ； 以及
(b) 与凝血酶结合时， 比较辅因子活性的速度和对照分子的速度。
如这些方法中所使用的， 优选具有仅一个氨基酸取代的 TM 类似物。
在本发明的优选的实施方式中， 血栓调节素类似物在第 376 位 (SEQ ID NO ： 1或 SEQ ID NO ： 3) 具有苯丙氨酸残基的修饰。 此残基可通过本领域技术人员熟知的方法化学或 生物化学地修饰或删除。 苯丙氨酸残基优选取代为脂肪族氨基酸， 更优选取代为甘氨酸， 丙 376 氨酸， 缬氨酸， 亮氨酸或异亮氨酸， 以及最优选取代为丙氨酸。展示， Phe 被丙氨酸的取代 (“F376A” ) 基本上降低血栓调节素类似物的辅因子活性而保存 TAFI 活化活性 ( 见图 7)。 结果， F376A-TM 类似物具有增加的 TAFI 活化活性对比辅因子活性的比。
在本发明的进一步实施方式中， 血栓调节素类似物在第 387 位 (SEQ ID NO ： 1或 SEQ ID NO ： 3) 具有谷氨酰胺残基的修饰。谷氨酰胺残基优选取代为下列氨基酸， 以得到的 突变 Gln387X-TM 类似物的降低的辅因子活性顺序排列 ( 见图 8A) ： Met， Thr， Ala， Glu， His， Arg， Ser， Val， Lys， Gly， Ile， Tr， Tyr， Leu， Asn， Phe， Asp， Cys。
在本发明的另一实施方式中， 血栓调节素类似物具有第 388 位 (SEQ ID NO ： 1或SEQ ID NO ： 3) 的甲硫氨酸残基的修饰。甲硫氨酸残基优选取代为下列氨基酸， 以得到的突 变 Met388X-TM 类似物的降低的辅因子活性顺序排列 ( 见图 8B) ： Gln， Tyr， Ile， Phe， His， Arg， Pro， Val， Thr， Ser， Ala， Trp， Asn， Lys， Gly， Glu， Asp， Cys。
在本发明的进一步实施方式中， 血栓调节素类似物在第 389 位 (SEQ ID NO ： 1或 SEQ ID NO ： 3) 具有苯丙氨酸残基的修饰。苯丙氨酸残基优选取代为下列氨基酸， 以得到的 突变 Phe389X-TM 类似物的降低的辅因子活性顺序排列 ( 见图 8C) ： Val， Glu， Thr， Ala， His， Trp， Asp， Gln， Leu， Ile， Asn， Ser， Arg， Lys， Met， Tyr， Gly， Cys， Pro。 387 388
在本发明的另一实施方式中， 由 3 个氨基酸 Gln ， Met 和 Phe389 组成的 TM 的域 间环部分或完全删除或插入一个或更多氨基酸， 优选插入丙氨酸残基 ( 见图 8D)。 376 387 388
对于这些在位置 Phe ， Gln ， Met 或 Phe389 具有修饰的优选的 TM 类似物， TM 类似物可为全长或可溶性 TM 类似物， 包含 EGF 结构域 EGF1 ～ EGF6， 优选包含 EGF 结构域 EGF3 ～ EGF6。在优选的实施方式中， 这些类似物含有 TM 类似物 Solulin 给予的取代。在 更优选的实施方式中， 这些源于 Solulin 的 TM 类似物仅由 EGF1 ～ EGF6 组成， 尤其是仅由 EGF 结构域 EGF3 ～ EGF6 组成。
在本发明的实施方式中， 血栓调节素类似物以其氧化的形式使用。本领域技术人 员已知几种用于蛋白的控制的氧化的技术。TM 类似物优选使用氯胺 T， 过氧化氢或高碘酸 钠氧化。
本发明还涉及有用于筛选用于治疗具有纤溶亢进的凝血病的 TM 类似物的方法。 此方法包括通过一个或更多氨基酸的插入， 缺失或取代修饰血栓调节素的氨基酸序列的第 1 步骤， 优选在 EGF 结构域 EGF1 ～ EGF6 中， 更优选在 EGF 结构域 EGF3 ～ EGF6 中， 及最优选 349 461 氨基酸位置 Asp 和 Asp 之间。对于本领域技术人员， 已知修饰蛋白序列的几种技术， 例 如通过定点诱变或伴随随后选择的随机诱变。
在第 2 步骤中， 就一个或更多选自下列的特征将修饰的 TM 类似物与对照蛋白比 较： 与凝血酶的结合亲和力 (KD 值 )， 辅因子活性， TAFI 活化活性或 TAFIa 势， TAFI 活化活 性和辅因子活性的比， 蛋白氧化的效应， 体外测定中对及时凝块溶解的效应， 或在凝血 - 关 联的动物模型中的效应。
作为对照蛋白， 使用血栓调节素蛋白或类似物， 优选兔肺血栓调节素或包含 6 个 EGF 结构域的人 TM 类似物。TM 类似物可具有天然氨基酸序列或替代性地可具有一个或更 多修饰， 诸如 M388L 取代。
本发明还涉及治疗具有纤溶亢进的凝血病的方法， 包括施用治疗有效量的呈现抗 纤维蛋白溶解效应的血栓调节素类似物。
特别是， 此治疗方法包括相比对照蛋白呈现一个或更多下列特征的 TM 类似物 ： 降 低的与凝血酶的结合亲和力， 具有大于 0.2nM 的 kD 值的与凝血酶的结合亲和力， 显著减小 的辅因子活性， 或增加的 TAFI 活化活性与辅因子活性比。作为对照蛋白， 使用血栓调节素 蛋白或类似物， 优选兔肺血栓调节素或包含 6 个 EGF 结构域的人 TM 类似物。TM 类似物可具 有天然氨基酸序列或替代性地可具有一个或更多修饰， 诸如 M388L 取代。
【定义】
如在本发明的情景中使用， 术语 “抗纤维蛋白溶解效应” 应指相比未添加血栓调节 素类似物的同一测定条件血栓调节素类似物延长凝块溶解时间的能力 ( 如实施例 I 中所述 )。 抗纤维蛋白溶解效应是由于相比其致纤溶活性的 TM 类似物的抗纤维蛋白溶解活性的 流行。
如本文所用， 术语 “致纤溶效应” 应指在体外测定中， 相比未添加血栓调节素类似 物的同一测定条件， 血栓调节素类似物显著减小凝块溶解时间的能力 ( 如实施例 I 中所 述 )。
如本文所用， 术语 “显著减小” 和 “显著延长” 指凝块溶解时间的以 p ＝ 0.1 水平 显著不同于基础值的延长或减小， 和 / 或指超过 10％， 优选 20％， 更优选 30％， 以及最优选 40％， 50％， 60％， 70％， 80％ 100％， 150％或 200％的延长或减小。
如在本发明的情景中使用， 词汇″治疗 (treat)″、″治疗 (treating)″或 “治 疗 (treatment)″指使用本发明的 TM 类似物或包含它们的任何组合物来预防性地阻止出 血事件， 或来缓和， 改善或停止出血事件。 它们包括治愈或治愈以及缓和， 缓解或防止， 除非 另外明确地提及。而且， 如本文所用， 词汇″患者″指哺乳动物， 包括人。
如本文所用， 术语 “具有纤溶亢进的凝血病” 应指作为影响血凝固性的疾病的凝血 病， 其中显著增加的纤溶导致， 恶化或延久出血事件。
如在本发明的情景中使用， 术语 “血栓调节素类似物” 指与膜结合或可溶性血栓调 节素具有相同的特征生物学活性的蛋白和肽。 生物学活性是发挥凝血酶的受体的作用及增 加 TAFI 的活化的能力， 或与天然血栓调节素关联的其他生物学活性。
本文所用的术语 “结合亲和力” 指血栓调节素类似物和凝血酶之间的亲和性的强 度， 及通过解离常数 KD 描述。凝血酶与血栓调节素之间的结合亲和力的 KD 值可通过下列方 法测定 ： 例如平衡方法 ( 例如酶联免疫吸附试验 (ELISA) 或放射免疫测定 (RIA)) 或动力学 ( 例如 BIACORETM 分析 )。结合亲和性优选使用如本发明的实施例 II 中所述的动力学检定 分析。
“KD” 指 TM 类似物和凝血酶之间的相对结合亲和力。高 KD 值代表低结合亲和力。 实施例 II 中提供用于测定 KD 的精确的测定和设施。
如本文所用， 术语 “辅因子活性” 指血栓调节素类似物与凝血酶复合的能力及增强 凝血酶活化蛋白 C 的能力。本发明的实施例 III 中给出用于测量辅因子活性的检定过程。
如本文所用， 术语 “TAFI 活化活性” 指血栓调节素类似物与凝血酶复合的能力及增 强凝血酶活化 TAFI 的能力。本发明的实施例 IV 中给出用于测量 TAFI 活性的检定过程。
″ Km″指米氏常数及以通过测量以不同底物浓度测量的催化的速度的标准方式 推演。其等同于反应速度是其最大值的一半时的底物浓度。本发明的 TM 类似物的 “Km” 通过将凝血酶浓度保持在恒定水平 ( 例如 1nM) 及使用依赖于 KD 的 TM 的饱和度水平 ( 例 如 100nM 或更大 ) 测定。反应使用增加浓度的蛋白 C( 例如， 1 ～ 60μM) 进行。然后使用 Lineweaver-Burke 标绘图或非线性回归分析测定 Km 及 kcat。
″ TME″指由 6 个 EFG 重复子 ( 根据 SEQ ID NO ： 1 或 SEQ ID NO ： 3 的氨基酸 227 ～ 462) 组成的 TM 的类似物。
″ TMEM388L″指由 6 个 EFG 重复子 (aa 227 ～ 462) 组成的 TM 的类似物， 其第 388 位 ( 基于 SEQ ID NO ： 3) 的天然甲硫氨酸被亮氨酸残基取代。
术语 “治疗有效量” 定义为会减小与具有纤溶亢进的凝血病关联的症状， 诸如出血 事件的活性成分的量。 “治疗有效” 也指相比未治疗的病症严重性， 发病频度或持续时间的任何改善。 【实施例】
【实施例 I. 人血浆中的凝块溶解检定】
使用体外凝块溶解模型， 测试了可溶性血栓调节素 (Solulin) 降低或增加正常血 浆和因子 VIII 缺陷血浆的混合物中的凝块溶解时间的能力。
【1. 测试系统】
在血浆组合物之中， 通过混合凝血酶 ( 因子 IIa)， 氯化钙和磷脂酰胆碱 / 磷脂酰丝 氨酸 (PCPS) 囊泡体外起始凝血。用浊度测定， 及使用 “TAFIa 势” 的功能测定测定凝固及纤 溶的时间进程。
【2. 实验过程】
材料。如 Walker 等人 (J.Biol.Chem.1999 ； 274 ： 5201-5212) 中所述制备凝血酶 和纤维蛋白原， 一个例外是 ： 对于纤维蛋白原制备， 通过向水中添加 40％ (w/v)PEG-8000， 随后 β- 丙氨酸沉淀， 代替 2％ PEG-8000 而将溶液制成 1.2％ PEG-8000。此流程变化允许 纤维蛋白原的更大产率。TAFIa 测定中使用的 QSY-FDP( 共价附接到猝灭剂， QSY9C5- 马来 酰亚胺的纤维蛋白降解产物 ) 和 TAFIa 标准物如 (Kimet al.， 2008 ； Anal.Biochem 372 ： 32-40 ； Neill et al.， 2004 ； Anal.Biochem.330 ： 332-341) 所述制备， 和重组人 Pg(S741C) 和荧光素衍生物 (5IAF-Pg) 如 Horrevoets 等人 (J.Biol.Chem 1997 ； 272 ： 2176-2182) 所述 制备。将 S525C- 凝血酶原纯化及用 5- 碘氨基荧光素 (5IAF) 荧光标记， 如之前 Brufatto 等人 (J.Biol.Chem.2001 ； 276 ： 17663-17671) 所述。QSY9C5- 马来酰亚胺和 5- 碘氨基荧 光素购自 Invitrogen Canada Inc.(Burlington， ON， Canada)。纤溶酶购自 Haematologic Technologies Inc.(Essex Junction， VT， USA)， 重组人可溶性血栓调节素 (Solulin ； sTM) 由 Paion Deutschland GmbH(Aachen， 德国 ) 提供。正常人合并的血浆 (NP) 从 Kingston， Ontario， Canada 的 Kingston General Hospital(KGH) 的血库的健康供体得到， FVIII- 缺 陷型血浆 (FVIII-DP) 购自 Affinity Biologicals， Inc.(Hamilton， ON， Canada)。TAFI- 缺 陷型血浆 (TDP) 通过在固定的抗 - 人 TAFI 单克隆抗体的柱上的正常血浆的亲和层析 制 备， 如 Schneider 等 人 (J.Biol.Chem.2002 ； 277 ： 1021-1030) 所 述。 纤 溶 酶 抑 制 剂 D-Val-Phe-Lys 氯甲基酮 (VFKck)， 凝血酶抑制剂 D-Phe-Pro-Arg 氯甲基酮 (PPAck) 和马铃 薯块茎羧肽酶抑制剂 (PTCI) 购自 Calbiochem(San Diego， CA， USA)。组织 - 类型纤溶酶原 活化物 (Activase ； tPA) 购自 KGH 的药房 (Kingston， ON， Canada)。全部其他试剂是分析质 量的。
【3. 方法】
【凝块溶解测定和样品制备以测定 TAFI 活化的程度】
将 FVIII-DP 与 NP 混合， 从而 NP 的最终百分率是 0， 1， 6， 10， 50 或 100％ (0 ～ 100％ NP)。混合之前， 将各血浆稀释成 32 的光密度及添加到等同体积的存在或缺失 20nM 凝血酶 的含有 1.5nM tPA， 40μM PCPS 和 20mM CaCl2 的溶液 ( 终浓度 ： 0.75nM tPA， 20μM PCPS， 10mM CaCl2， ±10nM 凝血酶 )， 将样品分入多个 Eppendorf 管， 及放入 37℃水浴。通过在各 时间点添加 10μM PPAck 和 10μM VFKck 来停止这些管中凝固及溶解， 以分别选择性地抑 制凝血酶和纤溶酶。 将样品剧烈混合， 然后以 16000g( 室温 ) 离心 30s， 和立即放置在冰上，以阻止 TAFIa 的热灭活。将各样品的上清液用 TAFI- 缺陷型血浆连续稀释 5 倍， 并且使用 Kim 等人所述的功能测定测量 TAFIa(Anal.Biochem 2008 ； 372 ： 32-40)。在有盖的， 96- 孔 板中进行同一实验， 和使用 SpectraMax Plus 分光光度计 (Molecular Devices， Sunnyvale， CA， USA) 在 400nm 处经时监控浊度， 以测定凝固及纤溶的时机。在存在或缺失 4 个 tPA 浓 度 (0.25， 0.75， 1.5 和 3nM) 的可溶性血栓调节素 (0 ～ 100nM) 的情况下进行类似实验， 以 测定 sTM 对 TAFI 活化和溶解时间的效应。也在存在 5μM PTCI 下进行这些实验， 以在正常 和 FVIII- 缺陷型血浆中显示溶解的 TAFIa 依赖性延长。
【正常和 FVIII- 缺陷型血浆中凝血酶原活化的时间进程的确定】
向正常和 FVIII- 缺陷型血浆 (0 ～ 100％ NP) 在 10nM 凝血酶存在下补充凝血酶 原衍生物 (5IAF-II ； 300nM 最终 ) 以及 20μM PCPS 和 10mM CaCl2， 以起始凝固。在不透明 的， 塑料 - 覆盖的 96- 孔板中进行这些实验。SpectraMax GeminiXS(Molecular Devices， Sunnyvale， CA， USA) 用于于 37℃， 用分别 495nm 和 535nm 的激发和发射波长， 采用 530nm 发 射截止滤光片经时监控荧光强度。将荧光标准化 (0 ～ 1)， 以反映基线和最大荧光， 将其与 全凝血酶原活化关联。
【TAFIa 势的确定】 在实验过程中， 将 TAFIa 标绘图下的面积选择作为定量 TAFIa 效应的参数。通过 用 Hemker 等人 (Thromb.Haemost.1993 ； 85 ： 5-11) 定义的 “凝血酶势” 模拟将此参数指定为 “TAFIa 势” 。TAFIa 势， 如凝血酶势， 正比于切割的底物量， 及如下数学解析 ：
其中 dS/dt 是底物消耗的速度， S 是底物。 如果 S 是常数 ( 即 S 的限制的消耗 )，对于一些间隔 0 ～ t，意识到， 方程 (4) 中右侧积分是 TAFIa 标绘图下的面积， ( 曲线下面积 )(5) (TAFIa 势 )(6)【4. 结果】
【通过将正常血浆添加到 FVIII- 缺陷型血浆来增加凝块溶解时间】
用 10nM 因子 IIa， 10mM CaCl2 和 20μM PCPS 囊泡起始凝固， 以创建其中凝块结构 不敏感于 FVIII 浓度的模型。 因为无论 FVIII 浓度， 凝块结构类似， 可测定 FVIII 对 tPA- 依 赖性 (0.75nM) 凝块溶解的效应。使用此溶解模型， 溶解时间随着正常血浆的百分率的增加 而增加。图 1 显示 FVIII-DP 用 0 ～ 100％添加的正常血浆的凝块溶解特征， 和溶解时间总结于图 1( 插图 )。在 FVIII-DP 中， 溶解时间是 37min， 且通过添加正常血浆可增加约 50％。
【10％正常血浆足以恢复 FVIII-DP 中的凝块溶解】
以 10％正常血浆， 将与 FVIII-DP 关联的缩短的溶解时间修正到在正常血浆中观 察到的 ( 见图 1， 插图 )。
【50％的 TAFIa 势足以恢复 FVIII-DP 中的凝块溶解】
在正常， FVIII- 缺陷型及混合的血浆中测量 TAFI 活化， 以定量 FVIII 对活化的时 间进程的效应。在凝固的时间进程， 将功能测定用于测量 TAFIa， 及溶解和结果显示于图 2。 当在 FVIII-DP 中将凝血酶， 钙离子和 PCPS 用于起始凝固时， 5min 后测量到约 30pM TAFIa。 随着正常血浆的百分率增加， TAFIa 的峰浓度也增加。尽管溶解时间通过向 FVIII-DP 补充 10％正常血浆来修正， 此不足以完全校正 TAFI 活化。通过计算 TAFIa 时间进程标绘图下面 积 ( 图 2A)， 确定在正常血浆和 50％正常血浆中， 在前 50min 达到大致相同的 TAFIa 势 ( 图 2B)( 分别 16800pM min 及 14100pM min， )， 但与 10％正常血浆混合的 FVIII-DP 血浆具有 仅 50％正常血浆中的 TAFIa 势的 TAFIa 势。
【溶解时间和 TAFIa 势之间有强关联】
为了定量溶解时间和 TAFI 活化之间的关系， 跨 0 ～ 100％ FVIII， 标绘对数溶解时 间对比对数 TAFIa 势 ( 图 2B， 插图 )。如预期， 数据显示在含有 0 ～ 100％ FVIII 的血浆中 溶解时间和 TAFIa 势之间的强阳性关联。图 2A 中的 TAFI 活化谱可通过分析血浆中的凝血 酶原活化来合理化 ( 图 3)， 因为凝血酶是 TAFI 的活化物。一般趋势是， 随着正常血浆的百 分率增加， 凝血酶原活化速度也增加 ( 其可通过检查图 3 中曲线的斜率来测定 )。正常血 浆中有例外发生。在正常血浆中， 凝血酶原活化速度低于与 50％正常血浆混合的 FVIII-DP 中的速度。而正常血浆中的速度更慢， 凝血酶原活化持续与 50％正常血浆混合的 FVIII-DP 中的约两倍。在每个实验中， 凝血酶原活化的时间与 TAFI 活化良好对应。使用钙离子和 PCPS， 正常血浆也凝固， 无需添加的凝血酶。钙 - 诱导的凝固不立即发生 ； 正常血浆中凝块 形成耗时约 15min。此时， 凝血酶原活化进入扩大期， 结果， TAFI 活化。有关凝块形成的 TAFI 活化的程度及时间相同， 无论在存在或缺失添加的凝血酶的情况下起始凝固， 这提示， TAFI 活化是原位产生的凝血酶的结果， 且不是添加凝血酶而诱导凝固。相比凝血酶缺失下 的 14,150pMmin， 在凝血酶的存在下， 有 16,800pM min 的 TAFIa 势。
【可溶性血栓调节素在正常和 FVIII- 缺陷型血浆中延长凝块溶解】
在正常血浆中， 峰 TAFIa 水平和 TAFIa 势， 在 sTM 缺失下， 分别从 600pM 和 16800pM min， 在 10nM sTM 存在下， 增加到分别约 6000pM 和 150,000pM min。此 TAFI 活化的增加导 致溶解时间的 70％增加。 10nM sTM 对 FVIII-DP 中溶解的相对延长的效应类似于正常血浆， 其中当 FVIII-DP 凝固及在 sTM 存在下溶解时溶解延长 65％。在 10nM sTM 存在下， 相比在 sTM 缺失下的 30pM， 在峰 TAFIa 浓度存在 750pM TAFIa。 自凝块起始到凝块溶解时间， TAFIa 势测量为， 相比在 sTM 缺失下的 600pM min， 在 10nM sTM 存在下 12800pMmin。
【正常和 FVIII- 缺陷型血浆中的凝块溶解时间的增加依赖于 tPA 和 sTM 浓度】
跨一系列 tPA 和 sTM 浓度分析 TAFI 活化对溶解时间的效应， 以测定是否 FVIII-DP 中的溶解缺陷可通过刺激 TAFI 活化来修正。图 4 中总结的溶解时间相对于自含有 PTCI 的 类似实验的溶解时间， 所述 PTCI 是 TAFIa 的抑制剂。在 PTCI 存在下， 无有功能的 TAFIa， 从 而图 4 中显示的相对溶解时间代表溶解的 TAFIa- 依赖性延长。 当将 1nM sTM 加入正常血浆时， 以最低浓度的 tPA(0.25nM)， 观察到溶解的最大 TAFIa- 依赖性延长 (2 倍 )。 补充 sTM 的 FVIII-DP 导致溶解时间的剂量 - 依赖性延长 ( 图 4)。 当将 100nM sTM 加入 FVIII-DP 时， 溶 解时间完全校正为见于正常血浆的。随着 tPA 浓度增加， 需要更高浓度的 sTM， 以获得溶解 的最大 TAFIa- 依赖性延长。例如， 当存在 1.5nM tPA( 图 4) 时， 需要 25nM sTM， 以最大化正 常血浆中溶解的 TAFIa 依赖性延长， 和在 FVIII-DP 中需要 100nM sTM。 而且， 随着在这些凝 块溶解实验中 tPA 增加， TAFIa 呈现出对溶解时间具有大得多的效应 ( 相比以 0.25nM tPA 的 2.3 倍， 以 1.5nM tPA 达 5.2 倍 )。呈现， 随着 tPA 浓度增加， 获得任何溶解的 TAFIa- 依 赖性延长需要的 sTM 浓度也增加。以 0.25nM tPA， 不需要 sTM 来获得在正常血浆中溶解的 延长， 然而当将 3nM tPA( 图 4) 加入正常血浆时， 需要 25nMsTM 来获得溶解的延长。为了显 示如何实际溶解时间被 tPA 和 sTM 影响， 抑制的正常和 FVIII- 缺陷型血浆的 TAFIa 中的溶 解时间显示于表 1。
【血栓调节素在正常和 FVIII- 缺陷型血浆中非常基本上促进 TAFI 活化及延长溶 解】
在正常血浆中， TAFI 活化显示为， 相比 sTM 缺失下 ( ○ ； 600pMTAFIa ； 见图 5A)， 在 10nM sTM 存在下 ( ● ； 在其峰水平 6000pMTAFIa) 显著增加。伴随凝块 - 溶解谱揭示， 10nM sTM 的添加导致溶解时间 70％增加。在补充了 10nM sTM 的 FVIII-DP 中， TAFIa 测量为， 相 比在 sTM 缺失下 30pM， 在其峰为 750pM( 见图 5B)。相比缺少 sTM 的 FVIII-DP， TAFI 活化的 增加导致溶解的 60％延长。
【实施例 II. 凝血酶和血栓调节素之间的结合亲和力的分析】
使用荧光动力学检定， 测定表示为 KD 值的凝血酶和血栓调节素类似物之间的结合 的亲和性。
【1. 测试系统】
使用荧光动力学测定来测定凝血酶和血栓调节素类似物之间的结合亲和性及表 示为 KD 值。
【2. 实验过程】
【材料】
如 Bajzar 等 人 所 述 从 血 浆 分 离 人 凝 血 酶 (J.Biol.Chem.1995 ； 270 ： 14477-14484)。 从 PAION Deutschland GmbH(Aachen， 德国 ) 得到重组体可溶性血栓调节素 (Solulin)。全部其他试剂从 Sigma 以分析质量得到。
【方法】
【凝血酶与血栓调节素和 TAFI 的结合的测量】
如平衡结合测定测量凝血酶与血栓调节素的结合。将在 0.02MTris-HCl， 0.15M NaCl， 5.0mM CaCl2， 0.01％ Tween 80， pH7.4 中含有凝血酶 (20nM)， 血栓调节素 (1.54μM)， 及 DAPA(20nM， 丹磺酰精氨酸 N-3-( 乙基 -1， 5- 戊烷二基 ) 酰胺， 荧光， 可反转的凝血酶抑制 剂 ) 的溶液以小连续等分加入缺乏血栓调节素的别的同一溶液。添加在 Perkin-Elmer 模 型 LS50B 荧光分光计的样品隔室中的安装磁搅拌器的比色杯中进行。用分别 280 和 545nm 的激发和发射波长连续记录强度值。将 430nm 截止滤光片用于发射光束。如下分析数据。 荧光强度， I， 推定为是自凝血酶 -DAPA(T·D) 和凝血酶 - 血栓调节素 -DAPA(T·TM·D) 的 强度的和。即， I ＝ i1·[T·D]+i2·[T·TM·D]， 其中 i1 和 i2 是 T·D 和 T·TM·D 的荧光系数 ( 由于激发在在 280nm 处， 自游离的 DAPA 的发射可忽略 )。因为 TM 就蛋白 C 活化或 TAFI 活化不略微改变 Km( 见 Bajzar et al.， 1996 ； J.Biol.Chem.271 ： 16603-16608)， 可推 定， 其不改变凝血酶 -DAPA 相互作用的亲和性。
由此 [T·D] ＝ ([T]+[T·D])/(1+KDAPA/[DAPA])
且 [T·TM·D] ＝ ([T·TM]+[T·TM·D])/(1+KDAPA/[DAPA])，
其中 KDAPA 是凝血酶 -DAPA 相互作用的解离常数。
因此，
I ＝ i1·([T]+[T·D])/(1+KDAPA/[DAPA])+i2([T·TM]+[T·TM·D])/(1+KDAPA/ [DAPA])。
如果 f 和 b 分别被定义为凝血酶的级分， 游离的及结合到血栓调节素的， 及 [T]0 是 凝血酶的总浓度， 则 f ＝ ([T]+[T·D])/[T]0， b ＝ ([T·TM]+[T·TM·D])/[T]0 和 f+b ＝ 1。 则通过 I ＝ i1· f[T]0/(1+KDAPA/[DAPA])+i2· b[T]0/(1+KDAPA/[DAPA]) 给予荧光强度。当未添 加血栓调节素时， 如果 I0 定义为初始强度， 则 f ＝ 1 和 I0 ＝ i1[T]0/(1+KDAPA/[DAPA])。类似 地， 如果 Imax 定义为凝血酶用血栓调节素饱和时的强度， 则 b ＝ 1 和 Imax ＝ i2[T]0/(1+KDAPA/ [DAPA])。由此， I ＝ I0·f+Imax·b。用 1-b 带入 f 则给出 ： I ＝ I0+(Imax-I0)·b 或 ΔI ＝ ΔImax·b。标准化到初始强度给 (ΔI/I0) ＝ (ΔImax/I0)·b。如果 DAPA 以等同亲和性结合 T 和 T·TM， 则 TM 以等同亲和性结合 T 和 T·D。
因此， kTM 定义为凝血酶 - 血栓调节素相互作用的解离常数， [T][TM] ＝ KTM[T· TM] ； [T·D][TM] ＝ KTM[T·TM·D] ； 及 ([T]+[T·D])·[TM] ＝ KTM([T·TM]+[T·TM·D])。最后 表达式等于 f·[TM] ＝ KTM·b。由于 f ＝ 1-b 和 [TM] ＝ [TM]0-b·[T]0， 其中 [TM]0 是总和 血栓调节素浓度， 得到下列方程 ： (1-b)([TM]0-b·[T]0) ＝ KTM·b。此是 b 的二次方程， 当 对其求解及代入以上 (ΔI/I0) 的表达式， 给出方程 ： (ΔI/I0) ＝ (ΔImax/I0)· 0.5· (KTM+[T] 2 1/2 [T]0· [TM]0) )。 此后来的方程表达荧光强度值， 血栓调节素 0+[TM]0-((KTM+[T]0+[TM]0) -4· 及凝血酶的标称浓度， 凝血酶 - 血栓调节素相互作用的解离常数， 及表征血栓调节素与凝 血酶 -DAPA 的相互作用的荧光强度增量之间的关系。将强度数据以 [TM]0 作为自变量和 KTM 及 ΔImax 作为最佳 - 拟合参数通过非线性回归分析拟合到以上方程。
【3. 结果】
【凝血酶以 KD ＝ 23±14nM 的亲和性结合可溶性血栓调节素】
通过 DAPA 的荧光扰动测量凝血酶与可溶性血栓调节素的结合。如图 6 所示， 滴定 曲线显示相对荧光的 0 和 75nM 之间的可溶性血栓调节素浓度范围的增加。数据分析显示， 与可溶性血栓调节素结合的凝血酶特征在于 KD ＝ 23±14nM。
【实施例 III. 突变的血栓调节素类似物的辅因子活性的分析】
使用荧光动力学检定来测定表示为 KD 值的凝血酶和血栓调节素类似物之间的结 合的亲和性。
【1. 实验过程】
【材料和方法】
在 shockate 中直接测定 TM 突变体发挥蛋白 C 的凝血酶 - 介导的活化的辅因子的 作用的能力。重组人蛋白 C 来自 Dr.John McPherson， Genzyme Corp.， Framingham， MA.， 及 如 (BioTechnology 1990 ； 8： 655-661) 所述纯化。 将 25μl 的各 shockate 在微孔板中与等同体积的重组人蛋白 C(0.3μM 的终浓度 ) 和 1nM 终浓度的人 α 凝血酶 (SigmaChemicals， St.Louis， MO) 混合。将使用的全部试剂稀释于 20mM 含有 5mg/ml 牛血清白蛋白的 Tris， pH7.4/100mM NaCl/3.75mMCaCl2/0.1％ NaN3(w/V)。将混合物于 37℃温育 1 小时， 和通过添 加 25μl 的 800U/ml 的水蛭素 (Sigma Chemicals， St.Louis， MO) 来终结反应。通过添加 100μl 的发色底物 D- 缬氨酰 -L- 亮氨酰 -L- 精氨酸 -p- 硝基酰苯胺 (S-2266)(1mM) 来测 定活化的蛋白 C 的量。通过使用平板读数仪在 405nm 处的吸光度测量随时间的变化。数据 记录为 milliOD 单元 /min 及通过使用 Molecular Devices 平板读数仪每 10s 测量吸光度持 续 15 分钟来对各样品测定。全部测定含有三重 shockate 样品， 各 DH5α 细胞用 pSELECT-1 载体 ( 无 TM)， pTHR211( 野生型 ) 或 pMJM57( 在 388 位甲硫氨酸改变为亮氨酸的 pTHR211) 转染， 作为内部对照。TM 突变体的辅因子活性表示为对 pMJM57 获得的活性的平均值。
【统计学分析】
测定各突变体活性至少两次 ( 仅分离 2 个阳性克隆的那些突变体是 3 次 )， 及全部 数据使用 Student 氏 t 检验包括在差异的显著性的确定中。板之间的差异系数是 16.7％ (n ＝ 18)。
【蛋白印迹分析】
在 10％ Tris-tricine SDS PAGE 中， 在还原的条件下， 根据制造商的说明书 (Novex Inc.， San Diego， CA) 运行大肠埃希氏菌 (E.coli)shockate。通过将在含有 10mM 二硫苏糖 醇的样品缓冲液 (62.5mMTris， pH6.8， 2％ SDS， 10％甘油， 0.0025％溴酚蓝 ) 中的 shockate 煮沸 10 分钟来制备还原的及烷基化的样品， 然后是与 50mM 碘乙酰胺温育。
将蛋白转移到 4 ℃的转移缓冲液 (192mM 甘氨酸， 25mM Tris， pH8.3， 20 ％甲醇 ) 中的硝酸纤维素滤膜。将硝酸纤维素滤膜用阻断缓冲液 (10mM Tris， pH7.5， 0.9％ NaCl， 0.05％ NaN3 中 1％牛血清白蛋白 ) 阻断， 然后在阻断缓冲液中与小鼠多克隆抗血清 ( 针对 人血栓调节素的还原的及烷基化的 EGF 结构域产生 ) 温育。用洗涤缓冲液 (10mM Tris， pH7.5， 0.9％ NaCl， 0.05％ NaN3， 0.05％ Tween 20) 洗涤之后， 将滤膜在含有 0.05％ Tween 20 的阻断缓冲液中与生物素化的山羊抗 - 小鼠 IgG 抗体温育。使用 Vectastain ABC 溶 液 (VectorLaboratories， Burlingame， CA) 和 ECL 检 测 系 统 (AmershamCorporation， Arlington Heights， IL) 根据制造商的说明书检测蛋白。
【实施例 IV. 对于 TAFI 和蛋白 C 活化的血栓调节素类似物的分析】
使用荧光动力学检定来测定表示为 KD 值的凝血酶和血栓调节素类似物之间的结 合的亲和性。
【1. 实验过程】
【蛋白和试剂】
如 Parkinson 等 人 所 述 制 备 包 含 Solulin( 残 基 4-490)， TME( 残 基 227-462)， TMEc- 环 3-6( 残 基 333-462)， 及 TMEi4-6( 残 基 345-362) 的 截 短 的 形 式 的 血 栓 调 节 素 (Biochem.Biophys.Res.Commun.1992 ； 185 ： 567-576)。将 Sf9 细胞用 TM 构建体转染， 及将 蛋白通过利用阴离子交换， 凝胶过滤和凝血酶亲和性的层析过程的组合从培养基分离。通 过 SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染色评定的纯度是 95％或更大。如 Bajzar 等人所述分 离人血浆 TAFI(J.Biol.Chem.1995 ； 270 ： 14477-14484)。如 Bajzar 和 Nesheim 所述制备人 蛋白 C 和凝血酶 (J.Biol.Chem.1993 ； 268 ： 8608-8616)。如 Nesheim 等人所述合成凝血酶抑制剂丹磺酰精氨酸 N-(3- 乙基 -1， 5- 戊烷二基 ) 酰胺 (DAPA)(Biochemistry 1979 ； 18 ： 996-1003)。从 TMEM388L 构建体产生由丙氨酸扫描所致的点突变体。将蛋白在大肠埃希氏 菌 (Escherichia coli) 表达。周质提取物的过程和制备如 Nagashima 等人所述 (J.Biol. Chem.1993 ； 268 ： 8608-8616)。HEPES， 碱性羧肽酶底物马尿酰 - 精氨酸， 氰尿酰氯， 及 1， 4- 二噁烷从 Sigma 得到。全部其他试剂是分析质量的。
【用血栓调节素类似物的点突变体的蛋白 C 和 TAFI 活化速度的测量】
对于 TAFI 的活化， 将 20μl 等份的各周质提取物与凝血酶 (13nM 最终 ) 在 20mM HEPES， pH7.5， 150mM NaCl， 5mM CaCl2 中于室温预温育 5min。然后将混合物与纯化的重组 TAFI(18nM 最终 ) 和底物， 马尿酰 - 精氨酸 (1.0mM 最终 ) 以 60μl 的总体积温育 60min。通 过测量马尿酰 - 精氨酸向马尿酸的水解， 然后是用 80μl 的磷酸盐缓冲液 (0.2M， pH8.3) 和 在二噁烷 (w/v) 中的 60μl 的 3％氰尿酸将马尿酸转变为色原， 从而定量活化的 TAFI 的量。 充分混合之后， 在 382nm 处测量澄清的上清液的吸光度。对于各突变体， 通过减去凝血酶缺 失下产生的背景吸光度来计算 TAFI 的凝血酶 - 依赖性活化的量。蛋白 C 被 TMEM388L- 丙 氨酸突变体的活化测定如下。
将全部样品和试剂稀释于 APC 检定稀释剂 (20mM Tris-HCl， pH7.4， 100mM NaCl， 2.5mM CaCl2， 0.5％ BSA)。将样品和 TM 标准物 (0 ～ 1nM) 以 60μl 总体积于 37℃在 96- 孔 板中与 0.5μM 蛋白 C 和 1nM 凝血酶温育 60min， 以产生 APC， 然后用 20μl 的水蛭素 (0.16U/ μl， 570nM) 淬 灭。 通 过 以 1min 间 隔 在 405nm 处 使 用 平 板 读 数 仪 (Molecular Devices Corp.， Menlo Park， CA) 监控 S-2266(100μl 的 1mM) 的水解来测定形成的 APC 的量。1U 的 活性产生 1pmol 的活化的蛋白 C/min(37℃ )。
全部测定含有用 pSelect-1 载体 ( 无 TME) 转染的 DH5α 细胞的提取物， 野生型 TME(M388) 或 TME(M388L) 作为内部对照。TME(M388L) 丙氨酸突变体的辅因子活性表达为 TME(M388L) 的活性的百分率。使用提取物的 3 个独立制备物以一式两份测定各 TM 突变体 的蛋白 C 和 TAFI 活化。
【2. 结果】
用 TM 突变体获得的结果 ( 图 7) 表明， 8 个突变体中的 5 个具有基本上减小的辅因 子活化。从这 5 个突变体， 4 个突变体也显示 TAFI 的相伴的减小的活化活性。仅在 F376A 的突变导致蛋白 C 活化的深刻的损失， 但仅在 TAFI 活化中适度减小。有趣地， 对于 TAFI 和 376 蛋白 C 活化的 Phe 的重要性的差异提示， 当蛋白 C 是凝血酶 - 血栓调节素复合物的底物 时， 对血栓调节素结构的需求更受约束。
【实施例 V. 就氧化的蛋白 C 活化的 Met- 特异性 TM 突变体的分析】
使用血栓调节素类似物的特定甲硫氨酸突变体， 还就蛋白氧化使用蛋白 C 活化测 定分析对于辅因子活化的这些残基的作用。
【1. 实验过程】
【蛋白和试剂】
人 重 组 蛋 白 C 来 自 Genzyme Corp.(Boston， MA)。 牛 凝 血 酶 来 自 Miles Laboratories Inc.(Dallas， TX)。D-Val-Leu-L-Arg-p- 硝基酰苯胺如 Glaser 等人所述制 备 (Prep.Biochem.11975 ； 5： 333-348)。 人 α- 凝血酶 (4,000NIH U/mg)， 牛血清白蛋白 ( 级 分 V) 和氯胺 T 来自 Sigma Chemical Co.(St.Louis， MO)。全部过程于 4℃进行。将编码 TM 的 6 个 EGF- 样重复子 ( 氨基酸 227-462) 的 DNA 序列连接到昆虫蛋白酶的信号序列， 皮下素 (hypodermin)A 和杂交体基因在杆状病毒穿梭 载体 pTMHY101 中放置在多角体基因启动子控制下。使用标准技术产生重组病毒。通过使 用诱变物定点诱变试剂盒 (Stratagene， Inc.， La Jolla， CA) 制备描述的突变类似物， 和制 备病毒， 用于通过相同的方法在杆状病毒系统中表达。
【用氯胺 T 的纯化和氧化】
通过离心澄清含有 TME(Sf9) 的分泌的突变体的生长培养基， 冷冻干燥及再溶解 于 1 ∶ 10 体积的 0.2％ NEM-Ac， pH7 和 0.008％ Tween 80。用 5μl 的 H2O 或 5μl 的 100mM 氯胺 T 处理等份 ； 于室温温育 20min ； 通过稀释去除氧化剂 ； 在 NAP-5 柱 (20mM Tris-HCl， 0.1MNaCl， 2.5mM CaCl2， 5mg/ml BSA， pH7.4 ； Pharmacia Inc.) 上脱盐 ； 及如下检定蛋白 C 的 活化。
【TM 辅因子活性的测量 (APC 测定 )】
将全部样品和试剂稀释于 APC 检定稀释剂 (20mM Tris-HCl， pH7.4， 100mM NaCl， 2.5mM CaCl2， 0.5％ BSA)。 将样品和 TM 标准物 (0 ～ 1nM) 以 60μl 总体积于 37℃在 96- 孔板 中与 0.5μM 蛋白 C 和 1nM 凝血酶温育 60min， 产生 APC， 然后用 20μl 的水蛭素 (0.16U/μl， 570nM) 淬灭。通过以 1min 间隔在 405nm 处使用平板读数仪 (Molecular Devices Corp.， Menlo Park， CA) 监控 S-2266(100μl 的 1mM) 的水解测定形成的 APC 的量。1U 的活性产生 1pmol 的活化的蛋白 C/min(37℃ )。
【2. 结果】
【通过 Met388 的氧化的 TM 的减小的辅因子活性】
在昆虫细胞中表达突变体和野生型 TME(Sf9)， 用氯胺 T 处理， 检定辅因子活性和 比较结果 ( 表 2)。 当将 TME 用氧化剂诸如氯胺 T 处理时， 其缓和约 85％的其辅因子活性 ( 见 291 388 表 2)。Met 和 Met 的定点突变展示， TME(Sf9) 的灭活是由于单甲硫氨酸的氧化。将保 388 留 Met 的衍生物通过氯胺 T 灭活到类似程度 ( ＞ 80％ )， 然而 Met388Leu 突变体是抗性 291 的。Met 被取代的突变活跃的， 但对氧化灭活不是抗性的。
【实施例 VI. 具有 EGF4 和 EGF5 之间的域间环的突变 (Gln387， Met388， Phe389) 的 TM 类似物的分析】
对于血栓调节素类似物的单特异性突变体， 使用蛋白 C 活化测定分析这些残基和 它们的氧化的作用。
【1. 实验过程】
质粒构建 . 仅由 EGF- 样结构域 (TME) 组成的血栓调节素片段如下在大肠杆菌 (E.coli) 中表达， 通过聚合酶链反应从人基因组 DNA， 使用引物
5‘-CCGGGATCCTCAACAGTCGGTGCCAATGTGGCG-3’ 和
5‘-CCGGGATCCTGCAGCGTGGAGAACGGCGGCTGC-3’得 到 编 码 全 长 TM 的 TME( 残 基 227-462) 的 DNA 片段。此片段在 pKT279 中放置在 β- 内酰胺酶启动子和信号测序控制下。 然后将得到的质粒的 EcoRV-BglII 片段和含有 f1 复制原点的 pGEM3zf 的 ScaI-SacI 片段 分别在 EcoRV-BamHI 和 ScaI-SacI 位点插 pSelect-1 载体， 以构建大肠杆菌 (E.coli) 表 达质粒 pTHR211。使用在 vitor 诱变试剂盒中改变的位点中描述的定点诱变过程， 用单链
pTHR211DNA 模板构建编码在第 387， 388 或 389 位突变的 TM 突变体的质粒。通过限制性分 析确认定点突变的各引物。
为了测量突变体的辅因子活性， 将表达突变蛋白的个体大肠杆菌 (E.coli) 培养 物离心， 洗涤的， 及将细胞沉淀在 20％蔗糖， 300mMTris-HCl， pH8.0， 1mM EDTA， 0.5mM MgCl2 中温育 (10min， 4℃ )。通过用 0.5mM MgCl2 处理的细胞沉淀的离心制备 shockate(10min， 4℃ )， 及在 APC 测定中检定。数据是产生自各 3 个独立克隆的平均。
【TM 辅因子活性的测量 (APC 测定 )】
将全部样品和试剂稀释于 APC 检定稀释剂 (20mM Tris-HCl， pH7.4， 100mM NaCl， 2.5mM CaCl2， 0.5％ BSA)。将样品和 TM 标准物 (0 ～ 1nM) 以 60μl 总体积于 37℃在 96- 孔 板中与 0.5μM 蛋白 C 和 1nM 凝血酶温育 60min， 以产生 APC， 然后用 20μl 的水蛭素 (0.16U/ μl， 570nM) 淬 灭。 通 过 以 1min 间 隔 在 405nm 处 使 用 平 板 读 数 仪 (Molecular Devices Corp.， Menlo Park， CA) 监控 S-2266(100μl 的 1mM) 的水解来测定形成的 APC 的量。1U 的 活性产生 1pmol 的活化的蛋白 C/min(37℃ )。
【2. 结果】
【通过环间结构域的突变的 TM 的减小的辅因子活性】
使用定点诱变， 表达在第 387， 388 或 389 位具有改变的氨基酸， 缺失或插入的 TM 突变体 ( 图 8)。TM 突变体的辅因子活性是从 3 个独立克隆获得的平均值， 及表达为对于 TME(Sf9)WT 发现的活性的百分率。 使用针对 TM 的多克隆抗体， 对在第 388 位的全部新突变 体及对在第 387 位的选择的突变体进行对于蛋白印迹的凝胶扫描。这些扫描给大致相当的 量的 TM， 表明表达差异不可解释观察的活性差异。此外， 在第 387 位 ( 图 8A)， 388( 图 8B)， 389( 图 8C) 的独立取代， 或结构域间环内任何处的插入和缺失 ( 图 8D) 产生通常是在 APC 测定中相比野生型 TME 更差的辅因子的类似物。 Gln387 被 Thr， Met 或 Ala 取代的类似物保留 ＞ 70％辅因子活性， 但用 Glu 取代将此减小到对照的 58％， 及全部其他氨基酸导致＞ 50％ 388 损失。仅 Met 用 Leu 的取代导致相比野生型基本上更高辅因子活性 (1.8 倍 )。Met388 除 了 Gln 和 Tyr 之外的全部其他取代导致辅因子活性的＞ 50％损失。TM 辅因子活性欠敏感 于 Phe389 的氨基酸取代， 和此位置的点突变中的 9 种保留见于对照的＞ 70％的活性。在任 何位置的 Pro 或 Cys 取代减小活性至＞ 10％， 除了 Met388Pro 之外， 其保留 30％活性。通 过删除个体氨基酸或将 Ala 插入各 4 个可能的位置改变 EGF4 和 EGF5 之间的域间环的长度 导致具有小于野生型 TME 的 10％的活性的突变体。 【附图说明】
图1： 因子 VIII 缺陷血浆 (FVIII-DP)， 正常血浆 (NP) 和与 NP 混合的 FVIII-DP 的 凝块 - 溶解特征和溶解时间。凝块溶解特征显示为 0(-)， 1(· · · · )， 6(---)， 10(-· · -· · -)， 50(---) 和 100％ (-· -· -)NP。从凝块 - 溶解特征， 通过取凝块降解到其最高光密度的 1/2 的时间来测定溶解时间。在插图中， 总结了溶解时间， 一般趋势是溶解时间增加， 随着 NP 的 百分率 ( 及因而 FVIII 的量 ) 增加。添加 NP 对溶解时间的效应达到 10％ NP 的平台期。
图2： 含有各种百分率的 FVIII 的血浆中凝血酶可活化的纤溶抑制剂 (TAFI) 活 化： (A) 当将 FVIII- 缺陷型血浆 (FVIII-DP) 与正常血浆 (NP) 混合时， TAFI 活化增强。在 FVIII-DP 中， 相比在 50 ％ NP( □ ) 和 100 ％ NP( △ ) 中～ 600pM TAFIa， 仅在其峰测量到30pMTAFIa( ● )。这些实验以一式三份进行， 和数据代表平均值 ±SE。TAFIa 势 (B)， 在此 定义为在活化标绘图 (A) 自凝块起始时间到最后时间点的时间进程下面积， 随着 NP 的百分 率增加而增加到 50％ NP 的平台期。50％ NP 和 100％ NP 的 TAFIa 势类似 ( 分别 14,100pM min 及 16,800pM min， )， 尽管它们的相应 TAFI 活化标绘图的形状相当地不同。使用对数溶 解时间对比对数 TAFIa 势的标绘图显示溶解时间 ( 图 1， 插图 ) 及 TAFIa 势之间的关系， 如 其有关 FVIII 水平 ( 图 2B， 插图 )。如预期， 数据显示， 在含有 0 ～ 100％ FVIII 的血浆中溶 解时间和 TAFIa 势之间的强阳性关联。
图3： 对于与 0( ● )， 1( ■ )， 6( ▲ )， 10( ○ )， 50( □ ) 和 100％ NP( △ ) 混合的 FVIIIDP 显示含有各种百分率的 FVIII 的血浆中的凝血酶原活化。凝血酶原活化的时间进 程。一般而言， 凝血酶原活化速度随着 NP 的百分率增加而增加。以 50％ NP， 以高速发生凝 血酶原活化 ( 如通过检查各标绘图的斜率测定 ) 及呈现为在 15min 内， 然而 100％ NP 具有 在更长时期的更慢凝血酶原活化的速度。
图4： 在 正 常 血 浆 (NP) 和 因 子 VIII 缺 陷 血 浆 (FVIII-DP) 中， 以各种浓度的 sTM(0 ～ 100nM) 和 tPA(0.25 ～ 3nM)， sTM 对凝血酶可活化的纤溶抑制剂 (TAFI) 活化的效 应。FVIII-DP 中的延长溶解中的 TAFIa- 依赖性缺陷通过将 100nM sTM 添加到含有 0.25nM tPA 的血浆中来修正。随着 tPA 的浓度增加， 在 100nM sTM 存在下观察到 FVIII-DP 中溶解 缺陷的仅部分修正。在这些实验中， 马铃薯块茎羧肽酶抑制剂 (PTCI) 用于创建无有功能的 TAFIa 的条件。因此， 如以溶解时间 / 溶解时间 +PTCI 比显示的任何溶解的增加是 TAFIa 依 赖性的。
图5： 在正常血浆 (NP)(A) 和 FVIII- 缺陷型血浆 (FVIII-DP)(B) 中， 在 10nM 血栓 调节素 ( ● ) 存在下或无血栓调节素 ( ○ ) 的情况下， TAFI 活化和凝块溶解表征。(-) 显 示伴随凝块 - 溶解特征， 和对于无 sTM 的凝块溶解特征显示作为参照 (---)。 这些实验以一 式三份进行， 和数据代表平均值 ±SE。
图6： 与血栓调节素结合的凝血酶。通过滴定由在 20mM Tris·HCl， 150mM NaCl， 2+ 5.0mM Ca ， 0.01 ％ Tween 80 中的凝血酶 (20nM) 和 DAPA(20nM) 和在同一溶液中含有的 1.54μM 血栓调节素组成的 1.5ml 的溶液来测定凝血酶与血栓调节素的结合。荧光强度测 量 (λex ＝ 280nm， λem ＝ 545nm)。
图7： TAFI 和蛋白 C 活化中的点突变的相对辅因子活性。将丙氨酸 - 扫描诱变用 于在可溶性血栓调节素中制备点突变。对于 TAFI( 实心条 ) 和蛋白 C( 斜线纹条 ) 显示蛋 白 C 和 TAFI 活化速度 ( 相对于用突变 TMEM388L 的活化速度 )。
图8： EGF4 和 EGF5 之间的域间环的突变。在大肠杆菌 (E.coli) 中， 对于各突变体 构建 3 种独立质粒。 制备 shockate， 通过 APC 测定检定辅因子活性， 及在蛋白印迹上分析样 品 ( 不显示的 )。活性值是自 3 个分离克隆的平均。小图 A， 在 Gln387 的取代突变 ； 小图 B， 在 Met386 的取代 ； 小图 C， 在 Phe389 的取代突变 ； 小图 D， 域间环内的缺失和丙氨酸插入。 显 示测量来自用缺少 TM 插入子的对照质粒， pSelect 转染的大肠杆菌 (E.coli) 的 shockate 的活性。对于额外的细节见 Clarke 等人 (J.Biol.Chem.1993 ； 268 ： 6309-6315)。
图9 ： 血栓调节素的促 - 及抗纤维蛋白溶解效应的示意性模式图 ( 根据 Mosnier 和 Bouma 修饰的， Arterioscler.Thomb.Vasc.Biol.2006 ； 26 ： 2445-2453)。以低 TM 浓度凝块 溶解时间的增加可归因于 TAFI 活化的刺激， 及例证 TM 的抗纤维蛋白溶解活性。以更高浓度的兔肺 TM， 凝块溶解时间降低， 因为蛋白 C 的活化和 TAFI 活化的抑制 ； 例证兔肺 TM 的致 纤溶活性 ( 实线 )。注意， 兔肺 TM 的 15nM 以上的致纤溶活性超过抗纤维蛋白溶解活性， 导 致总体致纤溶效应。相反， 可溶性 TM 类似物显示仅抗纤维蛋白溶解效应 ( 虚线 )。
【附表说明】
表1： 数据的总结用于构建图 4， 包括 PTCI 存在下的绝对溶解时间， 以致使在各条 件下确定溶解时间。在全部情况中， 溶解时间相对于在 TAFIa 抑制剂， PTCI 存在下获得的 时间表示。TAFI， 凝血酶可活化的纤溶抑制剂 ； PTCI， 马铃薯块茎羧肽酶抑制剂。
表2： TME(Sf9) 的定点突变类似物的氯胺 T 氧化
氯胺 T 处理之后的结果表示为治疗之后活性对照的百分率。＊一式两份确定的平 均值和自平均值的偏差。32CN 102481344 A
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