一种黄芪甲苷的用途.pdf

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1、(10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201310002150.1 (22)申请日 2013.01.04 A61K 31/7048(2006.01) A61P 25/28(2006.01) (73)专利权人 上海中医药大学 地址 201203 上海市浦东新区张江高科技园 区蔡伦路 1200 号 (72)发明人 吴晓俊 王峥涛 胡之璧 贺一新 高艳 (74)专利代理机构 上海海颂知识产权代理事务 所 ( 普通合伙 ) 31258 代理人 何葆芳 (54) 发明名称 一种黄芪甲苷的用途 (57) 摘要 本发明公开了一种黄芪甲苷的新用途， 所述 用途是指以黄芪甲苷作为活性成分用于制。

2、备预防 或者治疗多发性硬化症的药物制剂。因实验结果 表明， 黄芪甲苷可以显著降低 EAE 小鼠的发病， 脱 髓鞘以及炎症反应。 因此， 以黄芪甲苷作为活性成 分可望开发成预防或者治疗多发性硬化症的药物 制剂。 (51)Int.Cl. 审查员 崔传明 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书1页 说明书4页 附图2页 CN 103908462 B 2016.05.04 CN 103908462 B 1.一种黄芪甲苷的用途， 其特征在于： 以黄芪甲苷作为唯一活性成分用于制备预防或 者治疗多发性硬化症的药物制剂。 2.根据权利要求1所述的用途， 其特征在于： 所述黄芪甲苷的。

3、纯度 50。 3.根据权利要求2所述的用途， 其特征在于： 所述黄芪甲苷的纯度 90。 4.根据权利要求3所述的用途， 其特征在于： 所述黄芪甲苷的纯度 98。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 103908462 B 2 一种黄芪甲苷的用途 技术领域 0001 本发明涉及黄芪甲苷的一种新用途， 具体说， 是涉及黄芪甲苷用于制备预防或者 治疗多发性硬化症的药物制剂的用途。 背景技术 0002 多发性硬化症 （multiple sclerosis,MS） 是一种慢性自身免疫神经退行性疾病。 通常认为MS是由于炎症反应， 造成渐行性脱髓鞘， 激发了周边免疫系统中淋巴细胞的某些 亚群(CD4。

4、+,CD8+)， 进入中枢神经系统， 接受了抗原呈递细胞如小胶质细胞呈递的抗原， 诱 导了炎症反应， 进而影响神经电信号转导， 影响了神经正常功能。 0003 流行病学研究表明， 世界范围内大约有3百万的多发性硬化症患者， 大多数患者的 发病年龄比较年青化， 介于20-40岁， 少数患者在12岁的时候就发病， 也有一些患者在50多 岁的时候才发病。 此病具有性别差异， 女性发病率高于男性。 在中国， 协和医院于1926年报 道了首例MS病例， 但由于国内对MS没有全国范围的监控和调查， 相关流行病学报道比较少。 通常来说， 中国病人的平均发病年龄是30岁， 而少数低于20岁。 0004 引发多。

5、发性硬化症的具体病因尚不明确， 遗传、 病毒侵入、 地理位置甚至饮食等皆 有可能。 该病具有反复发作 （RRMS） 以及逐步恶化(SPMS)的一些类型， 使患者运动、 感觉、 视 觉下降， 性功能下降， 认知能力下降， 情绪抑郁， 甚至引发癫痫， 瘫痪， 严重影响了患者的生 活质量。 此疾病的恶性程度堪比神经肿瘤， 因而每年的5月最后一个星期三被设为世界多发 性硬化症日。 0005 目前国外临床治疗主要采用免疫调节剂如IFN-1a( Avonex ),IFN-1b (Betaseron)， Glatiramer acetate(Copaxone)和mitoxantrone； 或者应用免疫抑制剂。

6、如 azathioprine,cyclophosphamide,静脉注射免疫球蛋白， 其它较新型的治疗应用estriol, statins,或者natalizumab。 0006 在国内， 对MS的治疗多采用皮质激素类药物。 对于仅表现出脊髓损伤的患者， 文献 报导临床使用大剂量甲基强的松龙 （methylprednisolone,1g/d） 冲剂治疗3-5天或者地塞 米松 （dexamethasone,15-20mg/d） 治疗10天后逐渐减量， 同时给予人免疫球蛋白 （0.4g/kg/ d） 5天， 随后进行第二个疗程。 总共进行2-3个疗程， 对发病和复发有显著的疗效。 0007 总体来。

7、说临床对MS的治疗主要是免疫干预和炎症抑制， 通过调节Th1/Th2,Th17等 T细胞亚型的分化， 降低免疫反应的强度， 抑制中枢和周围神经系统炎症反应， 从而实现对 疾病的控制。 这类药物可以减少疾病发作频率和降低疾病的影响， 但常常伴随着显著的副 作用， 如发热、 疲劳、 虚弱、 肌肉疼痛和注射部位的炎症反应。 目前尚无对MS的特效疗法。 0008 黄芪甲苷 （AstragalosideIV， CAS号为84687-43-4） 是从黄芪中分离出的活性单体 成分， 研究表明： 黄芪甲苷有降压消炎、 镇静镇痛、 促进自然杀伤细胞活性及抗肝损伤作用， 经静脉给药 （2mg/kg） 后20min。

8、， 在大鼠脑中可以检测到黄芪甲苷的存在， 表明黄芪甲苷可以 通过血脑屏障到达脑实质发挥作用； 黄芪甲苷可以促进大鼠皮层原代细胞的存活和轴突的 生长； 黄芪甲苷具有神经保护作用， 可以减少原代多巴胺能黑质神经细胞经羟多巴胺诱导 说 明 书 1/4 页 3 CN 103908462 B 3 的神经凋亡； 黄芪甲苷也可以延缓氢化可的松诱导的大鼠的衰老， 同时通过降低Ca2+的释 放和抑制海马神经元细胞的凋亡而减少大鼠记忆的损伤。 但到目前为止， 黄芪甲苷是否具 有治疗多发性硬化症的作用未见任何相关报道。 发明内容 0009 本发明的目的是提供一种黄芪甲苷的新用途， 以充分发挥黄芪甲苷在临床中的药 用。

9、价值。 0010 本发明所述的黄芪甲苷的一种新用途， 是指以黄芪甲苷作为活性成分用于制备预 防或者治疗多发性硬化症的药物制剂。 0011 上述的黄芪甲苷的纯度推荐 50%， 以 90%较佳， 以 98%最佳。 0012 上述的药物制剂可以是任何可药用的剂型， 包括： 片剂、 糖衣片剂、 薄膜衣片剂、 肠 溶衣片剂、 胶囊剂、 硬胶囊剂、 软胶囊剂、 口服液、 口含剂、 颗粒剂、 冲剂、 丸剂、 散剂、 膏剂、 丹 剂、 混悬剂、 粉剂、 溶液剂、 注射剂、 栓剂、 软膏剂、 硬膏剂、 霜剂、 喷雾剂、 滴剂、 贴剂等； 优选 口服剂型， 如： 胶囊剂、 片剂、 口服液、 颗粒剂、 丸剂、 散剂。

10、、 丹剂、 膏剂等。 所述的口服剂型可 含有常用的赋形剂， 诸如粘合剂、 填充剂、 稀释剂、 压片剂、 润滑剂、 崩解剂、 着色剂、 调味剂 和湿润剂， 必要时可对片剂进行包衣。 适宜的填充剂包括纤维素、 甘露糖醇、 乳糖和其它类 似的填充剂； 适宜的崩解剂包括淀粉、 聚乙烯吡咯烷酮和淀粉衍生物， 例如羟基乙酸淀粉 钠； 适宜的润滑剂包括， 例如硬脂酸镁； 适宜的药物可接受的湿润剂包括十二烷基硫酸钠。 0013 实验结果表明， 黄芪甲苷可以显著降低EAE小鼠的发病， 脱髓鞘以及炎症反应。 因 此， 以黄芪甲苷作为活性成分可望开发成预防或者治疗多发性硬化症的药物制剂。 附图说明 0014 图1体。

11、现了黄芪甲苷对EAE小鼠的疾病进程的影响， 图中： A表示模型对照组， B表示 阳性对照组， C表示用药组； 0015 图2体现了黄芪甲苷对EAE小鼠的体重的影响， 图中： a表示正常对照组， b表示模型 对照组， c表示用药组； 0016 图3体现了黄芪甲苷对EAE小鼠中枢神经系统脱髓鞘以及炎症作用的影响， 图中： LFB表示染色； GFAP表示神经胶质酸性蛋白； Iba I表示离子钙接头蛋白分子-1； 0017 图4体现了黄芪甲苷对EAE小鼠中枢神经系统炎症因子表达的影响， 图中： a表示正 常对照组， b表示模型对照组， c表示用药组。 0018 注： 上述图中的*表示p0.05； *表。

12、示p0.01； *表示p0.001。 具体实施方式 0019 下面结合实施例对本发明作进一步详细、 完整地说明。 0020 实施例中所用的黄芪甲苷来源为市售， 所用样品的纯度均符合药用标准。 0021 实施例 0022 1、 实验材料 0023 1.1药材 0024 黄芪甲苷 （CAS： 84687-43-4， 分子量784.97， HPLC纯度 98%， 上海中医药大学中药 说 明 书 2/4 页 4 CN 103908462 B 4 标准化中心生产） ； 甲基强的松龙 （MPD， CAS： 83-43-2， 分子量374.48， HPLC纯度 98%， Pfizer Manufacturi。

13、ng Belgium NV生产） 。 0025 1.2实验动物 0026 6周龄C57BL/6雌性小鼠， 由上海中医药大学实验动物中心提供。 0027 2、 实验方法 0028 2.1实验性自身免疫性脑脊髓炎模型建立 0029 在6周龄C57BL/6雌性小鼠中， 按照每只小鼠300 g MOG35-55和400 g热灭活结核 杆菌H37RA的剂量皮下接种 （MOG35-55和热灭活结核杆菌H37RA预先混悬在弗氏佐剂中） 。 接 种后腹腔注射200ng百日咳毒素， 48小时后重复一次。 动物的神经行为学评分按照 以下标 准进行： 0表示没有任何症状； 0.5表示尾尖部轻微下垂； 1表示动物弓背。

14、， 步态不稳， 尾部完 全下垂； 2表示单侧前肢瘫痪； 3表示前肢均瘫痪； 4表示后肢瘫痪； 5表示死亡。 0030 2.2动物给药及体重测量 0031 正常对照组： 20只， 给予正常饮食。 0032 模型对照组： 20只， 给予不加MOG35-55， 但包含热灭活结核杆菌H37RA预先混悬的 弗氏佐剂。 0033 阳性对照组： 20只， 在模型诱导后8天至10天腹腔注射给药。 0034 用药组： 20只， 在模型诱导前一天开始腹腔给予黄芪甲苷 （20mg/kg） ， 连续给药21 天。 0035 每7天称量各组动物体重一次。 0036 2.3免疫荧光组织化学分析 0037 在小鼠免疫接种后。

15、21天， 腹腔注射过量乌拉坦， 经心灌流4%多聚甲醛后取脑， 经蔗 糖脱水后， 包埋剂包埋， 进行冰冻切片， 切片厚度为20 m。 选取合适脑区的切片， PBS洗涤3次 后， 加穿孔剂以及5%驴血清进行封闭。 半小时后， 加入抗鼠GFAP， IbaI抗体4 C孵育过夜。 经 PBS洗涤后， 加入Alexa标记的荧光二抗， 孵育1小时后PBS洗涤3次， 将脑片贴于载玻片， 加入 封片剂后盖上盖玻片， 指甲油封边。 荧光倒置显微镜观察及拍照分析。 0038 2.4LFB染色 0039 取上述2.3中获得的脑片， PBS洗涤后置入LFB染色液， 56 C反应过夜。 95%乙醇漂洗 去除过量染色液后，。

16、 去离子水冲洗3遍， 加入碳酸锂分化处理30秒， 70%乙醇润洗30秒后， 95% 乙醇处理2次， 每次5分钟， 最后加入无水乙醇脱水两次， 每次5分钟。 二甲苯透明后封片， 光 学显微镜下观察及拍照分析。 0040 2.5ELISA分析 0041 取免疫接种21天后小鼠的大脑皮层， 按照1： 10重量体积比的比例加入PBS， 冰上研 磨后， 12000rpm离心， 上清液用于进一步的分析。 皮层中的炎症因子IL4,6,17A,TNF 和IFN 的测定分别按照eBiosience公司相关使用说明进行。 0042 3、 实验结果 0043 3.1黄芪甲苷显著降低EAE小鼠的发病 0044 如图1。

17、所示： 由黄芪甲苷处理后的用药组小鼠的发病严重程度与对照组相比较， 从 第 13天起分值显著降低， 甚至低于阳性对照药甲基强的松龙组； 从免疫接种后第8天至实 验结束期间， 由黄芪甲苷处理后的用药组的平均评分要显著低于对照组 （p0.001） 。 说 明 书 3/4 页 5 CN 103908462 B 5 0045 与此同时， 模型对照组的小鼠体重显著下降， 但经黄芪甲苷处理后， 用药组小鼠的 体重下降得到显著的抑制 （见图2所示） 。 0046 3.2黄芪甲苷显著减少EAE小鼠中枢神经系统脱髓鞘以及炎症反应 0047 如图3所示： 在模型对照脊髓中脱髓鞘情况比较显著， 而经黄芪甲苷处理后，。

18、 脱髓 鞘得到显著抑制， 与此同时， 单核炎症细胞的渗入也减少。 除此之外， 经黄芪甲苷处理之后， 中枢神经尤其是海马区域的星形胶质细胞和小胶质细胞的激活得到显著抑制， 表明炎症反 应得到显著抑制。 0048 3.3黄芪甲苷显著调节EAE小鼠中枢神经系统炎症因子产生 0049 如图4所示： 与正常对照组相比较， 在模型动物组小鼠的大脑皮层中， 炎症因子如 IL6， TNF 和IFN表达量均显著提高， 而IL4和IL17A没有显著变化； 而经黄芪甲苷处理之后 的用药组小鼠的大脑皮层中的炎症因子IL6,TNF 和IFN均得到显著下降。 0050 综上研究结果表明， 黄芪甲苷可以显著降低EAE小鼠的发病， 脱髓鞘以及炎症反 应， 以黄芪甲苷作为活性成分可望开发成预防或者治疗多发性硬化症的药物制剂。 0051 最后有必要在此说明的是： 以上内容只用于对本发明的技术方案作进一步详细地 说明， 不能理解为对本发明保护范围的限制， 本领域的技术人员根据本发明的上述内容作 出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。 说 明 书 4/4 页 6 CN 103908462 B 6 图1 图2 说 明 书 附 图 1/2 页 7 CN 103908462 B 7 图3 图4 说 明 书 附 图 2/2 页 8 CN 103908462 B 8 。