鹅不食草COSUB2/SUB超临界萃取物在制备具有抗流感病毒作用的药物或食品中的应用.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 103638082 A (43)申请公布日 2014.03.19 CN 103638082 A (21)申请号 201310546342.9 (22)申请日 2013.11.07 A61K 36/28(2006.01) A23L 1/29(2006.01) A23L 2/38(2006.01) A61P 31/16(2006.01) (71)申请人 暨南大学 地址 510632 广东省广州市天河区黄埔大道 西 601 号 (72)发明人 王国才 李药兰 李国强 吴鹏 张晓丽 洪艺蕾 (74)专利代理机构 广州粤高专利商标代理有限 公司 44102 代理人 任重 (54。

2、) 发明名称 鹅不食草 CO2超临界萃取物在制备具有抗流 感病毒作用的药物或食品中的应用 (57) 摘要 本发明公开了鹅不食草 CO2超临界萃取物在 制备具有抗流感病毒作用的药物或食品中的应 用。所述鹅不食草提取物为采用 CO2超临界萃取 工艺萃取鹅不食草得到的萃取物， 或是将所述萃 取物再经石油醚、 环己烷、 氯仿或苯萃取精制得到 的萃取物。所述鹅不食草提取物具有很好的抗流 感病毒作用， 其抗病毒作用与阳性对照药利巴韦 林相当或更为显著， 具有很好的医药应用价值。 本 发明为开发鹅不食草的植物资源提供了有力的技 术基础。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 5 页 (19)中。

3、华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书5页 (10)申请公布号 CN 103638082 A CN 103638082 A 1/1 页 2 1. 鹅不食草 CO2超临界萃取物在制备具有抗流感病毒作用的药物或食品中的应用， 所 述鹅不食草 CO2超临界萃取物的 CO2超临界萃取条件为 ： 萃取压力为 20 40 兆帕， 萃取温 度为 30 50， 流速为 10 30 升 / 小时， 萃取时间为 1 4 小时。 2.根据权利要求1所述的应用， 其特征在于， 为鹅不食草CO2超临界萃取物在制备具有 抗禽流感病毒作用的药物或食品中的应用。 3.根据权利要求2所述的应用。

4、， 其特征在于， 为鹅不食草CO2超临界萃取物在制备具有 抗 H1N1、 H5N1 或 H9N2 型流感病毒作用的药物或食品中的应用。 4.根据权利要求1所述的应用， 其特征在于， 所述鹅不食草CO2超临界萃取物的鹅不食 草原料为菊科植物石胡荽Centipeda minima (L.) A. Br. et. Aschers。 5.根据权利要求1所述的应用， 其特征在于， 所述鹅不食草CO2超临界萃取物的鹅不食 草原料为菊科植物石胡荽Centipeda minima (L.) A. Br. et. Aschers 的带花全草。 6. 根据权利要求 1 至 5 任一项所述的应用， 其特征在于， 所。

5、述鹅不食草 CO2超临界萃取 物的CO2超临界萃取条件为 ： 萃取压力为2030兆帕， 萃取温度为3040， 流速为15 25 升 / 小时， 萃取时间为 1 3 小时。 7. 根据权利要求 6 所述的应用， 其特征在于， 所述鹅不食草 CO2超临界萃取物的 CO2超 临界萃取条件为 ： 萃取压力为 25 兆帕， 萃取温度为 38， 流速为 20 升 / 小时， 萃取时间为 2 小时。 8. 根据权利要求 1 至 5 任一项所述的应用， 其特征在于， 所述鹅不食草 CO2超临界萃取 物是将鹅不食草 CO2超临界萃取物再经环己烷、 石油醚、 氯仿或苯进行萃取得到。 9. 一种抗流感病毒的药物， 。

6、其特征在于， 所述的药物含有治疗有效量的鹅不食草萃取 物和药学上可接受的载体。 10. 一种抗流感病毒的食品， 其特征在于， 所述食品为饮料或保健食品， 含有预防流感 有效量的鹅不食草提取物和食品可接受的载体。 权 利 要 求 书 CN 103638082 A 2 1/5 页 3 鹅不食草 CO2超临界萃取物在制备具有抗流感病毒作用的 药物或食品中的应用 技术领域 0001 本发明涉及医药技术领域， 更具体地， 涉及一种鹅不食草 CO2超临界萃取物在制备 具有抗流感病毒作用的药物或食品中的应用。 背景技术 0002 流感病毒是人类健康的一大威胁。由流感病毒所引起的呼吸道疾病被称为流行 性感冒 。

7、（流感） ， 具有流行面广、 传染性强、 发病率高等特点。根据统计， 全球每年的流感病例 为 6 12 亿， 其中重症流感为 300 500 万例， 死亡 25 50 万人， 重症流感的病死率可达 10%。 流感作为一种病毒性传染病不仅严重威胁着人民群众的健康， 而且给国家和社会带来 了沉重的负担， 如何有效预防和治疗流感尤其是高致病性流感已成为一项摆在世界各国医 药工作者面前亟待研究和解决的重要课题。由于流感病毒抗原变异， 常规疫苗目前尚不能 有效预防流感的暴发与流行， 因此抗流感病毒药物的研究在流感治疗中具有重要的意义。 0003 鹅不食草为菊科植物石胡荽Centipeda minima 。

8、(L.) A. Br. et. Aschers， 其入 药部位为菊科植物石胡荽Centipeda minima (L.) A. Br. et. Aschers的带花全草， 其入 药始载于南唐 食性本草 ， 而在 本草纲目 中亦有记载。在我国， 鹅不食草主要产于浙江、 江苏、 广东、 湖北等地， 在广西、 河南、 江西、 福建、 安徽等地亦有分布。该草药分别被 2000 版 和 2005 版 中国药典 收载， 可以 “通鼻窍， 止咳” ， 用于 “风寒头痛， 咳嗽痰多， 鼻塞不通， 鼻 渊流涕” 等。鹅不食草的化学成分主要有挥发油类、 萜类、 黄酮类和甾醇类化合物。 鹅不 食草的资源、 提取工艺。

9、及药理研究 （ 黑龙江医药 ， 2009 年 12 月 6 卷 6 期） 中研究总结了 鹅不食草提取物中的黄酮类化合物具有抗过敏性活性，鹅不食草醇提取物抑菌作用研究 （ 中国民族民间医药 2013 年第 14 期， 李吉华） 总结了的乙醇提取物的抗菌活性，鹅不食 草化学成分及抗肿瘤活性研究 （2012 年 5 月 30 日， 朱艳平） 系统地总结了乙醇提取物的 活性， 包括抗过敏、 抗肿瘤、 抗炎、 抗菌等活性作用， 有关研究提出了鹅不食草的乙醇提取物 具有止咳平喘的作用。但诸多的研究成果中， 均没有涉及鹅不食草提取物是否具有抗流感 病毒的作用相关研究成果报道。鹅不食草的药用植物资源有待进一步。

10、开发研究。 发明内容 0004 本发明要解决的技术问题是克服现有抗流感病毒药物的不足， 提供一种鹅不食草 CO2超临界萃取物在制备具有抗流感病毒作用的药物或食品中的应用。 0005 本发明要解决的另一个技术问题是提供所述鹅不食草提取物的制备方法。 0006 本发明的目的通过以下技术方案予以实现 ： 提供鹅不食草 CO2超临界萃取物在制备具有抗流感病毒作用的药物或食品中的应用。 0007 为了进一步发挥祖国中医药在抗流感病毒方面的作用， 本发明人尝试从多种中药 中提取有效成分， 但应用效果结果不佳， 唯有从未见报道具有抗流感病毒的鹅不食草的提 取物显示出抗流感病毒活性， 获得了抗流感病毒的活性物。

11、， 更进一步， 发明人经过大量的试 说 明 书 CN 103638082 A 3 2/5 页 4 验摸索， 总结得到在特定的 CO2超临界萃取条件下得到的鹅不食草萃取物比其他规方法制 备得到的相关活性物的抗流感病毒效果要好。 0008 所述特定的 CO2超临界萃取关键条件优选为 ： 所述鹅不食草 CO2超临界萃取物的 CO2超临界萃取条件为 ： 萃取压力为 20 40 兆帕， 萃取温度为 30 50， 流速为 10 30 升 / 小时， 萃取时间为 1 4 小时。 0009 进一步优选的 CO2超临界萃取关键条件是 ： 萃取压力为 20 30 兆帕， 萃取温度为 30 40， 流速为 15 2。

12、5 升 / 小时， 萃取时间为 1 3 小时。 0010 更优选地， 所述的鹅不食草 CO2超临界萃取物在采用 CO2超临界萃取时的条件为 ： 萃取压力为 25 兆帕， 萃取温度为 38， 流速为 20 升 / 小时， 萃取时间为 2 小时。 0011 本发明进一步提供的优选技术方案是， 所述的鹅不食草 CO2超临界萃取物在经 CO2 超临界萃取后再进一步使用环己烷、 石油醚、 氯仿或苯进行萃取。 0012 作为一种进一步优选方案， 所述的鹅不食草CO2超临界萃取物在经CO2超临界萃取 后再进一步使用环己烷、 石油醚、 氯仿或苯萃取 1 5 次， 合并萃取液， 浓缩、 干燥即得。 0013 作。

13、为一种最优选方案， 所述的鹅不食草CO2超临界萃取物在经CO2超临界萃取后再 进一步使用环己烷、 石油醚、 氯仿或苯萃取 2 4 次， 合并萃取液， 浓缩、 干燥即得。 0014 本发明所述鹅不食草 CO2超临界萃取物在制备具有抗流感病毒作用的药物或食品 中的应用方面， 更有针对性地应用于抗禽流感病毒的药物或食物方面， 具有很好的应用活 性。 0015 更优选地， 所述的流感病毒为 H1N1、 H5N1 或 H9N2 型流感病毒。 0016 作为一种优选方案， 所述鹅不食草为菊科植物石胡荽Centipeda minima (L.) A. Br. et. Aschers。 0017 作为一种最优。

14、选方案， 所述鹅不食草为菊科植物石胡荽Centipeda minima (L.) A. Br. et. Aschers 的带花全草。 0018 本发明同时提供一种抗流感病毒的药物， 所述的药物含有治疗有效量的鹅不食草 提取物和药学上可接受的载体。 0019 所述的药物可制成片剂、 胶囊剂、 颗粒剂、 散剂、 乳膏剂、 口服液、 喷雾剂或针剂。 0020 本发明同时提供一种抗流感病毒的食品， 所述食品为饮料或保健食品， 含有预防 流感有效量的鹅不食草提取物和食品可接受的载体。 0021 本发明的有益效果 ： 本发明突破现有技术关于鹅不食草的应用限制， 将鹅不食草提取物应用于制备抗流感 病毒的药物。

15、或食品及保健品方面， 开发了鹅不食草新的应用价值。 0022 本发明提供鹅不食草在制备抗流感病毒药物方面的应用。本发明采用适宜的 CO2 超临界萃取工艺， 将鹅不食草中的抗流感病毒的活性物质大量萃取出来， 获得了较高的萃 取效率。 0023 进一步地， 本发明在经过 CO2超临界萃取工艺萃取鹅不食草后再用石油醚、 环己 烷、 氯仿或苯萃取精制得到的萃取物具有更好的抗流感病毒作用， 其抗病毒作用远远强于 阳性对照药利巴韦林， 具有很好的医药应用价值。 0024 本发明所述萃取物能针对性解决禽流感病毒特别是 H1N1、 H5N1 或 H9N2 型流感病 毒的带给医学界的治疗技术难题。 说 明 书 。

16、CN 103638082 A 4 3/5 页 5 具体实施方式 0025 以下结合具体实施例来进一步说明本发明， 除非特别说明， 本发明采用的原料试 剂为本技术领域常规市购的原料试剂， 除非特别说明， 采用的方法和设备为本技术领域常 规的方法和设备。 0026 实施例 1 将 300g 鹅不食草 （采自广东， 由广州市药材公司高级工程师麦振球鉴定为菊科植物石 胡荽Centipeda minima (L.) A. Br. et. Aschers， 下述实施例同） 的干燥全草或带花全草 （下述实施例同） 粉碎， 过 60 目筛， 置于 CO2超临界萃取仪中， 萃取压力为 25 兆帕、 萃取温度 为。

17、 38， 流速为 20 升 / 小时， 萃取时间为 2 小时， 得到鹅不食草 CO2超临界萃取物 20.3g。 0027 实施例 2 将300g鹅不食草 （采自广东， 由广州市药材公司高级工程师麦振球鉴定） 的干燥全草粉 碎， 过60目筛， 置于CO2超临界 萃取仪中， 萃取压力为40兆帕、 萃取温度为50， 流速为30 升 / 小时， 萃取时间为 4 小时， 得到鹅不食草 CO2超临界萃取物 22.6g。 0028 实施例 3 将300g鹅不食草 （采自广东， 由广州市药材公司高级工程师麦振球鉴定） 的干燥全草粉 碎， 过60目筛， 置于CO2超临界 萃取仪中， 萃取压力为20兆帕、 萃取温。

18、度为30， 流速为10 升 / 小时， 萃取时间为 1 小时， 得到鹅不食草 CO2超临界萃取物 14.6g。 0029 实施例 4 将300g鹅不食草 （采自广东， 由广州市药材公司高级工程师麦振球鉴定） 的干燥全草粉 碎， 过60目筛， 置于CO2超临界 萃取仪中， 萃取压力为25兆帕、 萃取温度为38， 流速为20 升 / 小时， 萃取时间为 2 小时， 得到鹅不食草 CO2超临界萃取物， 将鹅不食草 CO2超临界萃取 物加水溶解至1L， 然后用1L的环己烷萃取， 重复用环己烷萃取3次， 合并环己烷萃取液得精 制的鹅不食草 CO2超临界萃取物。 0030 实施例 5 将300g鹅不食草 。

19、（采自广东， 由广州市药材公司高级工程师麦振球鉴定） 的干燥全草粉 碎， 过60目筛， 置于CO2超临界 萃取仪中， 萃取压力为25兆帕、 萃取温度为38， 流速为20 升 / 小时， 萃取时间为 2 小时， 得到鹅不食草 CO2超临界萃取物， 将鹅不食草 CO2超临界萃取 物加水溶解至1L， 然后用1L的石油醚萃取， 重复用石油醚萃取3次， 合并石油醚萃取液得精 制的鹅不食草 CO2超临界萃取物。 0031 实施例 6 将300g鹅不食草 （采自广东， 由广州市药材公司高级工程师麦振球鉴定） 的干燥全草粉 碎， 过60目筛， 置于CO2超临界 萃取仪中， 萃取压力为25兆帕、 萃取温度为38。

20、， 流速为20 升 / 小时， 萃取时间为 2 小时， 得到鹅不食草 CO2超临界萃取物， 将鹅不食草 CO2超临界萃取 物加水溶解至1L， 然后用1L的氯仿萃取， 重复用氯仿萃取3次， 合并氯仿萃取液得精制的鹅 不食草 CO2超临界萃取物。 0032 实施例 7 将300g鹅不食草 （采自广东， 由广州市药材公司高级工程师麦振球鉴定） 的干燥全草粉 碎， 过60目筛， 置于CO2超临界 萃取仪中， 萃取压力为25兆帕、 萃取温度为38， 流速为20 说 明 书 CN 103638082 A 5 4/5 页 6 升 / 小时， 萃取时间为 2 小时， 得到鹅不食草 CO2超临界萃取物， 将鹅不。

21、食草 CO2超临界萃取 物加水溶解至1L， 然后用1L的苯萃取， 重复用苯萃取3次， 合并苯萃取液得精制的鹅不食草 CO2超临界萃取物。 0033 对比例 1 将 300g 鹅不食草 （采自广东， 由广州市药材公司高级工程师麦振球鉴定， 为菊科植物 石胡荽Centipeda minima (L.) A. Br. et. Aschers） 的干燥全草粉碎， 用 1 升体积百分 比浓度为75%的乙醇加热回流提取， 提取时间为1h， 重复提取3次， 合并提取液， 浓缩干燥得 鹅不食草乙醇 （75%， v/v） 提取物。 0034 对比例 2 将 300g 鹅不食草 （采自广东， 由广州市药材公司高级。

22、工程师麦振球鉴定， 为菊科植物 石胡荽Centipeda minima (L.) A. Br. et. Aschers） 的干燥全草粉碎， 用 1 升水加热回 流提取， 提取时间为 1h， 重复提取 3 次， 合并提取液， 浓缩干燥得鹅不食草水提取物。 0035 实施例8 鹅不食草CO2超临界萃取物在MDCK细胞中对甲型流感病毒的抑制作用 实验 取 MDCK 细胞 （来源于暨大大学药学院中药及天然药物研究所， 并不限定本发明， 本领 域技术人员也可采用其他来源的所述细胞进行实验） 生长至单层的 96 孔细胞培养板， 弃 去上清液， 用 PBS（pH7.2 7.4）洗两遍， 每孔分别加入用 ME。

23、M 液体培养基 （品牌 ： 美国 HyClone， 购自 ： 上海慧颖生物科技有限公司， 货号 SH30024.01B） 二倍稀释的药液与病毒液 100 L， 另外设细胞对照组、 病毒对照组， 置于 37、 饱和湿度、 5% CO2培养箱中孵育。72 h 后， 0.5 mM WST-1（品牌 ： Roche， 购自 ： 北京嘉美纽诺生物科技有限公司， 货号 ： 11 644 807 001） 溶液加入到每孔中 （WST-1 的浓度为 0.25 mM） 。4 小时后， 用酶标仪在 450 nm 测吸光 度。IC50计算方式如下 ： 细胞存活率 = （细胞对照孔 OD 值加药孔 OD 值） 100。

24、% ； 以药物浓 度为 X 轴， 细胞存活率为 Y 轴， 在 Origin 作图， 求出 50% 细胞存活率对应的浓度则为 IC50。 0036 将实施例 1 3 制备得到的鹅不食草 CO2超临界萃取物和 47 制备得到的精制的 鹅不食草 CO2超临界萃取物及对比例 1 和 2 的产物进行抗甲型流感病毒活性测试， 结果见 表 1， 实施例 1 3 制备得到的产物 （鹅不食草 CO2超临界萃取物） 对 A/PR8/34（H1N1） 、 A/ Duck/Guangdong/99 (H5N1)、 A Chicken/Guangdong/96（H9N2） 这三种甲型流感病毒均具 有一定的抗病毒作用， 。

25、而且它们的半数抑制浓度 （IC50） 与阳性对照药物利巴韦林没有明显 差别， 说明它们的抗流感病毒作用和利巴韦林的相当。实施例 4 7 制备得到的产物 （精制 的鹅不食草 CO2超临界萃取物） 鹅不食草提取物对 A/PR8/34 （H1N1） 、 A/Duck/Guangdong/99 (H5N1)、 A/ Chicken/Guangdong/96（H9N2） 这三种流感病毒的半数抑制浓度 （IC50） 比阳性 对照药物利巴韦林的要小很多， 说明实施例 4 7 制备得到的产物 （精制的鹅不食草 CO2超 临界萃取物） 的抗病毒作用显著强于利巴韦林。 （A/PR8/34（H1N1） 、 A/Duck/Guangdong/99 (H5N1)、 A /Chicken/Guangdong/96（H9N2） 三种流感病毒株为本领域实验常规常用的流感 病毒株， 本实施例病毒株来源于华南农业大学兽医学院陈建新研究员） 。实验表明， 本发明 鹅不食草 CO2超临界萃取物在制备具有抗流感病毒作用的药物或食品中的应用具有很好的 应用前景。 0037 表 1 鹅不食草提物或萃取物抑制流感病毒感染 MDCK 细胞的 IC50值 说 明 书 CN 103638082 A 6 5/5 页 7 说 明 书 CN 103638082 A 7 。