技术领域
本发明涉及生物人工器官领域，所述生物人工器官是可植入的， 并且其特别地为用于包封分泌有意义的物质的细胞的腔室的形式。使 得该包封腔室和生物人工器官能够被制造的膜也是本发明的主题。
背景技术
对需要持续向身体供应有治疗意义的物质的病理状态的治疗，使 得有必要开发可以被植入患者中且能够有效释放这些物质并且有时能 持续较长一段时间的装置。
为了满足这种需求，已开发了容纳产生一种或多种有治疗意义的 物质的细胞的生物人工器官。生物人工器官中容纳的细胞被限制在内 部空间或者包封腔室中，由至少一个半透膜划界。当这种膜允许有治 疗意义的物质扩散出包封腔室至患者体内的靶细胞，同时抗体和患者 免疫系统的细胞不能透过，从而阻止它们直接贴附产生有治疗意义的 物质的细胞时，则这种膜被称为“半透的”。
生物人工器官被理解为是一种装置，其特别地旨在被植入患者中， 其包含由至少一个半透膜组成的至少一个包封腔室；所述包封腔室旨 在容纳分泌一种或多种有治疗意义的物质的细胞。
这些有治疗意义的物质为旨在在患者中具有有益作用的任何物质。 因此，这些物质可以为神经递质、激素、生长因子、凝血因子或细胞 因子。特别地，这些物质可以为，但不限于胰岛素、胰高血糖素、生 长激素、凝血因子IX、凝血辅因子VIII或降钙素。
装置的示例(生物人工器官、半透膜、包封腔室)在现有技术中 是已知的。
因此，可以提及WO02/060409，其描述了一种由多孔聚碳酸酯生 物相容性薄膜组成的膜及其用于制造生物人工器官的用途，所述多孔 聚碳酸酯生物相容性薄膜通过生成极性位点被表面修饰，并用至少一 个亲水性聚合物层覆盖。
WO2012/017337和FR2960783描述了一种功能化的半透膜，以 及其特别地用于制造生物人工器官和包封腔室的用途，所述功能化的 半透膜由多孔生物相容性支持物组成，所述支持物被预处理从而增加 其表面能，并且包含至少两层，每层包含亲水性聚合物和至少一种生 物活性分子。
这些文件中公开的膜没有呈现本文公开的两层(多孔生物相容性 聚合物和无纺聚合物)。鉴于FR2960783的图2，这是显而易见的，该 图显示亲水性层(3)已被沉积在唯一的多孔生物相容性聚合物层(2) 上。还注意到，在如下所描述的本申请的文本中，该亲水性层是设想 的。
WO2012/010767描述了一种用于形成可植入人工器官的袋子(bag) (或者贮袋(pouch)或囊(pocket))，其包含由半透膜构成的封闭壳 体(shell)。这种袋子还包含在壳体中含有的薄片(sheet)，所述薄片 在其表面上包含突出物(突起)，所述突出物用于维持薄片和壳体之间 的留给细胞的空间。
US20060067917没有描述本文公开的膜和包封腔室。D2装置在其 设计上不同于本文公开的装置，并且不可能与本申请的包封腔室相混 淆，因为D2装置的膜为单层膜(图1的104、106和112)。
WO2000/060051描述了一种包封腔室，所述包封腔室的半透膜可 以由不同材料和聚合物构成(参见该文献的第21页第15行至第22页 第23行)。还应当注意，WO2000/060051设想了各种材料在大型包封 装置中的使用，以维持细胞(参见第21页第30行至第22页第11行)。
然而，有必要向外科医生提供新型生物人工器官，其特别地显示 出有利的生物力学特性，即，植入后良好的耐受性。这是因为生物人 工器官通常旨在被植入腹膜内空腔或腹膜外间隙中，并且由于接受的 患者的运动，其容易受到张力或剪切力。
此外，这些生物人工器官必须能够容纳大量细胞，以便在植入患 者中之后能够具有长期的生理作用。因此，有必要设计大到足够实现 这点的器官，但是这样它们就会具有缺点，即，在植入后由于患者的 运动，它们有撕裂的风险(这种问题对于只容纳有限数量的细胞的微 型器官来讲不那么明显)。增加膜的厚度以提高机械强度不能作为一种 解决方案，因为当膜的厚度增加时，有意义的分子的扩散大幅减少。
因此，开发用于制造生物人工器官的具有改善的机械性能的新型 半透膜是可取的。至少必须保留选择渗透性质。
发明内容
在第一个实施方案中，本发明因此涉及用于包封产生至少一种有 治疗意义的物质的分泌细胞的腔室，其包含由半透膜构成的封闭壳体， 划出能够容纳产生至少一种有治疗意义的物质的分泌细胞的空间，其 特征在于所述膜包含至少一个多孔生物相容性聚合物层，和一个无纺 生物相容性聚合物层。
以上引用的文献既没有描述也没有启示这样的用于分泌细胞的包 封腔室，其包含半透膜，所述膜包含至少一层多孔生物相容性聚合物， 和另一层无纺生物相容性聚合物。
此外，正如将在实施例(特别是实施例7和8)中所见，当在生物 人工器官中使用时，特别是在体内植入之后，所公开的腔室显示了更 高的机械耐受性。
应当指出，术语“生物相容性”是指一种材料，其被活的生物体良 好耐受，并且其不引起排异反应、毒性反应、损伤或对后者生物学功 能的有害作用。这不排除由于材料嵌入生物体的炎性反应的可能性， 或者在包含外源性细胞的生物相容性器官的情况下的免疫反应的可能 性；因此，这种免疫反应不是由于器官本身，而是由于其内容物(由 外源性细胞分泌趋化因子)。
如上所见，所述半透膜具有截留阈值，具有高于该截留阈值的重 量的分子不能穿过该膜，而具有低于该截留阈值的重量的分子则可以 穿过该膜。根据本领域技术人员希望阻止或允许透过的分子的特性， 由他们进行截留阈值的确定。
在一个优选的实施方案中，为了允许小分子如胰岛素、胰高血糖 素或葡萄糖通过，并阻止免疫系统的效应分子(如细胞因子)，该截留 阈值为100kDa至500kDa，更优选为100kDa至150kDa。
多孔聚合物的孔的内径使得能够获得期望的截留阈值。因此，在 一个特别的情况中，在多孔生物相容性聚合物的层上存在的孔的内径 为5至100nm，更优选为5至50nm。
无纺聚合物
应当指出，无纺聚合物(无纺的)是这样的，即，其纤维保持无 规则。因此，其为一种薄片，所述薄片由以特定方向或随机取向的、 通过摩擦和/或内聚和/或粘附结合的纤维组成。因此，所述纤维被统计 学(statistically)排列，即，被随机地沉积。因此，由于纤维的随机排 列，无纺聚合物对于物质是可透过的，并且对于可以在无纺聚合物中 扩散的物质的尺寸是没有控制的。
可以使用任何类型的聚合物纤维生产无纺聚合物。因此，可以提 及聚酯：PET(聚(对苯二甲酸乙二醇酯))、PBT(聚(对苯二甲酸丁 二醇酯))、PVC(聚(氯乙烯))、PP(聚丙烯)、PE(聚乙烯)或这些 聚合物的混合物。
还可以使用聚酰胺或聚碳酸酯生产无纺聚合物。
优选地，所述无纺聚合物选自聚碳酸酯(PC)、聚酯、聚乙烯亚胺、 聚丙烯(PP)、聚(对苯二甲酸乙二醇酯)(PET)、聚(氯乙烯)(PVC)、 聚酰胺和聚乙烯(PE)。还可以使用这些聚合物的混合物生产无纺聚合 物。特别优选聚(对苯二甲酸乙二醇酯)(PET)。
通常，通过熔喷法获得这种无纺聚合物。其组分是已被“熔喷”的 微纤维的缠绕物。
这种生产方法特别适合于可以熔融纺丝的聚合物，特别是聚丙烯、 聚(对苯二甲酸乙二醇酯)、聚酰胺或聚乙烯。
这种方法产生具有更大机械强度的无纺物。
在一个特别的实施方案中，所述膜包含两层多孔生物相容性聚合 物，位于生物相容性无纺聚合物层的两侧。因此，该生物相容性无纺 聚合物层位于(located)、放置于(positioned)或处于(situated)这两 个多孔生物相容性聚合物层之间。
这样一种实施方案使得能够优化装置的强度。事实上，这层无纺 物可以被认为表现得像“海绵”，使其能够吸收冲击力并变形，从而增 加膜的原位刚性，但是，在细胞存在时其结果可能是麻烦的，所述细 胞可能有倾向在这种无纺物周围形成聚集物。因此，使无纺物层位于 生物相容性聚合物的两个多孔层之间使得能够阻止细胞的聚集，同时 给装置带来额外的保护/强度，并且对生物物质的分子扩散没有影响。
多孔生物聚合物和无纺生物聚合物没有必要相同。
同样地，在两层多孔生物聚合物存在时，后者可以是相同的聚合 物或不同的聚合物。
多孔生物相容性聚合物
多孔生物相容性聚合物由本领域技术人员已知的聚合物组成。因 此，其可以选自聚碳酸酯(PC)、聚酯、聚乙烯亚胺、聚丙烯(PP)、 聚(对苯二甲酸乙二醇酯)(PET)、聚(氯乙烯)(PVC)、聚酰胺和聚 乙烯(PE)。
在一个特别的实施方案中，至少一层或两层(酌情)是由聚(对 苯二甲酸乙二醇酯)(PET)构成。
通过任何本领域已知的方法进行孔的形成。特别地，可以使用电 子轰击法或重离子轰击法(在专利US4956219中特别描述了第二种 技术)。在重离子轰击的情况下，在生物相容性支持物的表面上轰击的 重离子的密度决定了孔的密度，同时化学侵蚀处理时间决定了孔的尺 寸。
因此，使用“径迹刻蚀(track-etching)”工艺制备膜，所述工艺是 现有技术已知的，并且被特别地描述于专利US4956219、DE19536033 或CH701975中。
这种技术在于利用高能重离子照射聚合物膜，导致形成以该聚合 物的局部降解为特征的线状潜在痕迹；然后，利用选择性化学侵蚀使 这些痕迹以孔的形式显现。
使用重离子束照射膜。所述重离子穿过聚合物薄膜的整个层。在 穿过聚合物时，重离子破坏或切割聚合物链，从而形成穿过材料的光 滑的直开口。孔的最终排列取决于照射过程期间重离子束相对于聚合 物薄膜的角度。因此，重离子束可以垂直于聚合物薄膜或者呈任何其 他的角度。
在下一步中，使薄膜通过强酸(如硝酸)浴，并且在与碱性溶液 如氢氧化钠或氢氧化钾接触后，开口变为孔。
不同于薄膜的其余部分，由离子造成的这些开口允许碱性溶液通 过，所述碱性溶液将它们填充，并通过去除这些开口周围的材料(聚 合物)允许孔的刻蚀。
孔的尺寸由碱性溶液的浓度、接触时间和溶液的温度控制。
如果使用聚酯或聚碳酸酯，所获得的膜是亲水性的，其可以原样 使用，也可以使用表面处理工艺(等离子体、喷涂或涂布)处理。
在专利US4956219和CH701975中更精确地描述了根据这种“径 迹刻蚀”技术的膜的制备。
这种技术能够生产多孔聚合物膜，特别地所述膜的特征在于平整 的表面和窄的截留阈值。
使用通过这种技术获得的膜的优势是非常精确的孔的尺寸、孔的 数量和孔的形状。
孔优选为圆柱形，但是这种技术也可以获得其他形状的孔，如圆 锥形的。
优选地，孔呈直线，并且相对于垂直方向呈10°至45°角，但是也 可以呈>45°或<10°角。这些角度根据膜的轰击期间离子束的角度获得。
这种技术适用于各种材料，如聚碳酸酯(PC)、聚酯(PET)或聚 酰亚胺(PI)。还可以使用聚酰胺、聚(偏二氟乙烯)、聚丙烯酸酯或 聚烯烃类。
这种方法使得能够容易地获得具有0.02μm至15μm的受控尺寸 的孔，103孔/cm2至1010孔/cm2的孔密度，和具有5μm至80μm的 厚度的膜。
应当注意，如果在生物相容性聚合物上不作形成孔的处理，该聚 合物将保持对任何物质都不能渗透，并且将不允许有意义的物质从生 物相容性器官的内部向外部扩散。孔仅允许截留阈值以下的物质(即， 小于孔径物质)的扩散。
因此，显然无纺生物相容性聚合物层和多孔生物相容性聚合物层 是不同的层，其由不同的材料构成，并且呈现不同的性质(特别是对 于物质从每一层的穿过和扩散)。
在一个优选的实施方案中，使至少一个膜的多孔生物相容性聚合 物层呈亲水性。可以通过在该多孔生物相容性聚合物层的表面上产生 极性位点以获得亲水性质。可以通过物理手段(如在表面产生带电的 极性位点，特别是通过在大气压或真空下的等离子体表面处理、电晕 放电或电磁放电产生)或化学手段(可以设想碱处理，特别是用氢氧 化钠处理)进行这种表面修饰。
优选地，使用射频(radiofrequency)氩气、氢气、氧气或空气等 离子处理多孔生物相容性聚合物层。可以将其以每升反应器容量3至 10瓦的等离子体反应器发射功率处理，持续约1至20分钟。还可以以 相同的功率使用微波等离子体进行该处理，但是持续5秒至20分钟。 优选地，在真空下进行等离子体处理。
专利申请WO02/060409和WO2012/017337特别描述了用于在多 孔生物相容性聚合物上引入极性位点的等离子体表面处理。
在已使至少一个多孔生物相容性生物聚合物层呈亲水性之后，可 以使用至少一个亲水性聚合物层，或者甚至两个不同的亲水性聚合物 层将其覆盖。在至少一个亲水性聚合物层中可以任选地含有活性分子。
WO02/060409和WO2012/017337还描述了在多孔生物相容性聚 合物的表面上加入至少一种亲水性聚合物，所述表面已被处理(特别 是通过加入极性位点)使其呈亲水性。
亲水性聚合物
对于本发明的目的，构成亲水性聚合物的是聚合物或聚合物的混 合物，在应用于多孔生物相容性聚合物的薄膜上之后，在根据WO 02/060409的实施例2中描述的“静滴(sessiledrop)”测试测量后，其 具有小于40°，优选小于30°的角度值。
应当注意，根据“静滴”测试的角度值可以根据聚合物的处理而变 化。因此，对于生物相容性生物聚合物可以观察到小于20°(约16-17°) 的接触角，当进行两种等离子体处理时，当在两种等离子体处理后沉 积亲水性聚合物(特别是HPMC)时，该角度增大(通常小于30°)。 如果使用还含有具有生物活性的分子的亲水性聚合物的混合物(特别 是HPMC、乙基纤维素+肝素混合物)，该角度可能大于30°，但依然小 于40°。
优选地，所述亲水性聚合物可溶于水。这是因为，由于生物人工 器官在宿主生物体体内的植入，排除了有机溶剂的使用，因为它们的 彻底清除是困难的，并且它们的存在(即使是少量的)与在人或动物 中的治疗或外科使用不相容。
优选地，所述亲水性聚合物材料选自以下亲水性聚合物：
-纤维素及其衍生物，如乙基纤维素(EC)、羟丙基甲基纤维素 (HPMC)或羧甲基纤维素(CMC)；
-聚丙烯酰胺类及其共聚物类；
-聚乙烯吡咯烷酮(PVP)及其共聚物类；
-聚乙烯醇类；
-乙酸乙烯酯共聚物类，如聚(乙酸乙烯酯)/聚(乙烯醇)共聚 物；
-聚乙二醇类；
-丙二醇类；
-亲水性聚(甲基)丙烯酸酯类；
-多糖类；
-壳聚糖类。
作为亲水性聚合物，使用由如上所定义的一种亲水性聚合物组成 的聚合物材料，和以上几种亲水性聚合物的混合物，通常是以上两种 或三种亲水性聚合物的混合物。
优选地，亲水性聚合物选自基于纤维素的化合物，特别是HPMC、 EC、TEC或CMC、聚乙烯吡咯烷酮类、聚(乙烯醇)类、或聚丙烯 酸酯类如聚(丙烯酸羟乙酯)(HEA)或丙烯酸共聚物类。
亲水性聚合物还可以由以上提及的两种或多种亲水性聚合物的混 合物，特别是HPMC和CMC的混合物，或HPMC和EC的混合物组 成。
优选纤维素类和纤维素衍生物，特别是羟丙基甲基纤维素(HPMC)。
膜层压
为了更大的机械稳定性，使用由无纺物制成的膜加固多孔生物相 容性聚合物膜。
优选地，使用本领域已知的方法，通过层压例如粘合剂存在或不 存在，优选不存在粘合剂下的热层压，进行无纺聚合物和生物相容性 聚合物的多孔膜的组合。
因此，经由有纺(woven)或无纺聚合物和生物相容性多孔聚合物 的多层体系交替层，可以改进膜的加固。然而，应当避免任何扩散性 能的降低。
特别地，可以通过将具有高孔密度的薄功能膜与具有低孔密度的 厚保护膜组合，提高机械稳定性。
对于用于制造膜的聚合物的层数没有限制。
活性分子
如上所述，沉积在多孔生物相容性聚合物层上的亲水性聚合物可 以任选地含有活性分子。
将这种“活性分子”与亲水性聚合物混合。其旨在被释放至半透 膜周围的介质中，特别是为了减少由于植入生物人工器官引起的炎症， 和/或诱导接受生物人工器官的患者的组织的正向应答(特别是增加的 血管化)。
因此，所述活性分子选自抗炎剂、抗感染剂、麻醉剂、生长因子、 刺激血管生成和/或诱导血管化的试剂、诱导愈合的试剂、免疫抑制剂、 抗血栓形成剂包括抗聚集剂(antiaggregant)和抗凝剂、血管紧张素转 化酶(ACE)抑制剂、或刺激胰岛素分泌的任何分子(IGF、胰高血糖 素样肽-1(GLP-1)或其衍生物、肠降糖素模拟物)。
在抗炎剂中，可以提及非甾体类抗炎药(NSAIDs)，如对乙酰氨 基酚、氨基水杨酸、阿司匹林、塞来昔布、胆碱三水杨酸镁、双氯芬 酸、二氟尼柳、依托度酸、氟比洛芬、布洛芬、吲哚美辛、白细胞介 素IL-10、IL-6突变蛋白、抗IL-6(anti-IL-6)、NO合成酶抑制剂(例 如，L-NAME或L-NMDA)、干扰素、酮洛芬、酮咯酸、来氟米特、 甲灭酸、麦考酚酸、咪唑立宾、萘丁美酮、萘普生、奥沙普秦、吡罗 昔康、罗非考昔、双水杨酯、舒林酸和托美丁，以及皮质激素类如可 的松、氢化可的松、甲泼尼龙、泼尼松、泼尼松龙、倍他米松、二丙 酸倍他米松、戊酸倍他米松、二丙酸倍氯米松、布地奈德、地塞米松 磷酸钠、氟尼缩松、丙酸氟替卡松、紫杉醇、他克莫司、曲尼司特、 曲安奈德、醋酸氟轻松(fluocinoloneacetonide)、氟轻松醋酸酯 (fluocinonide)、地奈德、去羟米松、氟轻松、氟羟氢化泼尼松、丙酸 氯倍他索和地塞米松。布洛芬是特别合适且优选的。
优选使用抗血栓形成剂，如抗聚集剂(乙酰水杨酸、氯吡格雷、 噻氯匹定、双嘧达莫、阿昔单抗、依替巴肽和替罗非班)、抗凝剂(肝 素、比伐卢定、达比加群、来匹卢定(lepirudin)、磺达肝癸钠 (fondaparinux)、利伐沙班、依前列醇、华法林、苯丙香豆素 (phenprocoumon)、蛋白C、drotrecoginalfa、抗凝血酶、戊聚糖)、和 溶栓剂(阿替普酶、尿激酶、替奈普酶和瑞替普酶)。
特别优选使用肝素。
在另一个实施方案中，使用布洛芬。
此外，可以使用能够诱导生物人工器官周围的组织血管化的分子， 特别是PDGF(血小板衍化生长因子)、BMP(骨形态发生蛋白)、VEGF (血管内皮生长因子)、VPF(血管通透因子)、EGF(表皮生长因子)、 TGF(转化生长因子)和FGF(成纤维细胞生长因子)。
还可以使用IGF-1和IGF-2、神经营养因子(NGF)。
在一个特别的实施方案中，选择通过诱导血管生成促进血管化的 细胞生长因子，如碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、血管内皮生长因 子(VEGF)、血小板衍化内皮细胞生长因子(PDGFA或B)、骨形态 发生蛋白(BMP2或4)、或肝细胞生长因子(HGF)。
为了制备亲水性聚合物和生物活性分子的层，将亲水性聚合物或 亲水性聚合物的混合物溶解于水中。
根据WO02/060409和WO2012/017337中描述的方法，将任选含 有活性分子的亲水性聚合物加入至多孔生物相容性聚合物层中。
在另一个实施方案中，如WO2012/017337中所描述，在多孔生物 相容性聚合物的表面上，可以加入两层，每层都包含亲水性聚合物和 至少一种生物活性分子。
生物相容性膜的物理性质
在优选的实施方案中，根据本发明的膜包含两层多孔生物相容性 聚合物，每层用至少一种亲水性聚合物覆盖，其围绕着无纺物层。
孔径和密度
如上所见，使用本领域已知的方法向每个多孔生物相容性聚合物 层中引入孔。优选至少所述多孔生物相容性聚合物层(如果其为唯一 的一层)或两个多孔生物相容性聚合物层之一具有106孔/cm2以上，优 选107孔/cm2以上的孔密度。通常，该孔密度为1011孔/cm2以下，优选 1010孔/cm2以下。因此，使用可以具有优选106孔/cm2以上，更优选107孔/cm2以上的孔密度的膜。该密度优选为1011孔/cm2以下，或者甚至 1010孔/cm2以下。因此，该密度为106孔/cm2至1011孔/cm2之间。优选 地，109孔/cm2以上且1010孔/cm2以下的密度是合适的。
如上所见，多孔生物相容性聚合物层的孔具有内径，使得它们允 许膜的半透性。
因此，两个多孔生物相容性聚合物层中的至少一个(或唯一的层 (如果是这种情况))具有孔，所述孔具有5以上优选10nm以上，且 100nm以下，优选10nm以上且50nm以下，更优选40nm以下的内 径。对于该多孔生物相容性聚合物层，90nm以下的孔径也是非常有 利的，因为这样的孔径维持了半透性性质，这是膜所寻求的。然后， 孔密度有利地大于为2.109孔/cm2以上且4.1010孔/cm2以下。
当膜具有两个多孔生物相容性聚合物层时，一个层的孔的内径优 选如上。
第二层的孔的内径可以更大，第一层的孔的直径给予了所期望尺 寸的截留作用。因此，第二层的孔的内径可以在100以上且2000nm 以下，优选200nm以上。这些孔优选具有1000nm以下的内径。优选 地，400以上且600nm以下，或约500nm的内部孔径是合适的。然后， 孔密度有利地为5.106孔/cm2以上且5.107孔/cm2以下。
当膜包含两个围绕着无纺物层的多孔生物相容性聚合物层时，包 封腔室优选是这样的，即，孔径最小的层处于腔室内侧(与产生至少 一种有治疗意义的物质的分泌细胞相接触)，而孔径最宽的层处于外侧 (与患者身体相接触)。
膜厚度
在一个优选的实施方案中，膜的总厚度(包含无纺聚合物层和多 孔聚合物层)为45μm以上。通常其优选为200μm以下，但是也可以 大于该尺寸；特别地，可以设想高达300μm，或甚至更大的厚度。优 选地，其为50μm以上。其还优选为150μm以下。因此，该膜通常具 有45至200μm的厚度。
当膜具有两个多孔生物相容性聚合物层时，所述层可以具有相同 厚度或具有不同厚度。
所述无纺聚合物层通常具有40μm以上，优选60μm以上，更优 选80μm以上的厚度。该层通常具有250μm以下，优选150μm以下 的厚度。因此，无纺聚合物层的厚度一般为40μm至150μm。
当膜仅具有一个生物相容性聚合物层时，则所述层具有5μm以上 的厚度。该层为200μm以下，优选100μm以下，然而，优选50μm 以下。
当膜具有两个多孔生物相容性聚合物层，且所述层具有不同厚度 时，则第一层的厚度为5μm以上。其还优选为200μm以下，但优选 40μm以下；优选地，15μm以下(且优选5μm以上)的厚度是合适 的。如果这两个层的内部孔径不同，该厚度优选为具有最小内径的孔 的层的厚度。
第二层的厚度通常为25μm以上。其优选200μm以下，优选100 μm以下，更优选50μm以下；优选地，30至50μm的厚度是合适的。
与膜的总厚度相比，任选存在于一个或两个多孔生物相容性聚合 物层上的每个亲水性聚合物层的厚度是可以忽略的。事实上，其优选 为500nm以下，并且通常为25至250nm。
在一个优选的实施方案中，所述膜具有两个多孔生物相容性聚合 物层，在无纺聚合物层的两侧。
在该实施方案中，一个多孔生物相容性聚合物层具有孔，所述孔 具有100nm以上，优选200nm以上，更优选400以上且1000nm以 下，更优选600nm以下的内径，优选有约5.107孔/cm2的密度。然后， 该层有利地为具有25至200μm的厚度的层(参见以上)。
另一个多孔生物相容性聚合物层具有孔，所述孔具有5nm以上， 优选10nm以上(并且通常100nm以下，优选50nm以下，优选40nm 以下)的内径，优选有约2.109孔/cm2以上的密度。该密度还优选地在 7.109孔/cm2以下。
该层有利地为具有5至200μm(优选5至15μm)的厚度的层。
包封腔室
本发明还涉及用于包封产生至少一种有治疗意义的物质的分泌细 胞的腔室，其包含由根据本发明的膜构成的封闭壳体，划出能够容纳 产生至少一种有治疗意义的物质的分泌细胞的空间。这种包封腔室还 可以被称作“贮袋”，并且使得能够形成可植入患者中的生物人工器官。
在一个特别的实施方案中，这种包封腔室还包含容纳于所述壳体 中的生物相容性薄片，所述薄片优选在其表面上包含突出物(也称作 突起)。这些突出物有利地用于维持薄片和壳体之间的留给细胞的空间， 但是也用于以均匀的和平面的方式分散细胞，从而使得能够最大化交 换表面。该薄片优选由硅酮制成。
在申请WO2012/010767中描述了这样的实施方案。因此，在一个 优选的实施方案中，所述壳体由两层膜形成，所述膜被热焊接在一起。 可以使用WO2012/010767中描述的方法，或者本领域已知的使用超声 波的热焊接方法。用于形成壳体的方法是简单的，并且使得能够将薄 片包封在壳体中。
腔室的形状
在一个优选的实施方案中，所述包封腔室为圆形的。这样的形状 有若干优点：
-在植入期间，没有能够造成细胞或炎性聚集的“角落”或凸出部 分，
-易于制造包封腔室(在热焊接前不需要使两个膜和薄片定向)。
在一个特别的实施方案中，所述包封腔室的直径为3cm以上，优 选5cm以上，或8cm以上。通常为20cm以下，优选15cm以下， 或14cm以下。优选地，8至14cm的直径是可接受的。
当腔室不为圆形时，通常其最大长度为3cm以上，优选5cm以 上，或8cm以上。通常为20cm以下，优选15cm以下，或14cm以 下。
腔室的体积
如上所见，当在包封腔室中引入产生至少一种有治疗意义的物质 的分泌细胞时，该包封腔室优选能够使得制造“大型(macro)”器官， 即，其允许所述细胞以有生理意义的水平(即，使得能够满足患者的 需要)分泌这种物质持续相当长的一段时间(3个月以上，优选6个月 以上)。因此，所述包封腔室应当能够容纳大量的细胞。
对于人类使用，通常预计包封腔室的优选内部体积应为15ml以上， 优选20ml以上，更优选25ml以上，并且可以达到50ml。对于其他 动物使用，体积将不同(例如，在大鼠中为约1ml)。
这种包封腔室必须能够容纳大量的细胞。在治疗糖尿病的情况下， 其必须能够包封至少500000个胰岛的等价物，优选700000个以上胰 岛的等价物，且任选地高达一百万个胰岛的等价物。已知一个胰岛平 均含有约1000个细胞，这给出了根据本发明的包封腔室可以容纳的细 胞的数量的估计值。
根据期望包封并植入患者中的细胞的类型，细胞的数量将显著变 化。
在一个优选的实施方案中，形成包封腔室的膜包含两个多孔生物 相容性聚合物层，所述层在无纺聚合物的两侧。在该实施方案中，优 选地，至少内层(在形成腔室后处于腔室内)为其上的孔提供膜的半 透性(截留阈值)的层，即，其具有孔，所述孔具有5nm以上(并且 通常100nm以下)的内径或具有以上提及的其他大小。
壳体外部的层(与患者的组织和细胞相接触)可以具有较大内径 的孔，特别是100nm以上，但优选2000nm以下，或具有以上提及的 其他大小。
在一个实施方案中，如WO2012/010767中所描述，所述包封腔室 可以包含至少一个连接件(connector)(特别是附着于壳体和/或薄片)， 其使得能够建立壳体外部和内部之间的联系。将这些连接件连接至柔 性管使得能够填充和清空腔室。
生物人工器官
因此，本发明涉及一种生物人工器官，其包含至少一个根据本发 明的包封腔室。这种生物人工器官还有利地存在连接至连接件且使得 能够填充和清空生物人工器官的管，当生物人工器官被植入患者中时， 所述管使得能够更新该生物人工器官的内容物而无需进行移出。
这种生物人工器官可以容纳各种细胞类型。
包封于生物人工器官中的细胞
存在于生物人工器官中的细胞产生至少一种有意义的生物活性物 质。当包封腔室旨在用于制造生物人工胰脏时，所述细胞可以特别地 为产生胰岛素的胰岛素分泌细胞或胰岛。
当包封腔室旨在用于制造生物人工肝脏时，所述细胞还可以为肝 细胞。
在一个特别的实施方案中，使用允许有意义的生物活性物质表达 的至少一种核酸转染或转化细胞。在有意义的生物活性物质中，可以 通过说明的方式提及胰岛素、细胞因子、肽类激素、生长激素、凝血 因子VIII和IX以及降钙素。
通常，术语“生物活性物质”是指一种物质，其由产生其的细胞 释放或分泌，并且其在宿主生物体中对靶细胞或靶分子发挥其作用， 例如神经递质、激素、生长因子、凝血因子或细胞因子。
可以使用各种各样的细胞，包括永生化细胞系，例如分裂细胞、 或其他多能干细胞的初级培养物。
例如，细胞可以为成肌细胞，其为来源于中胚层的干细胞群的肌 细胞前体，并且其可以容易地使用允许有意义的生物活性物质表达的 核酸将其转化。有利地，本领域技术人员可以参考例如WO94/02129、 WO93/03768或WO90/15863。
优选地，将容纳于根据本发明的包封腔室中的细胞嵌入基质中， 如IV型胶原基质或纤维蛋白基质中，在适当情况下与层粘连蛋白、巢 蛋白和硫酸乙酰肝素组合。
通常，可以将容纳于根据本发明的包封腔室中的细胞嵌入基质中， 所述基质由任何产品或产品的组合组成，所述产品允许将这些细胞以 可存活的形式固定。
还可以将产生至少一种有意义的生物活性物质的细胞包封于海藻 酸盐基质中。
包封腔室的制造
通过本领域已知的任何方法制造包封腔室。
优选使用WO2012/010767的教导，其应被认为是本申请的组成部 分。
因此，本发明涉及一种用于制造根据本发明的包封腔室的方法， 其包括热焊接根据本发明的两个膜(或者甚至折叠的膜)的步骤，以 这样的方式形成贮袋，所述贮袋旨在收纳产生至少一种有意义的生物 活性物质的细胞。
在一个特别的实施方案中，如上所见，所述包封腔室含有薄片， 还含有一个或多个连接件。在WO2012/010767中描述了用于制造这种 贮袋的方法。关于用于制造包封腔室的方法的更详细的解释，请读者 参考WO2012/010767。
附图说明
图1：在静态条件下，根据本发明的聚(对苯二甲酸乙二醇酯)(PET) 或聚碳酸酯(PC)膜对葡萄糖(A)、胰岛素(B)和IgG(C)的渗透 性，所述膜使用或未使用肝素、乙基纤维素(EC)和羟丙基甲基纤维 素(HPMC)处理。
图2：使用葡萄糖刺激的大鼠胰岛通过根据本发明的PET膜的胰 岛素分泌，所述膜使用或未使用肝素、EC和HPMC处理。观察到从4 小时开始的胰岛素扩散的开始，以及在24小时似乎通过表面处理改进 的渗透性。
图3：植入根据本发明的聚(对苯二甲酸乙二醇酯)(PET)或聚 碳酸酯(PC)膜30天后制备的截面图，所述膜使用或未使用肝素、EC 和HPMC处理。对于两种类型的膜，表面处理降低了纤维化和细胞浸 润(黑色箭头)，并且增强了血管化(*)。
图4：在猪中植入15天后生物人工器官的外观。一个装置由单层 PC膜组成，另一个由多层PET膜组成。具有PC膜的装置显示出宽的 撕裂。具有多层PET膜的装置就其本身而言没有显示出任何宏观损伤。 因此，通过扫描电子显微镜分析所述多层PET膜，没有显示显微裂纹。
具体实施方式
实施例
实施例1：半透膜的制造
如此制造膜，即，通过“径迹刻蚀”工艺由生物相容性PET薄膜 制备两个多孔PET(聚(对苯二甲酸乙二醇酯))层，然后与具有30 至60g/m2的密度的无纺PET层(位于两个多孔生物相容性PET层之 间)层压。不使用粘合剂进行热层压。多孔PET层之一具有2.109至 7.109孔/cm2的孔密度，以及10至30nm的内部孔径。该膜的厚度为8 至12μm。其他多孔PET层具有107至5.107孔/cm2的孔密度，以及400 至600nm的内部孔径。该膜的厚度为30至50μm。膜的总厚度为200 μm以下。
实施例2：膜的表面处理
使根据实施例1制备的膜经历根据WO2012/017337的实施例1的 方案的表面处理。
使用与乙基纤维素(EC)溶液混合的肝素的第一层将膜功能化， 然后使用羟丙基甲基纤维素(HPMC)层覆盖。
实施例3：膜的渗透性的表征
根据以下方案进行之前制备的膜的葡萄糖渗透性、胰岛素渗透性 和免疫球蛋白(IgG)渗透性测试：
材料
扩散腔室，其由以膜(需要测试其渗透性)隔开的顶部隔室和底 部隔室组成(由封条提供两个隔室之间的密封性)，葡萄糖(Fischer Scientific，伊尔基希，法国，编号：G/0500/53)，NaCl，IgG(Sigma， 里昂，法国，编号：I9640)，胰岛素(Sigma，编号:I9278)，蒸馏水。
溶液的制备
·生理盐水
对于1l：将9gNaCl溶解于1l蒸馏水中。
·葡萄糖(4g/l)
对于1l：将4g葡萄糖溶解于1l生理盐水中。
·IgG(5.75μg/ml)
对于60ml：将34.5μlIgG储备溶液(10mg/ml)稀释于59.966ml 生理盐水中。
·胰岛素(100μg/ml)
对于60ml：将60μl胰岛素储备溶液(10mg/ml)稀释于59.960ml 生理盐水中。
方案
将3ml生理盐水引入扩散腔室的底部隔室中，并将膜(需要测试 其渗透性)放置于生理盐水之上，同时避免气泡存在。将3ml葡萄糖 溶液引入顶部隔室中，然后使用封口膜将扩散腔室密封，并在37℃孵 育。
在孵育时间结束时，在轻轻匀化后将1ml在扩散腔室的顶部隔室 中含有的溶液移出。然后将膜移除，并在匀化后将1ml底部隔室的溶 液移出。
使用Glucose试剂盒(BioMérieux，克拉庞，法国，编号：61269)进行葡萄糖的酶测定。利用QuantiproBCA测定试剂盒(Sigma，编号：QPBCA-1KT)，使用二金鸡纳酸(bicinchonicacid，BCA)法测定胰岛素和IgG。结果表示为渗透百分比，以以下方式计算：
渗透性(作为％)＝(C底部隔室/C顶部隔室+C底部隔室)×100
C：葡萄糖、IgG或胰岛素的浓度。
在平衡状态下，顶部隔室和底部隔室中的浓度是相同的，其相当 于50％的最大渗透。
结果
结果示于图1。测试了根据本发明(实施例1)的多层聚(对苯二 甲酸乙二醇酯)(PET)膜，以及如WO02/060409或WO2012/017337 中描述的、由聚碳酸酯制成的且具有与EC混合的肝素层和HPMC层 的现有技术的膜。
对于PET膜，观察到较慢的胰岛素和葡萄糖的扩散。不希望受到 这种理论的约束，这可能是由于组成它们的多个层的存在造成的。
PET膜对于IgG是完全不能渗透的。
实施例4：半透膜植入测试
根据WO2012/017337的实施例3中描述的方案，将膜植入健康 Wistar大鼠的腹膜腔中。
然而，修改了涉及样品采集的方案，并以以下方式采集样品：
采集组织样品
使用的溶液
-在防护罩(hood)下，由25％戊二醛(Sigma，编号：G5882–10x10 ml)用超纯水稀释十倍制备的2.5％戊二醛。
-PBS(编号：Gibco–14190-094)。
-用4％多聚甲醛(Labonord，编号：PFFOR0060AF59001)预先 填充的锅。
所测试的膜为根据本发明的PET膜(多层)和现有技术的PC膜， 任选经受表面处理以沉积肝素、EC和HPMC。
结果示于图3：观察到对于两种类型的膜，使用肝素的表面处理降 低了纤维化和细胞浸润(黑色箭头)，并且增加了血管化(*)。
实施例5：通过膜的胰岛的葡萄糖刺激测试
a)大鼠胰岛的分离
所使用的动物
所使用的动物为重250-300g的雄性Wistar大鼠(JanvierLaboratory，LeGènesSt.法国)。在23±1℃的温度，55±3％的湿度和12h明12h暗的周期中，将大鼠置于标准集体笼中。SAFE-A04饲料(Villemoisson-sur-Orge，法国)和水可供自由采食。根据欧洲指令2010/63/EU进行动物实验。
胰腺的切除
以100μl/100g体重的剂量，腹膜内注射补充有2.7ml(活性成分：2％赛拉嗪，Centravet，编号:ROM001)的Imalgene(活性成分：氯胺酮，Centravet，编号:IMA004)混合物将动物麻醉。
在确认动物的反射消失后，将后者背朝下放置。然后进行剖腹手 术，并将胆管在其十二指肠开口处结扎。然后在其肝开口处插入导管， 并通过放血处死动物。然后利用导管，将4℃的1mg/ml的10mlXI 型胶原酶(Sigma，编号：C7657)注入胰腺中。
然后将胰腺切除，并置于含有3.75ml无菌“灌流溶液”的50ml Falcon管中。该溶液由500mlHBSS(Hanks平衡盐溶液，Lonza，编 号：BE10-527F)、2.1ml8.4％碳酸氢钠、1.175ml1M氯化钙和12.5ml 1MHEPES组成。为了限制切除期间酶的作用，将容纳胰腺的管置于 冰中。
消化
在切除胰腺后，立即将管置于37℃的水浴中持续10分钟。然后 将其剧烈搅拌几秒，以使组织充分分离。然后向其中补充冷的洗涤溶 液。所述洗涤溶液由补充有0.35g/l碳酸氢钠(Sigma，编号：S-5761)、 10％胎牛血清(FCS，Lonza，编号：DE14-801F)和1％抗霉菌抗生素 (AMAB，Fisher，编号：W3473M)的M199(Sigma，编号：M0393-50L) 组成。
在池(insert)(CorningNetwellinserts，Sigma，编号：CLS3480) 上过滤管的内容物，并将滤液转移至200mlCorning管中，在4℃以 1200rpm将Corning管离心1分钟。然后去除上清液，使用冷的洗涤 溶液将颗粒重新悬浮，然后转移至50mlFalcon管中。在4℃以1200rpm 离心1分钟后，去除最大量的上清液，然后进行纯化步骤。
纯化
使用不连续梯度的Ficoll(Fisher，编号:BP525-500)进行胰岛的 纯化，所述Ficoll由3种实验室中制备的不同密度的溶液组成：1.108 (Ficoll1):1.108、1.096(Ficoll2):1.096和1.069(Ficoll3):1.069。
将细胞颗粒重新悬浮于12mlFicoll1中，并在上面小心加入10 mlFicoll2和Ficoll3。最后，在Ficoll3上沉积5mlPBS(Fisher，编 号：20012-019)。在4℃以400rpm将整个集合离心4分钟，然后在4℃ 以2000rpm离心12分钟。离心机的减速速度和加速速度被调节至最小 以不打乱梯度。
从Ficoll2和Ficoll3之间的界面处重新获得胰岛，然后将胰岛在 冷的洗涤溶液中洗涤三次以去除Ficoll的痕迹。
培养
在37℃5％CO2的湿润气氛中，在未处理的25cm2培养瓶 (Dutscher，编号：690195)中，在含有10％FCS(Lonza，编号：DE14-801F) 和1％AMAB(Fisher，编号：W3473M)的M199基质(Gibco，编号： 23340-020)中培养胰岛持续24小时。
b)刺激测试
将十个大鼠胰岛置于池(圆柱的类型)中，所述池的一端连接有 PET膜。该膜的朝向是这样的，即，纳米多孔(nanoporous)膜(其具 有内径为10至50nm的孔，并且其对高达150kDa的分子是选择性的) 在池的内侧，与大鼠胰岛相接触，具有400至600nm直径的孔的层朝 向池的外侧。
池含有400μl含有10％FCS和2.5mM葡萄糖的Krebs溶液。将 这样填充的池置于24孔板的孔中，所述孔含有1ml含有10％FCS和 25mM葡萄糖的Krebs溶液。然后将24孔板在37℃孵育，并在1h、 2h、4h、6h、8h和24h采集孔中含有的基质的样品。然后使用ELISA 法(Mercodia，编号：1250-01)测定样品中的胰岛素。
还将胰岛采样并置于50μl补充有蛋白酶抑制剂(ThermoScientific， 编号：78441)的裂解缓冲液(ThermoScientific，编号：78501)中， 以提取总蛋白质。通过将管在冰上放置30min，同时定时将样品涡旋 振荡，进行提取。利用Bradford法确定胰岛的总蛋白质含量，该含量 用于将不同胰岛培养物之间的胰岛素分泌归一化。
实施例7：在猪中植入和移出
根据WO2012/010767中描述的方法制备包封腔室(即MAcro-encapsulationd’ILotsPANcréatiques[胰岛的大型包封])。将两个半透膜焊接在一起。这种包封腔室具有内部薄片，还有连接件。
麻醉
在任何麻醉前，术前用药是系统的，并且由肌内施用丁酰苯：2 mg/kg阿扎哌隆(Stresnil*)和10mg/kg氯胺酮(Imalgene*)的组合。
根据以下描述的方案进行全身麻醉：
-将术前用药的动物带至操作区，并置于操作台上侧躺。
-在一只耳朵的外周静脉中插入导管(G22)，通过使用0.9％NaCl 溶液冲洗确保其渗透性。
-通过静脉注射安眠药(5mg/kg硫喷妥钠或4mg/kg异丙酚)和 箭毒剂(curarisingagent)(0.1mg/kg泮库溴铵)进行诱导。然后立即 口腔气管插管(PortexBlueLine，低压气囊，对于重25至35kg的受 试者使用口径6)，并使用连接至在受控压力模式下操作的呼吸机的半 闭合循环系统进行肺通气。调节通气(FiO2＝0.5FiN2O＝0.5)，以维持 ETCO2在35至45mmHg之间。呼吸机是最新一代的人用设备(GE Avance*,Aisys*或Aespire*)，配备有当前流速、压力和体积控制。
-使用异氟烷(吸入分数(fractioninspired)＝2体积％)将麻醉 维持在吸入模式，使用2l/min的新鲜气体流速的50％/50％O2/N2O混 合物作为载气。
-如果必要，后续剂量的泮库溴铵的施用在覆盖深吸入麻醉下提 供了最佳的肌肉松弛(纯O2中异氟烷的MAC＝1.15体积％和N2O的 MAC＝110体积％)。
的植入
将动物麻醉后，使用70％的乙醇和优碘(betadine)使睡眠动物的 腹部无菌(注意不要引起低体温)，并使用手术刀刀片剃毛。在洁净区 域的中间作皮肤和肌肉平面至腹膜的约10至15厘米的纵向切口。在 中线剖腹手术后，在用生理盐水填充后，腹膜外植入原型(prototype)， 并使用缝线(Vicryl2/0)将其附着在腹壁上。将MAILPAN的两根导 管(在植入后的时间内，在MAILPAN中，一个用于填充胰岛，另一 个用于清空胰岛)连接至放置于皮下的两个注射腔室，然后使用4-0 缝合线通过蛇行运动作腹膜结扎。
在手术结束时，使用Naropein浸润伤口，在动物清醒前静脉施用 芬太尼。每次手术以2mg/kg的比例与摄食一起施用芬太尼颗粒。
的移出
在移植后15天至60天，在全身麻醉下移出MAILPAN装置，以 评价MAILPAN的机械强度、其无菌性及其生物相容性(表面的血管 化、无炎症、无纤维化和周围组织的炎症)。因此，在每次移出装置时 采集MAILPAN周围组织的样品用于随后的组织学检查。在每次移出 后，通过静脉注射KCl将猪处死。
在与对于大鼠相同的条件下采集组织样品(参见实施例5：对于组 织和膜使用相同的溶液，进行相同的分析)。
实施例8：通过扫描电子显微镜分析膜
在采样后，将膜在超纯水中冲洗，并在4℃，在稀释至2.5％的戊 二醛(Sigma，编号：G5882)中固定24至48h。然后，将经固定的膜 在超纯水中冲洗10分钟。
然后，使用连续的乙醇浴将样品脱水：在50％乙醇中两次10分钟 的浴，在70％乙醇中一次25分钟的浴，然后在95％乙醇中一次10分 钟的浴，最后在100％乙醇中两次10分钟的浴。为了完全去除样品中 可能仍然存在的痕量水，在六甲基二硅氮烷(HMDS)(Sigma，编号： 440191)中进行2分钟的孵育。
在空气中干燥后，然后使用碳导电粘合剂(DeltaMicroscopies，编 号：76510)，将样品平展粘接在支撑物(block)(DeltaMicroscopies,编 号:75220)上。
当粘合剂凝固时，通过沉积金-钯薄层，然后沉积碳薄层，将样品 金属化。
在5KV电压的场效应扫描电子显微镜(SEM)(HitachiS800)(斯 特拉斯堡神经化学中心体外成像平台(invitroimagingplatformofthe NeurochemistryCentreofStrasbourg))上进行观察，这使得能够获得良 好的分辨率而不破坏样品。
结果
观察到使用PC膜生产的装置显示出宽的撕裂(图4)。
另一方面，使用多层PET膜生产的装置就其本身而言没有显示出 任何宏观损伤。因此，通过扫描电子显微镜分析所述膜，其没有显示 显微裂纹(图4)。
因此，看来根据本发明的膜允许与现有技术的膜观察到的相似的 扩散，并且明显具有半透性的性质(阻断IgG和免疫系统的其他蛋白 质)。当在体内植入的生物人工器官中使用这些膜时，它们显示出更好 的耐受性。
已获得PET膜的体外抗张强度的进一步的数据。三层膜(两个多 孔PET膜围绕着无纺PET膜)的强度稍高于两层膜(一个多孔PET 膜层压在无纺PET膜上)的强度。两层膜的抗张强度高于单层多孔PET 膜的抗张强度。