技术领域
本发明属于生物医药技术领域，尤其涉及骨细胞LIMK2基因及其表达产物在制备用于治疗与骨改建进程相关的疾病的药物中的应用。
背景技术
骨改建是骨折、骨缺损等疾病修复重建过程中必须经历的微观过程，新生骨组织必须经过骨改建成为成熟的骨组织方能承受外力。目前骨折、骨缺损等疾病的治疗方法均存在骨改建时间过长、短期内新生骨组织无法承受外力的缺点。无论是采用骨移植术(使用自体骨、异体骨或人工骨替代品)还是牵张成骨或骨组织工程等方法进行骨折、骨缺损等疾病的修复重建，新生的骨组织均需要经过骨改建从编织骨改建为板层骨，方能具有足够的强度来承受外力的作用。以骨移植术以及牵张成骨术为例，都需要经过10～12个月的骨改建，才能形成稳固的骨组织，以达到日常活动所需的机械强度和功能需求。
因此，如何加速骨改建的进程，使新生的骨组织尽快行使正常生理功能，是目前骨折、骨缺损等疾病修复治疗中面临和亟待解决的重要问题。
骨改建的细胞学基础是基本多细胞单位(basic multicellular unit,BMU)，BMU包括骨细胞、成骨细胞和破骨细胞，以及骨衬细胞、血源性细胞(包括巨噬细胞、淋巴细胞等)等，其中骨细胞通过对成骨细胞和破骨细胞的调控促进骨改建的进行，调控着骨改建的速率。骨改建过程包括启动期(骨吸收期)、反转期和骨形成期(终止期)等三个阶段。启动期包括破骨前体细胞的募集、分化为成熟的破骨细胞以及骨吸收活动的激活和持续；反转期是破骨活动和成骨活动之间的转换和过渡，包括破骨细胞的凋亡和成骨细胞的募集和分化；骨形成期包括成骨细胞形成新骨并矿化以及成骨细胞的终末分化。在骨改建的过程中，直接的效应细胞是成骨细胞和破骨细胞，骨细胞作为一个调控者，通过调 控成骨细胞和破骨细胞的功能来控制着骨改建的速率。在受到力学刺激后，骨细胞可以产生力学敏感性的信号分子，如骨形态发生蛋白(bone morphogeneticproteins,BMPs),前列腺素E2(prostaglandin E 2,PGE2),以及一氧化氮(nitricoxide,NO)，这些信号分子调控成骨细胞和破骨细胞的募集、分化和功能活动。研究表明，骨细胞是肿瘤坏死因子配体(receptor of tumor necrosis factor ligand,RANKL)和骨保护素(osteoprotegerin,OPG)的主要来源。骨细胞通过在树突表面表达膜结合型RANKL，RANKL可以和破骨前体细胞(骨髓巨噬细胞)直接结合，从而支持破骨细胞的生成。同时，骨细胞通过表达OPG，一方面OPG在骨细胞胞内控制着RANKL在骨细胞胞膜上的表达量，另一方面，当OPG被分泌到骨细胞胞外时，可以作为RANKL的诱骗受体，和RANKL结合，从而阻碍了RANKL和破骨前体细胞表面的RANK结合，抑制破骨细胞的成熟，因此，骨细胞通过调控RANKL/OPG的平衡影响着骨改建的成骨和破骨方向。骨细胞还可以通过硬骨素等调控成骨细胞的功能，硬骨素通过与Wnt-β连环蛋白信号通路的LRP5\4\6受体结合，抑制该信号通路的功能，抑制成骨。
骨组织不断受到外界的力学刺激，力学刺激主要以流体剪切力(Fluid shearstress,FSS)的方式作用于骨组织细胞。骨细胞是主要的力学感受细胞，其力生化信号传导与肌动蛋白细胞骨架在力学刺激下的改建(actin cytoskeletonreorganization)有关。在骨折、骨缺损等疾病修复过程中，早期制动期过后，提倡适度的功能锻炼，以使新生的骨组织的强度尽快得到提高。人体的日常活动和功能锻炼可使骨组织不断受到力学刺激，力施加于骨组织后，通过两种方式作用于骨组织细胞：一是通过细胞变形使细胞直接感受应力；二是力引起骨基质发生形变，驱使位于骨陷窝-骨小管网状结构和哈弗森系统中的间隙液体流动，产生流体剪切力。这种液体流动对外界应力有级联放大作用，是骨组织细胞的主要力学刺激来源，并在骨组织细胞表面产生流体剪切力作用于骨组织细胞。骨细胞是骨组织中含量最丰富的细胞，占骨组织细胞总量的90％以上，呈星状包埋于钙化的骨基质中，通过细长的细胞突触在骨细胞之间、骨细胞和其他骨组织细胞之间产生交流和沟通，形成一个快速信号传递网络。骨细胞是骨组织中主要的力学敏感性细胞，其对力学刺激的敏感性大于成骨细胞和成纤维细胞。骨细胞受到流体剪切力后，可以通过多种途径感受应力刺激。骨细胞的包膜被 间隙液和蛋白聚糖包裹着，细胞突触中大部分是肌动蛋白，突触上有αvβ3整合素和蛋白栓绳(protein tethers)。蛋白栓绳在间隙液流动的作用下，可以发生形变，随后拖拽肌动蛋白细胞骨架，或者拉开张力激活的离子通道，允许钙离子和其他的离子进入细胞，激活多种化学信号级联。流体剪切力也可以直接拖拽整合素，如α5β1整合素在细胞突触和胞体均有表达，也和半通道(hemi-channels)有关。激活的半通道会释放信号分子如ATP，发动信号级联。机械信号可以从整合素被拖拽的部位开始传递，沿着肌动蛋白细胞骨架到远方，最终甚至可以通过LINC复合体传递到胞核中。施加在肌动蛋白纤维上的力也可以直接开启张力激活的离子通道。综上，细胞骨架几乎和应力感受的每一个步骤相关联细胞骨架影响着骨细胞对应力刺激的感受和应答。
骨细胞对力学刺激的敏感性下降将不利于骨改建的进行，骨细胞力学敏感性下降与细胞的弹性模量有关。随着年龄的增长，机械应力导致的成骨活动会下降，其原因之一便是骨细胞对力学刺激的敏感性下降。当骨细胞受到持续的力学刺激时，细胞对力学刺激的敏感性会下降，而在持续的力学刺激加载过程中插入间断期，则有利于骨细胞力学敏感性的恢复。研究表明，3D培养的骨细胞，其形态是立体的，呈球形，球形的骨细胞的弹性模量小于2D培养的扁平的和贴壁的骨细胞，而球形的骨细胞对力学刺激的敏感性更高。细胞弹性模量受到力学刺激下的肌动蛋白细胞骨架的改建的影响，LIMK2/cofilin信号通路调控的细胞骨架改建在其中有重要作用。成骨细胞受到力学刺激后，细胞骨架会发生改建，肌动蛋白应力纤维增加，持续的力学刺激会使细胞的硬度(弹性模量)增加，使细胞对后续力学刺激的敏感性下降。在该过程中，LIMK2/cofilin信号通路调控的细胞骨架改建发挥了重要的作用。细胞受到应力刺激后，肌动蛋白细胞骨架本身会发生改建(reorganization)，细胞骨架的主要成分聚合态肌动蛋白(F-actin)变得更加致密，排列方向趋向一致，细胞骨架的应力纤维沿着主要应变的方向排列，细胞变形，细胞硬度和收缩性增加，使细胞适应力学环境的变化，细胞的力学敏感性下降。丝切蛋白Cofilin是肌动蛋白解聚因子，是细胞骨架RhoA/ROCK/LIMK2/cofilin调节通路中最下游的细胞因子，具有直接解聚F-actin的能力。而LIMK可以磷酸化cofilin的丝氨酸-3残基并使之失活，使得cofilin构象发生变化，阻止cofilin与肌动蛋白的结合，从而增强肌 动蛋白的稳定性。研究发现，抑制cofilin1基因可以诱导细胞形成粗大的应力纤维，F-actin聚集成簇，稳定微丝，促进细胞骨架改建。在非洲绿猴肾细胞和神经纤维瘤细胞中过度表达LIMK2可以促进肌动蛋白的合成，而沉默纤维母细胞LIMK2的表达可以抑制转化生长因子β1(transforming growth factor,TGF-β1)诱导的细胞骨架改建。
发明内容
一方面，本发明的目的在于克服现有技术存在的骨改建时间过长、短期内新生骨组织无法承受外力的不足而提供了骨细胞LIMK2基因及其表达产物在制备用于治疗与骨改建进程相关的疾病的药物中的应用。本发明通过抑制骨细胞LIMK2基因及/或LIMK2基因表达产物，抑制骨细胞的细胞骨架在流体剪切力作用下的改建，从而直接地、特异性地上调骨细胞的力学敏感性，促进骨细胞本身的增殖，并通过骨细胞对成骨细胞和破骨细胞功能的调控，来控制骨改建的速率和平衡，最终加速骨改建进程，加快骨折、骨质疏松、骨缺损疾病、骨发育不全畸形等疾病的修复重建过程。所述药物能够加速骨改建进程，从而加快与骨改建进程相关的疾病的修复。
作为对上述技术方案的进一步改进，所述与骨改建进程相关的疾病选自骨折、骨质疏松、骨缺损疾病、骨发育不全畸形。
作为对上述技术方案的进一步改进，所述药物能够加速骨植入物的骨整合、加速口腔正畸治疗。
作为对上述技术方案的进一步改进，所述药物包括：骨细胞LIMK2基因的抑制基因激活剂、抑制骨细胞LIMK2基因表达的蛋白激活剂、抑制骨细胞LIMK2基因表达的siRNA、骨细胞LIMK2基因转录后基因表达调控的microRNA激活剂、促进骨细胞LIMK2基因表达的蛋白降解分子、促进骨细胞LIMK2基因表达的因子及蛋白抑制剂。
作为对上述技术方案的进一步改进，所述药物包括药学上可接受的载体。
另一方面，本发明还提供了抑制LIMK2基因的siRNA，所述siRNA选自 siRNA1、siRNA2和siRNA3中的至少一种，其中：
siRNA1的序列为：
正义链：5’-ACGCACCUUACGCAAGAGU-3’
反义链：5’-ACUCUUGCGUAAGGUGCGUdTdT-3’
siRNA2的序列为：
正义链：5’-UCACAAAGCCACAGGCAAA-3’
反义链：5’-UUUGCCUGUGGCUUUGUGAdTdT-3’
siRNA3的序列为：
正义链：5’-GAUAAAAGAGCCUGGAUUA-3’
反义链：5’-UAAUCCAGGCUCUUUUAUCdTdT-3’。
作为对上述技术方案的进一步改进，所述siRNA为siRNA2，相较于siRNA1和siRNA3，siRNA2的抑制效果最佳。
又一方面，本发明还提供了所述的抑制LIMK2基因的siRNA在制备用于治疗与骨改建进程相关的疾病的药物中的应用。
本发明的siRNA通过抑制骨细胞LIMK2基因，抑制骨细胞的细胞骨架在流体剪切力作用下的改建，从而直接地、特异性地上调骨细胞的力学敏感性，促进骨细胞本身的增殖，并通过骨细胞对成骨细胞和破骨细胞功能的调控，来控制骨改建的速率和平衡，最终加速骨改建进程，加快骨折、骨质疏松、骨缺损疾病、骨发育不全畸形等疾病的修复重建过程。
作为对上述技术方案的进一步改进，所述与骨改建进程相关的疾病选自骨折、骨质疏松、骨缺损疾病、骨发育不全畸形。
作为对上述技术方案的进一步改进，所述药物能够加速骨植入物的骨整合、加速口腔正畸治疗。
相对于现有技术，本发明的有益效果为：
本发明通过抑制骨细胞LIMK2基因及/或LIMK2基因表达产物，抑制骨细胞的细胞骨架在流体剪切力作用下的改建，从而直接地、特异性地上调骨细胞的力学敏感性，促进骨细胞本身的增殖，并通过骨细胞对成骨细胞和破骨细胞 功能的调控，来控制骨改建的速率和平衡，最终加速骨改建进程，加快骨折、骨质疏松、骨缺损疾病、骨发育不全畸形等疾病的修复重建过程。本发明的方法与目前对骨细胞力学敏感性的其他研究相比，更直接、更具有特异性，可减少对细胞和机体正常生理活动的影响。
现有治疗方法中骨改建时间过长、短期内新生骨组织无法承受外力的不足，本发明可为骨折、骨质疏松、骨缺损疾病、骨发育不全畸形等疾病的修复重建提供新思路和新方法；有助于开发直接地、特异性地上调骨组织细胞力学敏感性的方法，从而发现骨组织疾病治疗的新靶点，有助于缩短疾病的临床治疗时间。
附图说明
图1显示了FAM-siRNA转染MLO-Y4骨细胞样细胞荧光图像，200×镜下可见较多细胞内荧光，荧光在胞内呈点状散在分布，见细胞胞体形态呈多角形；
图2显示了采用LIMK2特异性siRNA序列R1、R2、R3转染MLO-Y4骨样细胞系后的LIMK2 mRNA的相对表达量，其中，A：24h，siRNA序列R1、R2与对照组相比有统计学意义(P＜0.01)，siRNA序列R1、R2与siRNA序列R3相比有统计学意义(P＜0.01)，采用序列R2转染后，LIMK2的mRNA相对表达量低于对照组的25％；B：48h，siRNA序列R1、R2、R3抑制效果均有所下降，与对照组相比较有统计学差异(P＜0.01)，采用序列R2转染后，LIMK2的mRNA相对表达量低于对照组的50％；
图3显示了随着转染时间的增加，siRNA(R1)组，LIMK2蛋白表达水平呈现了先下降后上升的趋势，在36h LIMK2蛋白的表达水平是NC siRNA组的25％以下，36h之后，siRNA(R1)组和NC siRNA组之间LIMK2蛋白表达差异有统计学意义(P＜0.01)；siRNA(R2)组，在36h之后，LIMK2蛋白的表达水平是NC siRNA组的30％以下，在各个时间点，siRNA(R2)组和NC siRNA组之间LIMK2蛋白表达差异有统计学意义(P＜0.01)；siRNA(R3)组，LIMK2蛋白表达水平在各个时间点均为是NC siRNA组的50％以上，在24h、36、72h，siRNA(R3)组和NC siRNA组之间LIMK2蛋白表达差异有统计学意义(P＜ 0.01)，其中，A、B、C、D分别代表24h、36、48h，72h，Western Blotting检测LIMK2蛋白表达水平；
图4显示了siRNA转染24/48/72h后MLO-Y4细胞增殖活性，细胞增殖活性，与未进行siRNA转染的对照组相比较，采用RNA干扰抑制了MLO-Y4骨细胞样细胞的LIMK2蛋白表达后，两组细胞的OD值差异不具有统计学差异(P＞0.05)；
图5为F-Actin细胞骨架荧光图片(200×)，其显示：在FSS(+)组中，NC siRNA转染，FSS作用下，肌动蛋白细胞骨架F-Actin发生改建，细胞树突伸长，F-Actin呈细丝状排列；而LIMK2特异性siRNA转染，FSS作用下，肌动蛋白细胞骨架F-Actin未发生改建，细胞树突长度和非加载组相近，F-Actin排列不规则，呈弥散状；FSS(-)组，无论是否转染，F-Actin绿色荧光较弱，呈不连续的弥散状；
图6显示了RNAi沉默LIMK2基因FSS加载1h后单个细胞肌动蛋白细胞骨架平均荧光强度。FSS加载后，NC siRNA组和siRNA组的荧光强度均有提高，加载后与加载前的单个细胞平均荧光强度差异有统计学意义(P＜0.05)，NCsiRNA组加载后单个细胞的平均荧光强度是加载前的3.5倍，siRNA组加载后单个细胞的平均荧光强度是加载前的1.3倍。FSS加载后，NC siRNA组单个细胞的平均荧光强度是siRNA组的2倍，二者的差异有统计学意义(P＜0.01)。*与加力/阴性siRNA转染组相比较有统计学差异，P＜0.01。
图7显示了RNAi沉默LIMK2基因FSS加载1h后加载液中PGE2的浓度在开始加载后的5min，siRNA组和NC siRNA组的PGE2释放增加，5min之后，两组的PGE2释放减缓，siRNA组PGE2释放量始终高于NC siRNA组，5min之后的每个时间点，两组之间的差异有统计学意义(P＜0.01)。
图8显示了RNAi沉默LIMK2基因FSS加载1h后MLO-Y4COX-2 mRNA的表达FSS(+)组的COX-2 mRNA相对表达水平较FSS(-)组高，在FSS(+)组，siRNA组COX-2的表达水平较NC siRNA组高，差异有统计学意义(P＜0.01)。*与FSS(-)组相比有统计学差异，P＜0.01。
具体实施方式
本发明通过抑制骨细胞LIMK2基因及/或LIMK2基因表达产物，抑制骨细胞的细胞骨架在流体剪切力作用下的改建，从而直接地、特异性地上调骨细胞的力学敏感性，促进骨细胞本身的增殖，并通过骨细胞对成骨细胞和破骨细胞功能的调控，来控制骨改建的速率和平衡，最终加速骨改建进程，加快骨折、骨质疏松、骨缺损疾病、骨发育不全畸形等疾病的修复重建过程。相对于成骨细胞，骨细胞具有以下优势：
(1)在成年动物中，骨细胞占全部骨组织细胞的90～95％，其数量远远大于成骨细胞。
(2)细胞对力学刺激的敏感性下降将不利于骨改建的进行。研究表明骨细胞是骨组织中主要的力学敏感性细胞，其对力学刺激的敏感性大于成骨细胞。
(3)本发明的目的是通过加速骨改建进程，促进骨折、骨缺损疾病的修复。骨改建的细胞学基础是基本多细胞单位(basic multicellular unit,BMU)，BMU主要包括骨细胞、成骨细胞和破骨细胞。骨改建过程包括启动期(骨吸收期)、反转期和骨形成期(终止期)等三个阶段。启动期包括破骨前体细胞的募集、分化为成熟的破骨细胞以及骨吸收活动的激活和持续；反转期是破骨活动和成骨活动之间的转换和过渡，包括破骨细胞的凋亡和成骨细胞的募集和分化；骨形成期包括成骨细胞形成新骨并矿化以及成骨细胞的终末分化。在骨改建的过程中，直接的效应细胞是成骨细胞和破骨细胞，成骨细胞仅参与成骨过程。而骨细胞作为一个调控者，能通过调控成骨细胞和破骨细胞的功能来控制骨改建的速率。骨细胞既参与破骨过程，又参与成骨过程，在骨改建的过程中发挥重要的作用。
综上所述，抑制骨细胞LIMK2基因对骨改建的促进作用比抑制成骨细胞LIMK2基因对骨改建的促进作用更好。
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。其中，siRNA1与R1、siRNA(R1)、siRNAR1、siRNA序列R1可替换使用；siRNA2与R2、siRNA(R2)、siRNAR2、siRNA序列R2可替换使用；siRNA3与R3、siRNA(R3)、siRNAR3、siRNA序列R3可替换使用。
实施例1
MLO-Y4骨样细胞系LIMK2基因的RNA干扰及其对MLO-Y4骨样细胞系在流 体剪切力作用下细胞骨架改建的影响
1.材料：
1.1.实验细胞：
P35 MLO-Y4骨样细胞系，美国Lynda F Bonewald教授惠赠。
1.2.主要的实验仪器：
1.3.主要的试剂和耗材：
1.4.主要的溶液配制：
1)含5％血清的α-MEM培养基：一袋α-MEM粉剂(g)，NaHCO32.2g，加ddH2O定容至1L，磁力搅拌器搅拌60min，调节pH为7.2，过滤除菌，加入热灭活的胎牛血清(FBS-2.5％)和小牛血清(CS-2.5％)，配制成血清含量为5％的培养基。
2)DPBS缓冲液：一袋DPBS粉剂(g)，加入ddH2O定容至1L，高温高压灭菌。
3)鼠尾I型胶原溶液：1.2ml胶原，44.4微升乙酸，38755.6微升灭菌ddH2O 混合配成40ml浓度为0.15mg/ml的鼠尾I型胶原溶液。
4)SDS-PAGE电泳液：取一瓶可以配制1L SDS-PAGE电泳液的粉剂，加ddH2O定容至1L。
5)Western转膜液：取一瓶可以配制1L Western转膜液的粉剂，加入ddH2O到700ml，加入200ml无水乙醇，加入ddH2O定容至1L。
6)TBS缓冲液：Tris 1.21g，NaCl 8.77g，ddH2O 800ml，用1M的HCl调pH至8.0，加ddH2O定容至1000ml。
7)TBS-T缓冲液：将0.1％的Tween-20加入配好的TBS中。
8)封闭缓冲液：将5％质量体积比脱脂奶粉溶于TBS-T。
9)配制Tris-甘氨酸SDS-PAGE的12％分离胶：将10％SDS(0.05ml)、1mol/lTris(PH8.8，1.3ml)、10％过硫酸胺(0.05ml)、30％丙烯酰胺(2.0ml)、双蒸水(1.6ml)混匀后，加入TEMED，立即混匀并将其倒入固定好的玻璃板中，注意留出空间以备加入浓缩胶。将水小心缓慢注入，直至位于胶液面上约2-3mm高。待分离胶完全聚合后倾斜倒出覆盖的水层，残留的水用滤纸吸干净。
10)配制Tris-甘氨酸SDS-PAGE的5％浓缩胶：把10％SDS(0.02ml)、1mol/lTris(PH 6.8，0.25ml)、10％过硫酸胺(0.02ml)、30％丙烯酰胺(0.33ml)、双蒸水(1.4ml)混匀。加入TEMED，加入后快速旋动混合物并倒入玻璃板中，插入梳子，将凝胶置于室温，浓缩胶聚合后即可处理样品。
11)3.7％多聚甲醛固定液：将3.7g多聚甲醛加入80ml PBS中，微热搅拌直至固体全部溶解，调节pH值为7.4，PBS定容至100ml，4℃避光保存。
12)FITC-Phalloidin工作液的配制：加入1.5ml甲醇，得到浓度为6.6μM的Phalloidin溶液，-20℃避光保存。
2.实验方法：
2.1MLO-Y4骨细胞样细胞的培养、传代、冻存及复苏
2.1.1 MLO-Y4骨细胞样细胞的复苏、培养及传代
往100mm的培养皿加入8mL胶原溶液，室温包被1h后，倾斜培养皿数min，移去溶液，用DPBS冲洗去除多余的酸。将冻存管至于37℃水浴融化，将细胞悬液转移入15mL离心管中，加入9mL含2.5％FBS+2.5％CS血清的α-MEM培养基，离心后弃上清，加入含有5％FBS和5％CS的 α-MEM培养基，待细胞长到60％～70％融合度，可以1:6～1:7进行传代。将细胞培养液去，然后在平皿内加入2～4mL胰酶后置于培养箱内消化，然后以1:1～1:2的体积加入含血清的培养基终止消化，将细胞以1:6左右的比例分装，加入培养基至12mL/100mm。
2.1.2 MLO-Y4骨细胞样细胞的冻存
将细胞培养液移去，消化后进行细胞计数，离心1000～1500r/min 5min，同时避光条件下，配制冻存液(60％α-MEM,30％FBS,10％DMSO)。细胞离心后，弃上清，加入冻存液，以1×106cells/mL/的密度分装，每管1～1.5mL，迅速放入梯度冻存盒内，放入-20℃冰箱内，24h后移入-80℃冰箱，尽快放入液氮。
2.2脂质体介导的siRNA转染MLO-Y4骨细胞样细胞
2.2.1实验分组：根据转染时使用的siRNA浓度的不同分为9组：其中1～9组中每组siRNA/脂质体的用量分别为0.5/0.5、0.5/1、0.5/1.5、1/0.5、1/1、1/1.5、1.5/0.5、1.5/1、1.5/1.5(μL)。另设一空白对照组，只加1μL的LipofectamineTM2000。
2.2.2消化并接种细胞：在转染前一天，将细胞以9.5×104个/孔的密度接种到鼠尾一型胶原包被的24孔板中，加入0.5mL的培养基，这样细胞在转染时将会达到50％的汇合度。
2.2.3配制转染混合物：分别将3μL、6μL、9μL的FAM标记的阴性siRNA溶于450μL的Opti-MEM中，轻轻混匀。分别将3μL、6μL、9μL的LipofectamineTM2000溶于450μL的Opti-MEM中，轻轻混匀，室温孵育5min。将含有siRNA和LipofectamineTM2000的溶液各取150μL、交叉配对混合，轻轻混匀，室温孵育20min，配成1～9组siRNA/脂质体复合物。
2.2.4转染细胞：将细胞培养基换成含有1％FBS+1％CS血清的α-MEM450mL，将siRNA/脂质体混合物依次加入24孔板中，每孔加入50μL。8h后换成含2.5％FBS+2.5％CS的α-MEM培养基500μL。14h后冷PBS洗3次，倒置荧光显微镜观察。
2.2.5转染效率观察：倒置荧光显微镜下观察24孔板，拍照存档。
2.3RNA干扰后的LIMK2 mRNA水平的检测
2.3.1使用siRNA转染MLO-Y4骨细胞样细胞
1)在转染前一天，将细胞以4.75×105个/孔的密度接种到鼠尾一型胶原包被的6孔板中，加入2mL的培养基，转染前将细胞培养基换成含有1％FBS+1％CS血清的α-MEM1.7mL。
2)分组设计
组1：空白对照
组2：使用siRNA1(R1)转染
组3：使用siRNA2(R2)转染
组4：使用siRNA3(R3)转染
组5：使用阴性对照siRNA转染
组6：使用阳性对照siRNA转染(特异性抑制β-Actin的mRNA表达)
3)配制转染混合液：将2.5μL siRNA溶于125μL的Opti-MEM中，轻轻混匀。将2.5μL LipofectamineTM2000溶于125μL的Opti-MEM中，轻轻混匀，室温孵育5min。将含有siRNA和LipofectamineTM2000的溶液轻轻混匀，室温孵育20min，加入到6孔板中。
2.3.2使用Trizol提取细胞总RNA
细胞转染后24、36、48、72h后取出6孔板，用冷DPBS漂洗3次，每孔加入500μL的Trizol，室温静置5min，吹打，收入1.5mLEP管中，加入200μL氯仿，剧烈振荡15～30s，室温静置5min，4℃，12000g/min离心15min。吸上清至新的EP管中，加入等体积异丙醇，颠倒混匀10～20次，室温静置10min，4℃，12000g/min离心10min，弃上清，加入1mL预冷的75％的乙醇，振荡，4℃，7500g/min，离心5min。弃上清，静置挥发，10～30μLDEPC水溶解，分光光度计测量细胞总RNA浓度和纯度，-80℃储存备用。
2.3.3qRT-PCR检测
1)引物的设计合成：在GenBank中查找小鼠LIMK2的cDNA序列(编号NM-005569)。设计并由广州瑞真合成引物：
LIMK2-F 5’-ATCATCCACCGGGACCTGAA-3’
LIMK2-R 5’-GTGACAGCCCAAAGTCGGCTA-3’
GAPDH-F 5’-TGTGTCCGTCGTGGATCTGA-3’
GAPDH-R 5’-TTGCTGTTGAAGTCGCAGGAG-3’
2)反转录反应：使用PrimeScriptTM RT reagent Kit合成cDNA
去除基因组DNA反应：于冰上配置Master Mix，以每管3μL分装到200mLEP管中，加入RNA和Rnase Free Water至总体积为10μL，室温孵育30min。反转录反应：于冰上配置Master Mix，加入i中的反应液10μL，轻柔混合组成20μL的逆转录反应体系，立即放入热循环仪中进行逆转录反应。
3)PCR反应：使用Premix Ex TaqTM II进行PCR反应。
PCR反应板中每孔加入SYBR Premix Ex Taq II 10μL、PCR上下游引物各0.8μL、DNA模板2μL，灭菌双蒸水6.4μL，组成20μL的反应体系，采用LC480PCR反应仪进行PCR反应。
2.3.4统计分析
采用统计分析软件SPSS 22.0对数据进行重复测量设计资料的方差分析。α＝0.05。
2.4RNA干扰后的LIMK2蛋白的Western-blot检测
2.4.1使用siRNA转染MLO-Y4骨细胞样细胞
1)分组设计
组1：使用siRNA1(R1)转染
组2：使用siRNA2(R2)转染
组3：使用siRNA3(R3)转染
组4：使用阴性对照siRNA转染
组5：空白对照
2)转染过程同上
2.4.2提取细胞总蛋白及蛋白浓度检测
1)细胞用预冷的DPBS洗涤3次，吸净DPBS后置于冰上。
2)以RIPA:PMSF＝100:1配置裂解液，6孔板每孔加入30μL的裂解液，于冰上裂解30min，摇床慢摇，收集入EP管中，14000rpm，4℃离心30min，上清保存于-80℃备用。
3)用BCA蛋白定量试剂盒检测蛋白浓度
按照说明书制备标准品，每个浓度设置2个复孔；将样本按照2μL+18μLDPBS稀释，每个样本设置2个复孔。配置BCA工作液，加入BCA工作液混合后，37℃孵育30min。冷却至室温3～5min，酶标仪562吸光度测定吸光值，分析，计算定量后加入loading buffer(5×)，离心混匀，煮沸变性，置于-20℃保存。
2.4.3SDS-PAGE胶的制备及电泳
SDS-PAGE胶的制备的具体方法见上。加样、电泳：将电泳缓冲液倒入电泳槽，拔梳后冲洗胶孔，取20μL样品快速上样。在浓缩胶内电泳电压为70V，等溴酚蓝进入分离胶以后将电压提高到120V电泳约90min，至溴酚兰到达分离胶的底部结束电泳。
2.4.4转膜
把海绵、滤纸与PVDF膜预先浸泡在转移缓冲液中约20min。电泳结束后，小心揭胶，去掉积层胶部分，右下方切角标记，把胶放入转移缓冲液中平衡20min。从负极到正极按海绵-滤纸-凝胶-PVDF膜-滤纸-海绵的顺序将电转移装置安装，固定好后放置于转移槽内，PVDF膜朝向正极，加入转移缓冲液及冰盒，以恒流200mA转移1h。
2.4.5抗体孵育
一抗：LIMK2用抗体稀释液1:2000稀释，GAPDH用抗体稀释液1:1500稀释；二抗：用含5％脱脂奶粉的TBST以1:1000稀释。转膜结束后，用TBST将PVDF膜洗5min×3次。用含5％脱脂奶粉的TBST封闭60min， 剪膜，加入稀释的一抗，于4℃摇床孵育16h。TBST洗膜3次，5min/次。加入稀释的二抗(HRP标记)，室温摇床孵育1h。TBST洗膜5min×3次。
2.4.6显影、曝光
将显影液滴加到PVDF膜表面，避光孵育3～5min，在ImageQuantLas4000成像系统中连续曝光，拍照。
2.4.7结果分析
Western Blotting结束后，使用Image J分析各蛋白条带的灰度值。采用统计分析软件SPSS 22.0对数据进行重复测量设计资料的方差分析。α＝0.05。
2.5CCK8法检测siRNA转染后MLO-Y4骨细胞样细胞的增殖活性
2.5.1分组：siRNA2(R2)转染组，未转染组。
2.5.2细胞接种及检测：细胞计数，制备成密度为4×104/mL细胞悬液，接种到96孔板中，每孔加入100μL，同一个样本5个复孔。37℃培养箱中培养2～4h贴壁，于接种后12、24、48、72h加入10μLCCK8检测试剂，培养2h，测定450nm吸光度。
2.5.3统计及分析
使用酶标仪得到各处理组OD值。采用SPSS20.0统计软件，多组间比较采用单因素方差分析。检验水准α＝0.05。
2.6RNA干扰抑制LIMK2后对MLO-Y4骨细胞样细胞在流体剪切力作用下细胞骨架改建的影响
2.6.1MLO-Y4骨细胞样细胞的转染
1)分组设计
组1(FSS(+)，LIMK2siRNA组)：siRNA2(R2)转染，加载1h
组2(FSS(+)，NC siRNA组)：阴性对照RNA转染，加载1h
组3(FSS(-)，LIMK2siRNA组)：siRNA2(R2)转染，不加载
组4(FSS(-)，LIMK2siRNA组)：阴性对照RNA转染，不加载
2)鼠尾I型胶原包被载玻片及细胞接种
按3800ΜL/每板将鼠尾I型胶原均匀包被无菌载玻片，室温孵育1h，DPBS漂洗三次，将转染24h后的细胞消化，制成细胞悬液，以每张玻片36×104的密度接种，置于培养箱中培养。
2.6.2细胞加载
将接种有细胞的玻片放入平行平板，打开蠕动泵，产生大小为12dynes/cm2的流体剪切力加载MLO-Y4骨细胞样细胞1h以含1％FBS+1％CS的α-MEM作为灌流液。除不进行流体剪切力加载外，非加载组细胞与加载组处理相同。
2.6.3固定、染色、观察
每组细胞加载完成后立刻用预温的PBS冲洗2遍。室温下，用溶解于PBS的甲醇固定10min，以PBS洗2次。用0.1％Tritonx-100透化处理5min，PBS洗2次。稀释Phalloidin，每5μL的Phalloidin加入200μLPBS，再加入1％BSA，每张玻片加入15μL的Phalloidin工作液，室温染色20min，PBS洗2次。加入DAPI工作液，染色10min，PBS洗3次。倒置荧光显微镜观察，拍照。
2.6.4统计分析
对各组荧光图片进行肌动蛋白细胞骨架荧光强度定量，每个细胞的平均荧光强度(平均荧光强度＝荧光强度/细胞面积)，采用统计软件SPSS22.0进行单因素方差分析。α＝0.05。
2.7PGE2检测
2.7.1实验分组
组1：siRNA2(R2)转染，加载1h
组2：阴性对照RNA转染，加载1h
组3：siRNA2(R2)转染，不加载
组4：阴性对照RNA转染，不加载
2.7.2样本收集
转染、接种、加载过程同上。在加载后5min、10min、20、40、60min 分别收集500μL培养基，1000rpm离心2min去除杂质后置于-80℃冰箱备用。在加载完毕后，将玻片上的细胞消化，计数。
2.7.3加样及检测
1)Performing the Assay
按照下表在ELISA反板中加样(μL)：
2)Development of the Plate
吸干孔中的液体，Wash Buffer洗5次，每孔加入200μL的Ellman’sReagent，TA孔加入5μL的Tracer，避光，室温下摇床孵育90min。
3)Reading the Plate：将孔板放入酶标仪中，410nm吸光度检测。
2.7.4统计分析
使用酶标仪得到各处理组OD值。采用统计分析软件SPSS 22.0对数据进行单因素方差分析。α＝0.05。
2.8MLO-Y4骨细胞样细胞力学敏感性基因COX-2的mRNA检测
2.8.1实验分组
组1(FSS(+)，siRNA组)：siRNA2(R2)转染，加载1h
组2(FSS(+)，NC siRNA组)：阴性对照RNA转染，加载1h
组3(FSS(-)，siRNA组)：siRNA2(R2)转染，不加载
组4(FSS(-)，NC siRNA组)：阴性对照RNA转染，不加载
2.8.2样本收集
转染、接种、加载过程同上。在加载完成后，提取细胞总RNA，-80℃储存备用。
2.8.3 qRT-PCR检测
1)引物的设计合成:在GenBank中查找小鼠的COX-2的cDNA序列。设计并由广州瑞真合成引物：
COX-2-F 5’-CTGGAACATGGACTCACTCAGTTTG-3’
COX-2-R 5’-AGGCCTTTGCCACTGCTTGTA-3’
GAPDH-F 5’-TGTGTCCGTCGTGGATCTGA-3’
GAPDH-R 5’-TTGCTGTTGAAGTCGCAGGAG-3’
2)使用PrimeScriptTM RT reagent Kit合成cDNA，使用Premix ExTaqTM II进行PCR反应
2.8.4统计分析
荧光定量PCR反应结束后，由计算机自动分析扩增曲线并计算结果。采用统计分析软件SPSS 22.0对实验数据进行双因素方差分析，α＝0.05。
3.试验结果
3.1脂质体介导的siRNA转染MLO-Y4骨样细胞系的转染效率
采用FAM标记的阴性siRNA转染MLO-Y4骨样细胞系后，荧光显微镜下可见较多细胞内荧光(如图1所示)，只加入LipofectamineTM2000的对照组无荧光，各组中阳性细胞数、总细胞数和死细胞数见表1。组1、7、8的转染效率均达到了90％以上，其中组1的LipofectamineTM2000脂质体用量最小，故选用组1的siRNA、脂质体用量用于后续实验，即24孔板，每孔siRNA用量为0.5μL，LipofectamineTM2000脂质体用量为0.5μL。镜下可见较多细胞内荧光，荧光在胞内呈点状散在分布，可见细胞胞体形态呈多角形(×100)。
表1不同浓度siRNA/脂质体转染MLO-Y4骨样细胞系的转染效率
3.2 siRNA转染对MLO-Y4骨样细胞系LIMK2 mRNA表达的影响
LIMK2特异性siRNA序列R1、R2、R3转染MLO-Y4骨样细胞系24h、48h后，qRT-PCR检测LIMK2 mRNA表达水平。方差分析结果显示，三条siRNA序列转染处理和检测时间点时间不存在交互作用(P＞0.05)。随即进行三条siRNA序列与对照组的两两比较，发现组间差异有统计学意义(P＜0.01)，其中siRNA序列R2对LIMK2 mRNA的抑制效果最好。具体结果如图2所示。
3.3 siRNA转染对MLO-Y4骨样细胞系LIMK2蛋白表达的影响
LIMK2特异性siRNA序列R1、R2、R3转染MLO-Y4骨样细胞系24h、36h、48h、72h后，Western Blotting检测LIMK2蛋白表达水平。方差分析结果显示，三条siRNA序列转染处理和检测时间点时间存在交互作用(P＜0.01)。进一步分析发现，siRNA序列R2在转染36h之后对LIMK2蛋白的抑制已达到60％以上，可被认为已达到siRNA的抑制效果，且在三条序列中对LIMK2 mRNA的抑制效果最好，故选择序列2进行后续实验，FSS加载时间应在转染后至少36h后进行。具体结果如图3所示。
3.4 siRNA转染对MLO-Y4骨样细胞系的增殖活性的影响
采用CCK-8检测LIMK2特异性siRNA序列2转染MLO-Y4骨样细胞系对细胞增殖活性的影响，发现与未进行转染的对照组相比较，siRNA转染，抑制LIMK2蛋白的表达不会影响细胞的增殖活性，具体结果如图4所示。
3.5 RNA干扰抑制LIMK2后对MLO-Y4骨样细胞系在流体剪切力作用下 细胞骨架改建的影响
如图5、图6所示，结果表明，RNA干扰抑制LIMK2蛋白表达后，可以抑 制MLO-Y4骨样细胞系在流体剪切力作用下的细胞骨架改建。倒置荧光显微镜下，可见F-Actin呈绿色荧光，在FSS(-)组(即FSS非加载组)，无论是否转染，F-Actin绿色荧光较弱，呈不连续的弥散状，在FSS(+)组(即FSS加载组)，采用NC siRNA(也即阴性对照RNA)转染的细胞，在流体剪切力作用下，细胞骨架发生改建，可见F-Actin呈细丝状排列，而采用LIMK2特异性siRNA2转染的细胞，在流体剪切力的作用下F-Actin未发生改建，呈与FSS(-)相似的弥散状。Image J对肌动蛋白细胞骨架荧光强度进行分析，显示RNA干扰抑制LIMK2蛋白表达后，细胞骨架荧光强度是非抑制组的1/2，二者的差异有统计学意义(P＜0.01)。
3.6 RNA干扰抑制MLO-Y4骨样细胞系在流体剪切力作用下细胞骨架改建 后，对MLO-Y4骨样细胞系前列腺素2释放的影响
结果表明，流体剪切力可以促进MLO-Y4骨样细胞系的PGE2释放，与阴性对照siRNA转染的骨细胞相比较，RNA干扰抑制MLO-Y4骨样细胞系在流体剪切力作用下细胞骨架改建后，PGE2释放增加，且随着时间的推移，PGE2持续释放。非加载组因PGE2浓度太低，无法检测，数据未呈现于本文。具体结果如图7所示。
3.7 RNA干扰抑制MLO-Y4骨样细胞系在流体剪切力作用下细胞骨架改建 后，对MLO-Y4骨样细胞系力学敏感性相关基因COX-2的mRNA表达的 影响
图8显示：FSS(+)组的COX-2 mRNA相对表达水平较FSS(-)组高，在FSS(+)组，siRNA组COX-2的表达水平较NC siRNA组高，差异有统计学意义(P＜0.01)。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。